■曲恒漫 文 媛 王佳榮 周巖民 溫 超

（南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇南京 210095）

甜菜堿是一種季銨型水溶性生物堿，化學名稱為三甲基甘氨酸。甜菜堿廣泛分布于動物、植物和微生物機體中，主要生理功能是提供活性甲基，為肉堿、肌酸、嘌呤及蛋氨酸等多種物質(zhì)的合成提供原料，參與氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝[1]。在飼料中添加甜菜堿具有促進動物生長、調(diào)節(jié)滲透壓、改善胴體組成、提高肉質(zhì)等作用，對水生動物具有誘食作用[2-5]。近年來的研究表明，甜菜堿對幾種人類臨床常見致病菌具有一定的抑菌作用[6-7]，但對動物體內(nèi)常見致病菌是否有抑菌效果尚未見報道。為此，本試驗以飼料中常用的無水甜菜堿及甜菜堿鹽酸鹽為試驗材料，以對仔豬危害較大的大腸桿菌K88為研究對象，分析兩種甜菜堿產(chǎn)品的體外抑菌活性，旨在為甜菜堿在飼料中的應用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽由宜興市天石飼料有限公司提供，純度分別為96%、97%。大腸桿菌K88購于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2 菌種的活化

將-20℃保存的大腸桿菌K88解凍后接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，再次接種到新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h進入對數(shù)期，備用[7]。

1.3 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

吸取1 ml培養(yǎng)到對數(shù)期的大腸桿菌K88菌液加入10 ml含無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽濃度均分別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 mg/ml的LB培養(yǎng)基中，同時設(shè)置只加菌液和只加無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽的對照管，37℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。取未見細菌生長的上清液100 μl涂布到瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后計數(shù)，觀察瓊脂平板菌落生長狀況，并根據(jù)試驗結(jié)果調(diào)整甜菜堿濃度，菌落個數(shù)少于5個的平板所對應的最小甜菜堿濃度為MIC，無細菌生長的平板所對應的最小甜菜堿濃度為最小殺菌濃度（MBC）。試驗重復3次[1]。

1.4 不同培養(yǎng)時間對無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽抑菌效果的影響

在10 ml高壓滅菌生理鹽水中加入一定質(zhì)量的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽配制成MIC或MBC的溶液，加入100 μl培養(yǎng)到對數(shù)生長期的細菌菌液，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，同時設(shè)置一個細菌的純培養(yǎng)作為空白對照。分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、4、8、16、24 h后取出，菌液梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液涂布于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后計數(shù)，計算抑菌率，繪制曲線圖。試驗重復3次。

1.5 不同濃度的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88抑菌效果的影響

在10 ml高壓滅菌生理鹽水中加入不同質(zhì)量的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽配制成 4、5、6、7、8、9、15 mg/ml的溶液，移取100 μl培養(yǎng)到對數(shù)生長期的細菌菌液加入其中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，同時設(shè)置一個細菌的純培養(yǎng)作為空白對照。培養(yǎng)24 h后取出，菌液梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液涂布于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后計數(shù)，計算抑菌率，繪制曲線圖。試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度（見表1）

表1 不同濃度無水甜菜堿及甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88的抑菌效果

如表1所示，當無水甜菜堿濃度提高到800 mg/ml時仍可見大量細菌生長，說明無水甜菜堿對大腸桿菌K88的抑菌效果不明顯。甜菜堿鹽酸鹽的最小抑菌濃 度 (MIC)為 6.25 mg/ml，最 小 殺 菌 濃 度(MBC)為8.125 mg/ml。

2.2 不同培養(yǎng)時間對甜菜堿鹽酸鹽抑菌效果的影響（見圖1）

如圖1所示，在甜菜堿鹽酸鹽濃度為6.25 mg/ml時，隨培養(yǎng)時間的延長，抑菌率逐漸增加，當抑菌時間達到16 h時，抑菌率超過50%，可見該濃度甜菜堿鹽酸鹽在16 h以后才會達到明顯的抑菌效果；在甜菜堿鹽酸鹽濃度為8.125 mg/ml時，抑菌率隨時間延長迅速提高，24 h后抑菌率達到90%，可見甜菜堿鹽酸鹽濃度達到8.125 mg/ml時具有抑菌和殺菌作用。

圖1 甜菜堿鹽酸鹽在不同培養(yǎng)時間對大腸桿菌K88的抑菌率

2.3 不同濃度甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88抑菌效果的影響（見圖2）

由圖2可以看出，隨著甜菜堿鹽酸鹽濃度增大，抑菌率逐漸增加，當濃度達到7 mg/ml時，抑菌率超過50%，達到抑菌效果，當濃度達到9 mg/ml時，抑菌率超過90%，達到殺菌效果。

圖2 不同濃度甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88的抑菌率

3 討論

近年來，部分文獻報道了甜菜堿的體外抑菌作用，如張愛君等[6]發(fā)現(xiàn)甜菜堿對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有明顯的抑制作用。黃忠民等[8]亦發(fā)現(xiàn)甜菜堿對金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用，并推測可能的抑菌機制是：甜菜堿作為一種帶正電荷的季銨鹽類化合物，容易吸附于帶負電荷的金黃色葡萄球菌表面并穿透其細胞壁，作用于細胞膜和酶體系，抑制其呼吸作用，進一步使細菌外膜裂解，新陳代謝被抑制而死亡。但上述文獻中均未說明所用甜菜堿劑型。為此，本試驗比較了無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽大腸桿菌K88的體外抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無水甜菜堿對大腸桿菌K88抑菌效果并不明顯，抑菌效果遠遠弱于甜菜堿鹽酸鹽，其原因可能為：無水甜菜堿呈中性，而甜菜堿鹽酸鹽呈強酸性，添加甜菜堿鹽酸鹽后使培養(yǎng)基pH值降低，從而使大腸桿菌K88細胞內(nèi)外的的蛋白質(zhì)變性，細胞膜和酶失去生物活性，生命活動無法進行而導致死亡。甜菜堿鹽酸鹽大腸桿菌K88的MIC為6.25 mg/ml，與張愛君等[6]的研究結(jié)果一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)，當甜菜堿鹽酸鹽濃度提高或培養(yǎng)時間延長時，抑菌率隨之提高，說明其抑菌效果呈劑量和時間依賴性。

4 結(jié)論

無水甜菜堿對大腸桿菌K88抑菌效果不明顯，而甜菜堿鹽酸鹽有一定抑菌作用，最小抑菌濃度為6.25 mg/ml，最小殺菌濃度為8.125 mg/ml。隨著甜菜堿鹽酸鹽濃度提高或培養(yǎng)時間延長，抑菌率提高。