張 鵬，陳 靜，萬夢琪，姜 艷，徐思穎，羅滿生

(1. 井岡山大學醫(yī)學部 病原生物與免疫學教研室，江西 吉安 343009；2. 萬載縣人民醫(yī)院 檢驗科，江西 宜春 336100)

他莫昔芬對D-氨基半乳糖/脂多糖誘導小鼠急性肝衰竭的治療研究

張 鵬1，陳 靜2，萬夢琪1，姜 艷1，徐思穎1，羅滿生1

(1. 井岡山大學醫(yī)學部 病原生物與免疫學教研室，江西 吉安 343009；2. 萬載縣人民醫(yī)院 檢驗科，江西 宜春 336100)

目的 觀察他莫昔芬對D-氨基半乳糖/脂多糖誘導小鼠急性肝衰竭的影響。方法 80只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、他莫昔芬(TAM)組、他莫昔芬+雌激素受體拮抗劑(TAM+ICI)干預組。除正常對照組外其它3組分別經(jīng)腹腔注射向日葵油、他莫昔芬、他莫昔芬+拮抗劑進行造模前預處理，連續(xù)3 d，每天1次；第3次注射后12 h，腹腔注射D-氨基半乳糖及脂多糖造模。分別于造模后2 h和5 h采集外周血；5 h采集肝臟；造模后24 h觀察各組實驗小鼠生存率。酶法測定血清ALT、AST；ELISA法檢測血清TNFα、IL-1β；肝組織病理學分析采用HE及TUNEL法；Western blot測定肝臟Caspase-3。結(jié)果 生存率4組間兩兩比較，差異均有顯著性意義(P=0.000)。TAM組和TAM+ICI組小鼠血清ALT、AST、TNFα和IL-1β低于模型組，差異均有顯著性意義(P<0.05)，TAM組和TAM+ICI組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。與正常對照組相比，TAM組小鼠肝臟大體無明顯變化，TAM+ICI組肝臟外觀略呈腫脹，而模型組小鼠肝臟則呈現(xiàn)明顯腫脹、出血壞死表現(xiàn)；鏡下TAM組及TAM+ICI組表現(xiàn)輕微的單個核細胞浸潤、肝小葉結(jié)構(gòu)毀壞，而模型組小鼠表現(xiàn)明顯。TUNEL結(jié)果顯示，與正常對照組相比，TAM組及TAM+ICI組見少量凋亡小體，而模型組肝細胞皺縮明顯，多見凋亡小體。Western blot結(jié)果顯示，正常對照組、TAM組及TAM+ICI組均未見Caspase-3的p17片段，而模型組顯著增多。結(jié)論 他莫昔芬可能通過抗凋亡機制拮抗D-氨基半乳糖/脂多糖-誘導的小鼠急性肝衰竭。

他莫昔芬；急性肝衰竭；脂多糖；細胞凋亡

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是臨床常見綜合癥，誘因多，致死性高。目前，除傳統(tǒng)支持療法及肝移植外尚無理想辦法。D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，GaIN)/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠急性肝衰竭廣泛用于探討臨床ALF致病機制及相關(guān)治療藥物篩查。有研究報道他莫昔芬(TAM)能有效拮抗細菌細胞膜成分LPS誘發(fā)的內(nèi)毒素休克[1]，而有關(guān)其對GaIN/LPS誘導的小鼠急性肝衰竭的影響尚未報道。本研究通過檢測TAM對實驗小鼠生存率、血清轉(zhuǎn)氨酶活性，組織損傷等方面的影響來觀察該藥物對此模型的作用，并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)(T5648)、GaIN(G0500)、LPS(L2630)購自Sigma 公司(USA)；雌激素受體拮抗劑ICI182780 (ICI))購自TOCRIS Bioscience (Ellisville, USA)；ALT、AST、TUNEL檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司(南京 中國)；兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體購自CST公司(USA)，鼠源抗鼠β-actin多克隆抗體及HRP標記山羊抗兔、山羊抗鼠二抗均購自中杉金橋生物技術(shù)公司(北京 中國)。

1.2 實驗動物

昆明系小鼠80只，SPF級，雌性，體重(20±2) g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證SYXK(贛)2012-0001。

1.3 儀 器

高速低溫離心機(艾本德，5804R)，酶標儀(THERMO，MULTISCAN GO)，顯微鏡(奧林巴斯，IX71+DP72)，超低溫冰箱 (Thermo 700Series)。

1.4 分 組

采用隨機分組法將實驗小鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組、他莫昔芬(TAM)組、他莫昔芬+拮抗劑(TAM+ICI)組，每組20只。除正常對照組外各組分別腹腔注射向日葵油、他莫昔芬(2 mg/kg)、他莫昔芬+ICI(4.6 mg/kg)進行造模前預處理，連續(xù)3 d，每天1次；最后1次注射后，禁食12 h，腹腔注射GaIN(800 mg/kg)及脂多糖(1 μg/只)造模。分別于造模后2 h采集外周血(n=5)，迅速分離血清，置-20 ℃凍存；5 h采集外周血及肝組織(n=5)，分裝后放-80 ℃保存?zhèn)溆茫辉炷：?4 h觀察各組小鼠生存率(n=10)。

1.5 指標檢測

觀察各組實驗動物24 h生存率，酶法測定2 h及5 h血清 ALT、AST 活性，ELISA法檢測血清TNFα、IL-1β水平，HE、TUNEL法分析肝組織病理學變化，肝組織勻漿BCA蛋白定量后利用Western blot檢測Caspase-3活化情況。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)分析由 SPSS13.0 軟件完成， 各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義；生存分析采用Kaplan-Meier法。

2 結(jié) 果

2.1 TAM對ALF小鼠24 h生存率的影響

正常對照組生存率(100%)，TAM組、TAM+ICI組造模后24 h生存率分別為75.0%和62.5%，模型組生存率為25.0%，4組間生存率比較，差異均有顯著性意義(P=0.000)。見圖1。

圖1 藥物處理后各組ALF小鼠生存率變化Fig 1 Time course of survival of ALF mice after treatments

2.2 TAM處理對ALF小鼠血清ALT、AST活性的影響

TAM、TAM+ICI組小鼠血清ALT分別為80.1 U/L和89.6 U/L、AST分別為84.7 U/L、106.3 U/L。與模型組(235.6、218.1U/L)比較，差異有顯著性意義(P均<0.05)；而TAM組與TAM+ICI組之間比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 TAM預處理對實驗動物血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響Fig 2 Effects of TAM pretreatment on serum ALT, AST*與模型組比較，P<0.05

2.3 TAM處理對ALF小鼠血清炎癥因子的影響

ELISA檢測TAM組血清TNFα、IL-1β分別為120.6 pg/mL和148.5 pg/mL、TAM+ICI組分別為156.8 pg/mL、304.7 pg/mL, 與模型組(423.3 pg/mL、617.5 pg/mL)比較，差異具有顯著性意義(P=0.000)；兩個藥物處理組血清TNFα、IL-1β組間差異不顯著(P=0.286及P=0.419)。見圖3。

2.4 TAM處理對ALF小鼠肝臟腫脹及組織病理學的影響

與正常對照組相比，TAM組小鼠肝臟大體無明顯變化，TAM+ICI組肝臟外觀略呈腫脹，而模型組小鼠肝臟則呈現(xiàn)明顯腫脹、出血壞死表現(xiàn)。鏡下TAM組及TAM+ICI組表現(xiàn)輕微的單個核細胞浸潤、肝小葉結(jié)構(gòu)毀壞，而模型組小鼠表現(xiàn)明顯。見圖4。

2.5 TAM處理對ALF小鼠肝臟細胞凋亡的影響

TUNEL結(jié)果顯示，與正常組相比，TAM組及TAM+ICI組見少量凋亡小體，而模型組動物肝細胞皺縮明顯，多見凋亡小體。Western blot結(jié)果，正常組、TAM組及TAM+ICI組未見Caspase-3的p17片段，而模型組顯著增多。見圖 5。

圖3 TAM預處理對各組實驗小鼠血清TNFα、IL-1β的影響Fig 3 Effects of TAM on serum TNFα and IL-1β of ALF miceA:TNFα; B: IL-1β；*與模型組比較，P<0.05

3 討 論

急性肝衰竭(ALF)是一種可由多種因素引發(fā)的嚴重的臨床綜合癥，如細菌病毒感染、肝毒性藥物、缺血再灌注等。治療方面，目前除保守支持治療及后期肝移植外別無他法，因此，探索有效治療藥物對于臨床ALF治療具有重要意義。

由于與臨床ALF相似[2]，GaIN/LPS誘導的小鼠ALF常用于抗急性肝損傷藥物研究[3-4]。此模型中，LPS通過肝臟巨噬細胞(kupffer細胞)表面Toll 樣受體-4(TLR4)激活kupffer細胞，導致大量炎癥因子表達、分泌，其中主要有TNFα、IL-1β，尤其前者[5]。TNFα是一種多能性細胞因子，介導其活性發(fā)揮的受體主要是TNFR-1。通常情況下，TNFα通過活化胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)而發(fā)揮促細胞生存、增殖作用；然而當肝細胞生物合成作用因一些轉(zhuǎn)錄、翻譯抑制劑作用而被阻斷時，TNFα則可能經(jīng)Caspase依賴性或非依賴性途徑誘發(fā)肝細胞凋亡，進而導致急性肝損傷或衰竭[6]。因此，抗TNFα已逐漸成為ALF治療臨床前研究中常用對策[7]。另一方面，細胞凋亡也被一致認為是抗ALF的潛在靶點，這在近年來的一些研究中已被證實。

圖4 各組實驗動物肝臟腫脹及病理學變化Fig 4 Liver swell and pathohistological variations after TAM treatmentA：預先給藥、造模后5 h，處死部分實驗動物，暴露觀察肝臟腫脹情況；B：肝臟組織切片HE染色(× 400)。 a：正常對照組；b：模型組；c：TAM 組；d：TAM+ICI 組

圖5 藥物處理對GalN/LPS誘導的ALF小鼠肝細胞凋亡的影響Fig 5 Effects of TAM on GalN/LPS-induced hepatocellular apoptosisA：TUNEL(×400)；B：Western blot。a：正常對照組； b：模型組； c：TAM組；d：TAM+ICI組

TAM是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，其作用具有組織選擇性。有研究顯示，TAM能經(jīng)肝細胞表面雌激素受體α(ERα)并發(fā)揮ERα激動劑樣作用[8]。Miyashita T等[9]發(fā)現(xiàn)TAM能有效治療非酒精性脂肪肝(NASH)。另一研究中Sener G等[1]發(fā)現(xiàn)雌激素顯著減輕LPS誘發(fā)的肝臟及小腸內(nèi)毒素性損傷 。在本研究中，經(jīng)3次連續(xù)TAM預處理，GaIN/LPS誘發(fā)的小鼠ALF顯著減輕或緩解，具體表現(xiàn)在生存率、血清轉(zhuǎn)氨酶活性、肝組織損傷。而且，血清炎癥因子水平也是反映該模型嚴重程度的重要指標。結(jié)果表明，TAM顯著抑制ALF小鼠體內(nèi)TNFα、IL-1β分泌，因此有效起到ALF拮抗作用。另外，由于TNFα誘導的肝細胞凋亡在此模型中扮演關(guān)鍵角色[10]，因此本實驗還利用TUNEL和Caspase-3 蛋白印跡法探討了TAM對肝細胞凋亡的影響。與上述結(jié)果一致，無論是凋亡細胞數(shù)還是Caspase-3活化，模型組凋亡明顯比TAM處理組嚴重。由此提示TAM預處理可有效抑制或減弱該模型肝細胞凋亡作用，從而發(fā)揮ALF拮抗作用，但其具體機制尚待深入研究。值得注意，本實驗中部分結(jié)果表明ERα拮抗劑ICI未能充分封閉、阻斷TAM的ALF拮抗作用，原因可能有：(1)ICI使用劑量不夠；(2)TAM可能不是通過肝細胞ERα發(fā)揮作用，或另有其它靶點[11]。

簡言之，本研究發(fā)現(xiàn)GaIN/LPS誘導的小鼠ALF可因TAM預處理而得到有效遏制，其機制可能與TAM抗肝細胞凋亡、抑制肝臟炎癥因子產(chǎn)生有關(guān)，為將來深入探討TAM抗ALF作用奠定了一定基礎(chǔ)。

(致謝：本實驗主要在井岡山大學醫(yī)學部重點實驗室完成。)

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Therapeutical effects of tamoxifen on ALF induced by D-Galactosamine/lipopolysaccharide on mice

ZHANG Peng1, CHEN Jing2, WAN Meng-qi1, JIANG Yan1, XU Si-ying1, LUO Man-sheng1

( 1.DepartmentofPathogenic-BiologyandImmunology,MedicalSchoolofJinggangshanUniversity,Ji'an343009,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ThePeople'sHospitalofWanzaiCountry,Yichun336100,China)

Objective To observe the influence of tamoxifen (TAM) on mice acute liver failure induced by D-Galactosamine/lipopolysaccharide. Methods Eighty mice were divided into normal control, model, TAM, and TAM plus estrogen receptor antagonist (TAM+ICI) treatments randomly, respectively. Except normal control, others were pretreated with sunflower oil, TAM, TAM+ICI, respectively, once a day for three times consecutively. Mice were given GaIN/LPS (i.p) 12 h after the last treatment. Peripheral blood was collected at 2 h and 5 h post model construction and liver sections were sampled at 5 h. Mice survival was observed 24 h after model establishment. The plasma aminotransferases and cytokines were determined by use of colorimetric method, ELISA, respectively. Hepatic histopathological variation was analysed by HE and TUNEL. Western blotting was used to detect hepatic Caspase-3. Results Comparisons among these four groups had statistical difference (P=0.000); Serum ALT, AST, TNFα and IL-1β of TAM and TAM+ICI group decreased significantly compared with model group (P<0.05) but the differences for these indexes displayed no statistical significance between the former two groups (P>0.05). Relative to normal mice TAM treated mice showed no apparent change but slight swell in TAM+ICI group; Remarkable liver swell and hemorrhage were observed in model mice. TAM and TAM+ICI treated mice demonstrated mild mononuclear cell infiltration, liver lobular destruction in contrast to model mice. In TUNEL, TAM and TAM+ICI treated groups demonstrated a few apoptotic bodies compared to normal group, but improved more relative to model group. Caspase-3 p17 fragment increased significantly in model mice while it wasn't detected in other groups. Conclusion TAM might attenuate GaIN/LPS-induced ALF effectively via its hepatic apoptosis antagonism.

Tamoxifen; acute liver failure; lipopolysaccharide; cellular apoptosis

國家自然科學基金項目(81460555);江西省教育廳科技計劃項目(GJJ14551)

張 鵬(1994-)，男，廣東佛山人，在讀本科生。E-mail：609436442@qq.com

羅滿生, 講師。E-mail：luomansheng@163.com

?? 著

10.11724/jdmu.2016.06.03

R392.5

A

1671-7295(2016)06-0533-05

張鵬，陳靜，萬夢琪，等.他莫昔芬對D-氨基半乳糖/脂多糖誘導小鼠急性肝衰竭的治療研究[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(6)：533-537.

2016-09-13;

2016-11-05)