魯 軍, 矯 建, 牛玉娟
(大連市藥品檢驗(yàn)所,遼寧 大連 116021)
論 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.07
反相HPLC法對(duì)奈達(dá)鉑原料及其制劑的含量和有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定
魯 軍, 矯 建, 牛玉娟
(大連市藥品檢驗(yàn)所,遼寧 大連 116021)
目的 探討反相HPLC法測(cè)定奈達(dá)鉑和注射用奈達(dá)鉑的含量和有關(guān)物質(zhì)的可行性。方法 反相HPLC法檢測(cè)5批奈達(dá)鉑,3個(gè)規(guī)格7批注射用奈達(dá)鉑的專屬性與耐受性、線性關(guān)系、檢出限、定量限、重復(fù)性與穩(wěn)定性以及樣品含量和有關(guān)物質(zhì)。色譜條件:特定品牌C18柱;流動(dòng)相為辛烷磺酸鈉溶液-乙腈,流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。結(jié)果 奈達(dá)鉑濃度為0.025~4.00 mg/mL濃度范圍內(nèi),與峰面積線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r=0.9998), 檢出限為0.05036 μg/mL,定量限為0.1259 μg/mL。結(jié)論 反相HPLC法方法簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,適用于對(duì)奈達(dá)鉑和注射用奈達(dá)鉑的質(zhì)量控制。
反相HPLC法;奈達(dá)鉑和注射用奈達(dá)鉑;含量測(cè)定
奈達(dá)鉑(Nedaplatin),又名順式-乙醇酸-二氨合鉑,分子式:C2H8N2O3Pt,分子量:303.18,是日本鹽野義制藥公司在20世紀(jì)80年代中期合成的第二代鉑類抗腫瘤藥物[1],1995年6月在日本首次獲準(zhǔn)上市,作用機(jī)制與順鉑相同,與腫瘤細(xì)胞的DNA堿基結(jié)合,阻礙DNA復(fù)制而發(fā)揮其抗腫瘤效果[2],臨床用于治療頭頸部腫瘤、肺癌、食道癌、宮頸癌等[3-6]。由于順鉑有較為嚴(yán)重的腎毒性和胃腸道不良反應(yīng),因此在順鉑上市后的30年中,醫(yī)學(xué)界一直在尋找比母體化合物順鉑更加高效低毒的新化合物,奈達(dá)鉑作為新一代鉑類制劑,其療效與順鉑相當(dāng)或更優(yōu),具有治療指數(shù)高,腎毒性和胃腸道反應(yīng)較低,使用方便,不需水化等優(yōu)點(diǎn)[7]。奈達(dá)鉑和注射用奈達(dá)鉑現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)有4個(gè)(國(guó)家藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)YBH20202005,YBH13822004,YBH06312005,YBH08642008),均為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn),4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中采用不同的HPLC法測(cè)定含量和有關(guān)物質(zhì),但這四個(gè)方法的專屬性和適用性均不理想。本研究經(jīng)過(guò)試驗(yàn),重新確定色譜條件,滿足了方法的專屬性和適用性的要求,新方法重現(xiàn)性好,結(jié)果滿意。
1.1 材 料
Waters 2695 HPLC儀,Waters 2996 DAD檢測(cè)器,十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(資生堂CAPCELL PAK C18 SG120 5 μm 4.6 mm×250 mm,CAPCELL PAK C18 MGⅡ 5 μm 4.6 mm×250 mm 或CAPCELL PAK C18 MGⅢ 5 μm 4.6 mm×250 mm)。辛烷磺酸鈉、磷酸為分析純,乙腈為色譜純;奈達(dá)鉑對(duì)照品(批號(hào):100787-201502)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。奈達(dá)鉑5批(批號(hào):20150701;20150801;20150802;01-150506;01-150507),注射用奈達(dá)鉑3個(gè)規(guī)格7批(10 mg批號(hào):20150405;20151202;11-150101;20 mg批號(hào):20151201;20150203;50 mg批號(hào):20150901;20150604),均由生產(chǎn)企業(yè)提供。
1.2 反相HPLC法色譜條件
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(資生堂CAPCELL PAK C18 SG120 5 μm 4.6 mm×250 mm,CAPCELL PAK C18 MGⅡ 5 μm 4.6 mm×250 mm 或CAPCELL PAK C18 MGⅢ 5 μm 4.6 mm×250 mm);以辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉0.856 g加水適量溶解,加磷酸0.5 mL用水稀釋至1000 mL)-乙腈(91∶9)為流動(dòng)相,流速為每分鐘1.0 mL,柱溫40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。
1.3 反相HPLC法的方法學(xué)考察
1.3.1 專屬性與耐用性考察
取奈達(dá)鉑對(duì)照品10 mg,置5 mL容量瓶中,加過(guò)氧化氫溶液(1→100)0.1 mL,加水稀釋至刻度,搖勻,放置10 min后,分別取20 μL注入3根不同的色譜柱中進(jìn)行測(cè)定,色譜柱分別為CAPCELL PAK C18 SG120,CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ,CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ。再將上述溶液配成80%,100%,120%3個(gè)濃度,分別取20 μL注入上述3根不同的色譜柱進(jìn)行測(cè)定回收率。
1.3.2 線性關(guān)系的考察
精密稱取奈達(dá)鉑對(duì)照品約100 mg置25 mL量瓶中,加水適量溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液1,再精密量取對(duì)照品溶液1 12.5 mL、3.0 mL、1.2 mL、0.3 mL,分別置于50 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液2~5,量取對(duì)照品溶液1~5各10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以峰面積(Y)與對(duì)照品濃度(X, mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。
1.3.3 檢出限
精密稱取奈達(dá)鉑對(duì)照品10.11 mg,置100 mL量瓶中,加水適量溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置200 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液2 mL,置100 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,配成檢測(cè)限濃度樣品溶液,取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
1.3.4 定量限
精密量取檢測(cè)限項(xiàng)下的儲(chǔ)備液5 mL置100 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,配成定量限濃度樣品溶液,取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
1.3.5 回收率試驗(yàn)
注射用奈達(dá)鉑按企業(yè)提供的處方比例分別制備含奈達(dá)鉑為法定處方量80%、100%和120%的樣品,每個(gè)濃度的溶液配制3份。取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,分別計(jì)算回收率。
1.3.6 重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密稱取批號(hào)為 20150701的奈達(dá)鉑20.44、20.31、21.51、20.16、20.89、19.50 mg,分別置10 mL量瓶中,加水適量溶解并稀釋至刻度,搖勻,取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定。再取第一個(gè)供試品溶液,經(jīng)2、4、6和24 h后分別取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定。
1.4 樣品含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定
奈達(dá)鉑:取供試品約100 mg,精密稱定,置50 mL量瓶中,加水適量使溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密量取10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法計(jì)算奈達(dá)鉑的有關(guān)物質(zhì)和含量。
注射用奈達(dá)鉑:取供試品10支的內(nèi)容物,混勻,精密稱取適量,加水溶解并稀釋制成每1 mL中含2 mg的溶液,精密量取10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成份峰保留時(shí)間的4.5倍,并以水為空白進(jìn)行校正,按外標(biāo)法計(jì)算奈達(dá)鉑的有關(guān)物質(zhì)和含量。
2.1 反相HPLC法的方法學(xué)考察
2.1.1 專屬性與耐用性考察
圖1中各圖為同一瓶溶液在3根色譜柱上的專屬性分離圖譜,表1為耐用性測(cè)定結(jié)果。在此條件下,用DAD檢測(cè)器分析主峰奈達(dá)鉑的峰純度,為單一物質(zhì)。
圖1 專屬性圖譜Fig 1 Specificity spectrumA:CAPCELL PAK C18 SG120;B: CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ;C:CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ
表1 耐用性測(cè)定結(jié)果(回收率)
2.1.2 線性關(guān)系的考察
回歸方程為: Y=1E+07X+2.339×105,r=0.9998;奈達(dá)鉑濃度在0.025~4.00 mg/mL范圍內(nèi),與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。
2.1.3 檢出限
按S/N為3∶1計(jì)算,檢出限為0.05036 μg/mL(約為有關(guān)物質(zhì)限度值的0.2%)。
2.1.4 定量限
按S/N為10∶1計(jì)算,定量限為0.1259 μg/mL。
2.1.5 回收率試驗(yàn)
平均回收率為100.6%(RSD=0.15%,n=9)。
2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)
6份供試品測(cè)得的含量的RSD為0.90%;不同時(shí)間段的供試品溶液測(cè)定的峰面積的RSD為0.62%。
2.2 樣品含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定
奈達(dá)鉑: 5批樣品測(cè)定的含量分別為標(biāo)示量的99.9%,100.7%,99.3%,98.6%,100.1%;其有關(guān)物質(zhì)的含量分別為0.2%,0.1%,0.1%,0.2%,0.8%。
注射用奈達(dá)鉑:7樣品測(cè)定的含量分別為標(biāo)示量的100.1%,98.8%,98.9%,103.7%,100.8%,97.0%,100.0%;有關(guān)物質(zhì)的含量分別為0.1%,0.1%,0.6%,0.2%,0.2%,0.2%,0.2%。
3.1 色譜柱
在藥物分析中高效液相色譜法用得非常普遍,而色譜柱的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果與藥物的質(zhì)量控制。不同C18色譜柱的保留行為千差萬(wàn)別,選擇適宜的色譜柱對(duì)分析樣品至關(guān)重要[8]。在方法驗(yàn)證中,曾使用其它幾個(gè)品牌和類型的C18色譜柱,但主峰前沿或拖尾比較嚴(yán)重,與相鄰雜質(zhì)峰無(wú)法實(shí)現(xiàn)較好分離,就此問(wèn)題與企業(yè)也進(jìn)行過(guò)溝通,企業(yè)也認(rèn)為在他們以往的標(biāo)準(zhǔn)中,奈達(dá)鉑對(duì)色譜柱要求較高,這也是困擾他們的一大問(wèn)題。本研究在方法建立過(guò)程中,針對(duì)主成分和各相關(guān)雜質(zhì)極性較大,易與未鍵合的硅羥基作用而拖尾的特點(diǎn),選擇了具有獨(dú)特包膜技術(shù)的資生堂色譜柱,分別使用3種型號(hào)色譜柱,均能較好地重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,而其它品牌的色譜柱則不適用。
3.2 溫 度
對(duì)于高效液相色譜而言,溫度是一個(gè)一直被忽視而又非常重要的因素。升高色譜分析的柱溫,不僅可以加快分析速度,而且還可以提高分離效率、改善峰形、調(diào)節(jié)選擇性、減少有機(jī)溶劑的使用,是一個(gè)非常有效而又十分經(jīng)濟(jì)適用的方法,與其它調(diào)節(jié)分離效果的方法相比,具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[9]。本試驗(yàn)中溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大,當(dāng)溫度低于35 ℃時(shí),奈達(dá)鉑主峰會(huì)分裂出一個(gè)肩峰,因此,檢測(cè)時(shí),色譜柱的溫度不能低于40 ℃;高于40 ℃時(shí),主峰出峰時(shí)間更集中,但難以回落到基線水平,所以明確規(guī)定色譜柱溫度。
3.3 方 法
YBH20202005標(biāo)準(zhǔn)采用氨基柱,其他3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均采用常規(guī)C18柱,在實(shí)驗(yàn)中,我們先采用這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行方法驗(yàn)證,但專屬性驗(yàn)證均未通過(guò),現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的4個(gè)實(shí)驗(yàn)條件中奈達(dá)鉑與降解雜質(zhì)無(wú)法分開(kāi),不能保證含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。而本文的方法更換了色譜柱和流動(dòng)相系統(tǒng),經(jīng)驗(yàn)證,在專屬性、準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍、耐用性等方面驗(yàn)證均取得滿意結(jié)果,可以保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。
3.4 方法驗(yàn)證結(jié)果
對(duì)整個(gè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證,其中專屬性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明奈達(dá)鉑在規(guī)定的色譜柱間有較好的耐用性,此色譜條件可以有效分離奈達(dá)鉑和有關(guān)物質(zhì)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
本次試驗(yàn)中新建立了有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定的檢驗(yàn)方法,其專屬性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、檢測(cè)限、定量限、線性、耐用性等方面均符合要求。尤其在專屬性和耐用性方面,能將奈達(dá)鉑的有關(guān)物質(zhì)和主成分進(jìn)行有效分離,真正達(dá)到有效控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。
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數(shù)字的表達(dá)方式
數(shù)字的表達(dá)方式執(zhí)行GB/T 15835-1995《出版物上數(shù)字用法的規(guī)定》。公歷世紀(jì)、年代、年、月、日、時(shí)刻和計(jì)數(shù)、計(jì)量均用阿拉伯?dāng)?shù)字。數(shù)字≥4位數(shù)時(shí),每三位一組,組間空1/4個(gè)漢字空,如:“51,200”應(yīng)寫(xiě)成“51 200”。但序數(shù)詞和年份、頁(yè)數(shù)、部隊(duì)番號(hào)、儀表型號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)不分節(jié)。百分?jǐn)?shù)的范圍和偏差,前一個(gè)數(shù)字的百分符號(hào)不能省略,如:5%~95%,不能寫(xiě)成5~95%;(31.8±0.6)%,不能寫(xiě)成31.8±0.6%。附帶尺寸單位的數(shù)值相乘,按下列方式寫(xiě)成:4 cm×3 cm×5 cm,不能寫(xiě)成4×3×5 cm3。
Determination of the content and the related substances of Nedaplatin crude drug and its injection by RP-HPLC
LU Jun, JIAO Jian, NIU Yu-juan
(DalianInstituteforDrugControl,Dalian116021,China)
Objective To establish a RP-HPLC method for determination of contents of Nedaplatin and its related substances in Nedaplatin injection. Methods The RP-HPLC condition was consisted of a specific brand C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a column temperature at 40 ℃, the mobile phase was octane sulfonic acid sodium solution (the right amount of 0.856 g octane sulfonic acid sodium dissolved by water, adding phosphate 0.5 mL diluted to 1000 mL)- acetonitrile (91∶9) ,with a flow rate of 1.0 mL/min and detection at 220 nm. Results Nedaplatin showed good linearity in the range of 0.025-4.000 mg/mL (r=0.9998). The limit of detection and quantitation was 0.05036 μg/mL and 0.1259 μg/mL respectively. Conclusion The RP-HPLC method would be simple and applicable for the quality control of Nedaplatin crude drug and its injection.
RP-HPLC; Nedaplatin crude drug and its injection; content determination
魯 軍(1973-),男,遼寧大連人,副主任藥師。E-mail:lujun-0731@163.com
R927.11
A
1671-7295(2016)06-0549-04
魯軍,矯建,牛玉娟.反相HPLC法對(duì)奈達(dá)鉑原料及其制劑的含量和有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,38(6):549-552.
2016-09-19;
2016-11-07)