魯 軍, 矯 建, 牛玉娟

(大連市藥品檢驗所，遼寧 大連 116021)

論 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.07

反相HPLC法對奈達鉑原料及其制劑的含量和有關物質(zhì)的測定

魯 軍, 矯 建, 牛玉娟

(大連市藥品檢驗所，遼寧 大連 116021)

目的 探討反相HPLC法測定奈達鉑和注射用奈達鉑的含量和有關物質(zhì)的可行性。方法 反相HPLC法檢測5批奈達鉑，3個規(guī)格7批注射用奈達鉑的專屬性與耐受性、線性關系、檢出限、定量限、重復性與穩(wěn)定性以及樣品含量和有關物質(zhì)。色譜條件：特定品牌C18柱；流動相為辛烷磺酸鈉溶液-乙腈，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長220 nm。結果 奈達鉑濃度為0.025～4.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，與峰面積線性關系良好(相關系數(shù)r=0.9998), 檢出限為0.05036 μg/mL，定量限為0.1259 μg/mL。結論 反相HPLC法方法簡便，結果準確，適用于對奈達鉑和注射用奈達鉑的質(zhì)量控制。

反相HPLC法；奈達鉑和注射用奈達鉑；含量測定

奈達鉑(Nedaplatin)，又名順式-乙醇酸-二氨合鉑，分子式：C2H8N2O3Pt，分子量：303.18，是日本鹽野義制藥公司在20世紀80年代中期合成的第二代鉑類抗腫瘤藥物[1]，1995年6月在日本首次獲準上市，作用機制與順鉑相同，與腫瘤細胞的DNA堿基結合，阻礙DNA復制而發(fā)揮其抗腫瘤效果[2]，臨床用于治療頭頸部腫瘤、肺癌、食道癌、宮頸癌等[3-6]。由于順鉑有較為嚴重的腎毒性和胃腸道不良反應，因此在順鉑上市后的30年中，醫(yī)學界一直在尋找比母體化合物順鉑更加高效低毒的新化合物，奈達鉑作為新一代鉑類制劑，其療效與順鉑相當或更優(yōu)，具有治療指數(shù)高，腎毒性和胃腸道反應較低，使用方便，不需水化等優(yōu)點[7]。奈達鉑和注射用奈達鉑現(xiàn)執(zhí)行標準有4個(國家藥品注冊標準YBH20202005，YBH13822004，YBH06312005，YBH08642008)，均為國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊標準，4個標準中采用不同的HPLC法測定含量和有關物質(zhì)，但這四個方法的專屬性和適用性均不理想。本研究經(jīng)過試驗，重新確定色譜條件，滿足了方法的專屬性和適用性的要求，新方法重現(xiàn)性好，結果滿意。

1 材料和方法

1.1 材 料

Waters 2695 HPLC儀，Waters 2996 DAD檢測器，十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(資生堂CAPCELL PAK C18 SG120 5 μm 4.6 mm×250 mm，CAPCELL PAK C18 MGⅡ 5 μm 4.6 mm×250 mm 或CAPCELL PAK C18 MGⅢ 5 μm 4.6 mm×250 mm)。辛烷磺酸鈉、磷酸為分析純，乙腈為色譜純；奈達鉑對照品(批號：100787-201502)由中國藥品生物制品檢定所提供。奈達鉑5批(批號：20150701；20150801；20150802；01-150506；01-150507)，注射用奈達鉑3個規(guī)格7批(10 mg批號：20150405；20151202；11-150101；20 mg批號：20151201；20150203；50 mg批號：20150901；20150604)，均由生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.2 反相HPLC法色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(資生堂CAPCELL PAK C18 SG120 5 μm 4.6 mm×250 mm，CAPCELL PAK C18 MGⅡ 5 μm 4.6 mm×250 mm 或CAPCELL PAK C18 MGⅢ 5 μm 4.6 mm×250 mm)；以辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉0.856 g加水適量溶解，加磷酸0.5 mL用水稀釋至1000 mL)-乙腈(91∶9)為流動相，流速為每分鐘1.0 mL，柱溫40 ℃；檢測波長為220 nm。

1.3 反相HPLC法的方法學考察

1.3.1 專屬性與耐用性考察

取奈達鉑對照品10 mg，置5 mL容量瓶中，加過氧化氫溶液(1→100)0.1 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后，分別取20 μL注入3根不同的色譜柱中進行測定，色譜柱分別為CAPCELL PAK C18 SG120，CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ，CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ。再將上述溶液配成80%，100%，120%3個濃度，分別取20 μL注入上述3根不同的色譜柱進行測定回收率。

1.3.2 線性關系的考察

精密稱取奈達鉑對照品約100 mg置25 mL量瓶中，加水適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液1，再精密量取對照品溶液1 12.5 mL、3.0 mL、1.2 mL、0.3 mL,分別置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液2～5，量取對照品溶液1～5各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)與對照品濃度(X, mg/mL)繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.3.3 檢出限

精密稱取奈達鉑對照品10.11 mg，置100 mL量瓶中，加水適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置200 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液2 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成檢測限濃度樣品溶液，取20 μL注入液相色譜儀進行測定。

1.3.4 定量限

精密量取檢測限項下的儲備液5 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻,配成定量限濃度樣品溶液，取20 μL注入液相色譜儀進行測定。

1.3.5 回收率試驗

注射用奈達鉑按企業(yè)提供的處方比例分別制備含奈達鉑為法定處方量80%、100%和120%的樣品，每個濃度的溶液配制3份。取20 μL注入液相色譜儀進行測定，分別計算回收率。

1.3.6 重復性與穩(wěn)定性試驗

精密稱取批號為 20150701的奈達鉑20.44、20.31、21.51、20.16、20.89、19.50 mg，分別置10 mL量瓶中，加水適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀進行重復性試驗測定。再取第一個供試品溶液，經(jīng)2、4、6和24 h后分別取20 μL注入液相色譜儀進行穩(wěn)定性試驗測定。

1.4 樣品含量和有關物質(zhì)測定

奈達鉑：取供試品約100 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算奈達鉑的有關物質(zhì)和含量。

注射用奈達鉑：取供試品10支的內(nèi)容物，混勻，精密稱取適量，加水溶解并稀釋制成每1 mL中含2 mg的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成份峰保留時間的4.5倍，并以水為空白進行校正，按外標法計算奈達鉑的有關物質(zhì)和含量。

2 結 果

2.1 反相HPLC法的方法學考察

2.1.1 專屬性與耐用性考察

圖1中各圖為同一瓶溶液在3根色譜柱上的專屬性分離圖譜，表1為耐用性測定結果。在此條件下，用DAD檢測器分析主峰奈達鉑的峰純度，為單一物質(zhì)。

圖1 專屬性圖譜Fig 1 Specificity spectrumA:CAPCELL PAK C18 SG120；B: CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ；C：CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ

表1 耐用性測定結果(回收率)

2.1.2 線性關系的考察

回歸方程為： Y=1E+07X+2.339×105,r=0.9998；奈達鉑濃度在0.025～4.00 mg/mL范圍內(nèi)，與其峰面積呈良好的線性關系。

2.1.3 檢出限

按S/N為3∶1計算，檢出限為0.05036 μg/mL(約為有關物質(zhì)限度值的0.2%)。

2.1.4 定量限

按S/N為10∶1計算，定量限為0.1259 μg/mL。

2.1.5 回收率試驗

平均回收率為100.6%(RSD=0.15%，n=9)。

2.1.6 重復性試驗

6份供試品測得的含量的RSD為0.90%；不同時間段的供試品溶液測定的峰面積的RSD為0.62%。

2.2 樣品含量和有關物質(zhì)測定

奈達鉑： 5批樣品測定的含量分別為標示量的99.9%，100.7%，99.3%，98.6%，100.1%；其有關物質(zhì)的含量分別為0.2%，0.1%，0.1%，0.2%，0.8%。

注射用奈達鉑：7樣品測定的含量分別為標示量的100.1%，98.8%，98.9%，103.7%，100.8%，97.0%，100.0%；有關物質(zhì)的含量分別為0.1%，0.1%，0.6%，0.2%，0.2%，0.2%，0.2%。

3 討 論

3.1 色譜柱

在藥物分析中高效液相色譜法用得非常普遍，而色譜柱的選擇直接影響實驗結果與藥物的質(zhì)量控制。不同C18色譜柱的保留行為千差萬別，選擇適宜的色譜柱對分析樣品至關重要[8]。在方法驗證中，曾使用其它幾個品牌和類型的C18色譜柱，但主峰前沿或拖尾比較嚴重，與相鄰雜質(zhì)峰無法實現(xiàn)較好分離，就此問題與企業(yè)也進行過溝通，企業(yè)也認為在他們以往的標準中，奈達鉑對色譜柱要求較高，這也是困擾他們的一大問題。本研究在方法建立過程中，針對主成分和各相關雜質(zhì)極性較大，易與未鍵合的硅羥基作用而拖尾的特點，選擇了具有獨特包膜技術的資生堂色譜柱，分別使用3種型號色譜柱，均能較好地重現(xiàn)實驗結果，而其它品牌的色譜柱則不適用。

3.2 溫 度

對于高效液相色譜而言，溫度是一個一直被忽視而又非常重要的因素。升高色譜分析的柱溫,不僅可以加快分析速度,而且還可以提高分離效率、改善峰形、調(diào)節(jié)選擇性、減少有機溶劑的使用，是一個非常有效而又十分經(jīng)濟適用的方法，與其它調(diào)節(jié)分離效果的方法相比，具有其獨特的優(yōu)勢[9]。本試驗中溫度對檢測結果影響較大，當溫度低于35 ℃時，奈達鉑主峰會分裂出一個肩峰，因此，檢測時，色譜柱的溫度不能低于40 ℃；高于40 ℃時，主峰出峰時間更集中，但難以回落到基線水平，所以明確規(guī)定色譜柱溫度。

3.3 方 法

YBH20202005標準采用氨基柱，其他3個標準均采用常規(guī)C18柱，在實驗中，我們先采用這4個標準中的方法進行方法驗證，但專屬性驗證均未通過，現(xiàn)行標準的4個實驗條件中奈達鉑與降解雜質(zhì)無法分開，不能保證含量測定和有關物質(zhì)檢驗結果準確。而本文的方法更換了色譜柱和流動相系統(tǒng)，經(jīng)驗證，在專屬性、準確性、精密度、檢測限、定量限、線性、范圍、耐用性等方面驗證均取得滿意結果，可以保證檢驗結果準確。

3.4 方法驗證結果

對整個方法進行了驗證，其中專屬性和耐用性試驗結果說明奈達鉑在規(guī)定的色譜柱間有較好的耐用性，此色譜條件可以有效分離奈達鉑和有關物質(zhì)。重復性試驗結果說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

本次試驗中新建立了有關物質(zhì)和含量測定的檢驗方法，其專屬性、準確性、重復性、檢測限、定量限、線性、耐用性等方面均符合要求。尤其在專屬性和耐用性方面，能將奈達鉑的有關物質(zhì)和主成分進行有效分離，真正達到有效控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

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數(shù)字的表達方式

數(shù)字的表達方式執(zhí)行GB/T 15835-1995《出版物上數(shù)字用法的規(guī)定》。公歷世紀、年代、年、月、日、時刻和計數(shù)、計量均用阿拉伯數(shù)字。數(shù)字≥4位數(shù)時，每三位一組，組間空1/4個漢字空，如：“51,200”應寫成“51 200”。但序數(shù)詞和年份、頁數(shù)、部隊番號、儀表型號、標準號不分節(jié)。百分數(shù)的范圍和偏差，前一個數(shù)字的百分符號不能省略，如：5%～95%，不能寫成5～95%；(31.8±0.6)%，不能寫成31.8±0.6%。附帶尺寸單位的數(shù)值相乘，按下列方式寫成：4 cm×3 cm×5 cm，不能寫成4×3×5 cm3。

Determination of the content and the related substances of Nedaplatin crude drug and its injection by RP-HPLC

LU Jun, JIAO Jian, NIU Yu-juan

(DalianInstituteforDrugControl,Dalian116021,China)

Objective To establish a RP-HPLC method for determination of contents of Nedaplatin and its related substances in Nedaplatin injection. Methods The RP-HPLC condition was consisted of a specific brand C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a column temperature at 40 ℃, the mobile phase was octane sulfonic acid sodium solution (the right amount of 0.856 g octane sulfonic acid sodium dissolved by water, adding phosphate 0.5 mL diluted to 1000 mL)- acetonitrile (91∶9) ,with a flow rate of 1.0 mL/min and detection at 220 nm. Results Nedaplatin showed good linearity in the range of 0.025-4.000 mg/mL (r=0.9998). The limit of detection and quantitation was 0.05036 μg/mL and 0.1259 μg/mL respectively. Conclusion The RP-HPLC method would be simple and applicable for the quality control of Nedaplatin crude drug and its injection.

RP-HPLC; Nedaplatin crude drug and its injection; content determination

魯 軍(1973-)，男，遼寧大連人，副主任藥師。E-mail：lujun-0731@163.com

R927.11

A

1671-7295(2016)06-0549-04

魯軍,矯建,牛玉娟.反相HPLC法對奈達鉑原料及其制劑的含量和有關物質(zhì)的測定[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(6)：549-552.

2016-09-19;

2016-11-07)