蔡麗萍，孫燕雙，王 琳，陳 元，方 煜

(中國人民解放軍第82醫(yī)院特診科，江蘇 淮安 223001)

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橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺癌中的差異表達蛋白分析①

蔡麗萍，孫燕雙，王 琳，陳 元，方 煜

(中國人民解放軍第82醫(yī)院特診科，江蘇 淮安 223001)

目的：對橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺癌中的高表達差異蛋白進行分析，探索橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺癌的發(fā)病機理、為尋找特異性腫瘤標志物提供有力依據(jù)。方法：采用多肽體外標記技術(shù)(即比較蛋白質(zhì)組學的方法)，對橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織和甲狀腺濾泡性腺瘤以及橋本氏甲狀腺炎腺體組織的蛋白提取物進行iTRAQ分析，并與正常甲狀腺組織作為對照組。尋找四種組織中差異表達的蛋白質(zhì)，并將差異性明顯的蛋白進行數(shù)據(jù)檢索，明確這些差異性明顯的蛋白質(zhì)的生物學特性，并進行驗證。結(jié)果：通過對橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織、橋本甲狀腺炎組織、正常甲狀腺組織的四組蛋白提取物的分析比較，比較所得差異蛋白質(zhì)，進行重合分析，最后得出8種有較高差異的表達蛋白。分別是：K6PL_HUMAN，NUCB2_HUMAN，CNBP_HUMAN，UB2V2_HUMAN，RAB8A_HUMAN，APOA4_HUMAN，RPL13_HUMAN，TES_HUMAN。對iTRAQ結(jié)果進行western blotting驗證，得出以上八種蛋白的驗證結(jié)果，比較發(fā)現(xiàn)，RPL13在四種組織中表達差異最明顯。結(jié)論：通過蛋白比對發(fā)現(xiàn)，在橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生過程中有8種表達的蛋白有較高差異，而核糖體蛋白13(RPL13)在橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺乳頭狀癌組織中表達最明顯，可能為橋本氏甲狀腺炎背景下并發(fā)甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性較大的蛋白質(zhì)。

橋本氏甲狀腺炎； 乳頭狀甲狀腺癌； 濾泡性腺瘤

本研究旨在通過比較蛋白組學的方法尋找橋本氏甲狀腺炎背景下合并乳頭狀癌的較特異性蛋白，以利于橋本氏甲狀腺炎并發(fā)甲狀腺癌的早期診斷，并為開發(fā)靶向診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料和組織標本：收集患者手術(shù)切除的病理組織，凍存管封存，標記、冷凍，選取病理結(jié)果為橋本氏甲狀腺炎背景下的甲狀腺乳頭狀癌、濾泡性腺瘤及橋本氏甲狀腺炎組織及正常甲狀腺組織的凍存管各一管。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑及儀器設(shè)備BSA標準品、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PBS(pH7.4)、Amersham2-D Quant Kit(試劑盒)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES緩沖液)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、羅丹明標記山羊抗兔IgG、生物素、鏈親和素、N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯、兔單克隆抗體RPL-13、各型號試管、1.5mLEP管、臺式高速離心機、臺式高速冷凍離心機、旋渦混合器、可見光分光光度計、蛋白質(zhì)譜儀。

1.2.2 蛋白質(zhì)的抽提及質(zhì)譜

1.2.2.1 抽提方法：將組織剪切成細小碎片，每100mg組織加入1mL溶液A，1ul溶液B和5ul溶液C。用超聲波將細胞破碎，每次持續(xù)30s，共3～4次，每次破碎的間隔時間為1min，破碎后置于冰快上快速冷卻。4℃離心5min，取上清液。

1.2.2.2 酶解標記：所用試劑若非特殊標明，都是ITRAQ試劑盒(Applied Biosystem)，按照試劑盒操作方法嚴格操作，在室溫下反應1h之后各加入3倍體積水，使標記試劑完全分解。

1.2.2.3 質(zhì)譜鑒定：MS掃描范圍(m/z)350～1250，累積時間0.25s。MSMS掃描范圍(m/z)100～2000，掃描模式：HS高靈敏度模式，累積時間0.1s。IDA采集模式，一個MSI圖譜選擇20個最強的母離子進行串級掃描。

1.2.3 iTRAQ實驗數(shù)據(jù)：使用美國生物系統(tǒng)提供的ProteinPilot軟件(version4.0)，依據(jù)Paragon算法進行肽段、蛋白鑒定以及蛋白定量。對鑒定出的差異蛋白選擇Swiss-Prot人種屬數(shù)據(jù)庫(Release 2010_04，20331條序列)進行相關(guān)檢索，使用Pro Group算法自動選擇定量肽段來計算報告離子的峰強度，進行iTRAQ蛋白定量。

1.2.4 western blotting驗證：對提取的差異蛋白進行驗證。每組驗證的例數(shù)均為3例。

2 結(jié) 果

2.1 通過這四組間的兩兩對比分析，比較四組組織所得出的差異蛋白質(zhì)，進行重合分析，最后得出了有8種有較高差異的差異表達蛋白。分別是：K6PL_HUMAN，NUCB2_HUMAN，CNBP_HUMAN，UB2V2_HUMAN，RAB8A_HUMAN，APOA4_HUMAN，RL13_HUMAN，TES_HUMAN。ttest p是兩組間組織蛋白質(zhì)檢測峰值進行t檢驗的p值，小于0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義；ratio表示各組組織蛋白質(zhì)表達的比例，小于1表示低表達，大于1表示高表達。見表1。

表1 iTRAQ定量分析四種組織的蛋白質(zhì)的兩兩比較結(jié)果

2.2 通過對iTRAQ結(jié)果的western blotting驗證，得出以上八種蛋白的驗證結(jié)果，后比較發(fā)現(xiàn)RPL13在癌組織、良性腺瘤組織及正常組織中差異最明顯。預測蛋白大?。篈CTIN為42KD； RPL13為24KD。見圖1、圖2。

2.3 根據(jù)圖片結(jié)果，我們采用灰度掃描的方法，確定每個樣本的相對表達量，見表2。

表2 灰度掃描結(jié)果

圖1 原始圖片

圖2 灰度圖片

2.4 在Western blot實驗中，甲狀腺乳頭狀癌組織中RPL13蛋白表達大于濾泡性腺瘤組織，高于橋本組織及正常對照組織。見圖3。

圖3 RPL13灰度結(jié)果柱狀圖

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)有橋本氏甲狀腺炎的患者合并發(fā)生甲狀腺癌的幾率為正常人群的3倍。由于橋本氏甲狀腺炎合并甲狀腺結(jié)節(jié)大多呈多發(fā)，且病理分型具有多源性的特點，使得超聲對部分良惡性結(jié)節(jié)的鑒別尚有不足之處[1]。盡管許多研究人員一直致力于探索早期正確診斷惡性腫瘤最有效的手段，雖然BRAF基因檢測為甲狀腺癌的診斷提供了有價值的參考，但必須進行細針穿刺細胞學檢查[2]。又由于惡性腫瘤的發(fā)生涉及到多個基因，而當基因發(fā)生突變或者出現(xiàn)調(diào)控異常情況時，細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)的一系列形狀及構(gòu)型均會有相應的變化[3]，從理論上講通過觀察蛋白質(zhì)的系列動態(tài)變化應可以了解腫瘤在機體內(nèi)引起的相應改變，從而應能篩選出可用于惡性腫瘤早期診斷的指標。本研究采用iTRAQ技術(shù)的方法，因其在提供蛋白質(zhì)動態(tài)信息方面具有獨特的能力和優(yōu)越性，為腫瘤特異性標記物的檢測提供了新的技術(shù)平臺和思路。而iTRAQ技術(shù)是比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)方法，是一種多肽體外標記技術(shù)。通過比較蛋白質(zhì)在不同生理病理過程中種類和數(shù)量等的不同變化，能尋找疾病發(fā)生過程中比較特異的蛋白質(zhì)標記物。它與傳統(tǒng)的大通量分析方法如二維電泳等相比，具有效率高，準確率高的優(yōu)點，用于比較腫瘤與橋本氏甲狀腺炎腺體等組織之間蛋白表達的差異，能夠增加實驗結(jié)果的準確性。本研究目的是比較橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺乳頭狀癌與橋本氏甲狀腺炎組織、濾泡性腺瘤及正常腺體組織各組之間差異表達的蛋白質(zhì)，希望能尋找到橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺乳頭狀癌的較特異表達蛋白，并驗證其能否作為橋本氏甲狀腺炎背景下甲狀腺癌的較特異的腫瘤標記物。

本研究對四組不同組織的蛋白提取物進行iTRAQ分析，iTRAQ質(zhì)譜結(jié)果的蛋白質(zhì)鑒定和定量分析采用美國應用生物系統(tǒng)公司提供的ProteinPilot軟件(Version4.0)，依據(jù)Paragon算法進行相關(guān)肽段以及蛋白鑒定，并依據(jù)可變剪接進行蛋白定量。為了減少假陽性比例，我們采用ProtScoreg1.3來制定蛋白質(zhì)鑒定的最低標準：每個鑒定到的蛋白質(zhì)必須符合95%的置信區(qū)間，而且只有同一個蛋白質(zhì)同時檢測到5個95%的置信區(qū)間符合的多肽片段才進行定量。另外，在結(jié)果數(shù)據(jù)中，軟件會自動校正因混樣不均勻所帶來的誤差。在iTRAQ的定量中，軟件根據(jù)Pro Group計算方法自動選擇符合標準的多肽片段進行定量，并計算得到報告峰值，通過t檢驗，計算p值確定各組間是否有統(tǒng)計學差異，同時通過峰值比例確定表達差異倍數(shù)。通過對橋本氏甲狀腺炎背景下的甲狀腺乳頭狀癌組織的蛋白提取物進行iTRAQ分析，并與濾泡性腺瘤及橋本氏甲狀腺組織及正常甲狀腺組織作對比。尋找四種組織中差異表達的蛋白，得出了8種有較高差異的表達蛋白，并將這8種差異蛋白的鑒定結(jié)果輸入Swiss-port蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，明確各蛋白功能。通過這種技術(shù)路線，尋找出甲狀腺乳頭狀癌與其它組之間的差異表達蛋白質(zhì)，經(jīng)Western blot 技術(shù)進行驗證后的結(jié)果分析表明RPL13蛋白在甲狀腺癌組織組中的差異表達程度最高。

經(jīng)蛋白功能檢索能夠發(fā)現(xiàn)，RPL13蛋白是一種核糖體蛋白，是核糖體的主要組成成分，它能夠促進核糖核酸的折疊，能夠使核糖體處于了有利于執(zhí)行翻譯功能的構(gòu)想狀態(tài)，從而提高了蛋白質(zhì)合成的準確性。它參與了細胞增殖、分化和凋亡，以及基因的復制、轉(zhuǎn)錄和機體發(fā)育的調(diào)控等功能，同時越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)RPL13蛋白與正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[4]，而據(jù)文獻報道目前核糖體蛋白在胃腸道腫瘤研究中初露端倪，相信隨著人們對核糖體蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用的研究，RPL13蛋白可望作為協(xié)助診斷橋本氏甲狀腺炎合并甲狀腺癌、判斷預后和療效評價的一個重要指標，為后續(xù)作為甲狀腺乳頭狀癌診斷及治療的靶標提供前期重要的實驗依據(jù)。

[1] 王建紅，王正濱，房世寶,等.橋本甲狀腺炎合并甲狀腺乳頭狀癌的超聲診斷價值[J].中國超聲醫(yī)學雜志，2010(11)，988～991.

[2] Koperek O，Komauth C，Capper D. Immunohistochemical Detection of the BRAF V600E-mutated Protein in Papillary[J].Thyroid Carcinoma American Journal Of Surgical Pathology，2012，36(10)：1578～1581.

[3] 曲利娟，丁彥青.蛋白質(zhì)組學技術(shù)及其在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白篩選中的應用[J].實用癌癥雜志,2005;20(5):547～551.

[4] 王輝，劉偉利.核糖體蛋白基因表達與腫瘤的關(guān)系[J].生理科學進展,2007,38(4):376～379.

Analysis on Differential Expression Protein in Hashimoto’s Thyroiditis Complicated with Thyroid Cancer

CAILiping,SUNYanshuang,WANGLin,etal

(SpecialCareClinicinNo.82HospitalofLiberationArmy,JiangsuHuaian223001,China)

Objective: 【Abstract】Objective：To analyze the high expression differential protein in Hashioto’s thyroiditis complicated with thyroid cancer and explore the pathogenesis and provide basis for searching specific tumor marker. Method：Applying vitro labeling technique(method of comparative proteomics), protein extracts on Hashimoto's thyroiditis background patients with papillary thyroid carcinoma and follicular thyroid adenoma and Hashimoto's thyroiditis gland tissue was analyzed by iTRAQ. And the normal thyroid tissue were selected as the control group. The differential expression protein in four tissues were to be seeked. And the differential apparent protein were done with data retrieval. The biological characteristics of the differential apparent protein were identified and verified. Result：Through the analysis of four groups of protein extracts on Hashimoto's thyroiditis background of thyroid cancer, thyroid adenoma, Hashimoto's thyroiditis tissues and normal thyroid tissue comparison, and the protein extracts of thyroid cancer tissue obtained by the comparative analysis were coincided and analyzed. This paper achieved the differential protein and performs the superposition analysis, and finally got 8 kinds of differential expression protein with relatively high difference: K6PL_HUMAN, NUCB2_HUMAN, CNBP_HUMAN, UB2V2_HUMAN, RAB8A_HUMAN, APOA4_HUMAN, RPL13_HUMAN and TES_HUMAN. Through verifying the Western Blotting of iTRAQ result, it achieved the verification results of the above 8 kinds of proteins. Through the comparison, it turned out that RPL13 showed the most obvious expression difference among four tissues. Conclusion: Through the comparison on the protein, it showed that the protein with 8 kinds of expressions had relatively high difference during the occurrence of Hashioto’s thyroiditis complicated with papillary carcinoma. However, the ribosomal protein 13 (RPL13) showed the most obvious expression in Hashioto’s thyroiditis complicated with papillary thyroid carcinoma, which may be the protein greatly related to the occurrence and development of Hashioto’s thyroiditis complicated with thyroid cancer.

Hashioto’s thyroiditis; Papillary thyroid carcinoma; Follicular adenoma

① 【基金項目】江蘇省淮安市科技計劃項目，(編號：HAS2013013)

1006-6233(2016)12-1973-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.12.015