沈俊炳

(詔安縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所，福建 詔安 363500)

毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)魚(yú)露中的L-羥脯氨酸含量的不確定度評(píng)定

沈俊炳*

(詔安縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所，福建 詔安 363500)

為驗(yàn)證檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)能力及進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)能力比對(duì)，按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》、CNAS-GL05:2011《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》及CNAS-GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，對(duì)新開(kāi)發(fā)的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)魚(yú)露中的L-羥脯氨酸含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。不確定度來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液、移取定容體積、試樣重復(fù)測(cè)定、回收率和最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該方法中最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求試樣含量引入的不確定度uc對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的貢獻(xiàn)最大，其次為試樣重復(fù)測(cè)定引入的不確定度urep，而L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的不確定度us也不容小覷。上述3個(gè)方面應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加以注意，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。本研究對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行量化，得出魚(yú)露中的L-羥脯氨酸含量為(50.44±8.80) mg/L，k=2.576。研究結(jié)果為L(zhǎng)-羥脯氨酸含量測(cè)定新方法的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(4):31-36]

毛細(xì)管電泳；電化學(xué)發(fā)光；L-羥脯氨酸；不確定度；魚(yú)露

L-羥脯氨酸，又稱順式-4-羥基-L-脯氨酸，分子式C5H9NO3，是一種亞氨基酸[1]，白色片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，呈苦味中的獨(dú)特甜味，可作香料。L-羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分，廣泛存在于動(dòng)物皮[2]、膠原海綿[3]、魚(yú)皮[4]等水解液中，其他普通蛋白質(zhì)中含量極少[5]，是動(dòng)物水解蛋白的指示性氨基酸[6]，檢測(cè)其在食品中的含量，可用于判定在食品加工過(guò)程中是否違法添加了動(dòng)物水解蛋白以提高蛋白質(zhì)含量[7-9]。因此要求L-羥脯氨酸的檢測(cè)方法具有更高的準(zhǔn)確度。

不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[10]。不確定度評(píng)定作為一種科學(xué)的方法，不但能給出測(cè)量結(jié)果可信度，還能有效地評(píng)定測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量[11]。同時(shí)不確定度評(píng)定也使得國(guó)內(nèi)國(guó)際間不同檢測(cè)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得以共享[12]。因此，不確定度評(píng)定在各個(gè)領(lǐng)域都倍受關(guān)注[13-15]。

目前有的L-羥脯氨酸的檢測(cè)方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、氨基酸自動(dòng)分析儀法及毛細(xì)管電泳法[16-17]。但目前國(guó)家只頒布了GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》[18](國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))和SN/T 3929—2014《出口食品中L-羥脯氨酸的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜法/質(zhì)譜法》[19](進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。而上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)并不適用于水產(chǎn)品中L-羥脯氨酸含量的檢測(cè)。因此開(kāi)發(fā)適用于水產(chǎn)品中L-羥脯氨酸含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法尤為重要。同時(shí)為驗(yàn)證檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)能力及進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)能力比對(duì)，本研究以新開(kāi)發(fā)的魚(yú)露中L-羥脯氨酸含量的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法為例，按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[20]、CNAS-GL05:2011《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》[21]及CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[22]，建立了毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)魚(yú)露中L-羥脯氨酸含量的不確定度測(cè)量模型，分析各個(gè)不確定度來(lái)源，量化各個(gè)不確定度分量，最終對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行不確定度分析和評(píng)定。不僅驗(yàn)證了不同檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)能力，也為新開(kāi)發(fā)的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)魚(yú)露中L-羥脯氨酸含量檢測(cè)方法的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)其他毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司)；75 cm×25 μm (id.)無(wú)涂層石英熔融毛細(xì)管(永年縣銳灃色譜器件有限公司)；MS105DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；1～10 mL移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；pH211C酸度計(jì)(意大利HANNA公司)；KQ2100E超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

氯化三(2,2′-聯(lián)吡啶)釕(II)六水合物(Ru(bpy)32+)、L-羥脯氨酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度≥99%)；NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、HCl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)。

實(shí)驗(yàn)用水均為純水，魚(yú)露購(gòu)自超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 000 mg/L)：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確到0.1 mg)，用純水溶解并定容至100 mL。

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用純水按比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別配制成10、25、50、100、250、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 試樣處理

魚(yú)露用純水稀釋后即可進(jìn)行測(cè)定。

1.3 毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條件

檢測(cè)條件：光電倍增管高壓為800 V；檢測(cè)電位為1.20 V；Ru(bpy)32+濃度為6 mmol/L；緩沖溶液濃度為50 mmol/L PBS；緩沖溶液pH為8.0。進(jìn)樣條件：10 kV×12 s。分離條件：運(yùn)行高壓為14 kV；運(yùn)行緩沖溶液濃度為50 mmol/L；運(yùn)行緩沖溶液pH為8.5。所有進(jìn)入毛細(xì)管的溶液均需超聲波脫氣，并用0.22 μm醋酸纖維膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

試樣中L-羥脯氨酸含量的計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

式(1)

式(1)中：X為試樣中的L-羥脯氨酸含量(mg/L)；c為試樣稀釋液中的L-羥脯氨酸含量(mg/L，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出)；V為移取的試樣體積(mL)；n為試樣稀釋液體積(mL)。

2.2 不確定度來(lái)源分析

經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)定步驟和2.1中數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，影響L-羥脯氨酸檢測(cè)結(jié)果的不確定度因素主要有：L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的不確定度、試樣移取定容過(guò)程中引入的不確定度、試樣重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度、L-羥脯氨酸回收率引入的不確定度和最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求試樣含量引入的不確定度。

2.3 不確定度分度量化

2.3.1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us

2.3.1.1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us1分析

2.3.1.2 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us2分析

2.3.1.3 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中器具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us3分析

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中配制L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液使用容量瓶和移液器所引入的不確定度分量主要有3個(gè)方面：1)使用的容量瓶和移液器體積校準(zhǔn)不確定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定分量us3(1)；2)使用的容量瓶和移液器重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定分量us3(2)；3)配制過(guò)程中L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度(20 ℃)不同引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定分量us3(3)。3個(gè)不確定度分量的計(jì)算如下。

表1 容量瓶和移液器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

Tab.1 The relative standard uncertainty of volumetric flask and pipette

器具Container容量允差/容量允許誤差Tolerance/Allowableerrorus3(1)us3(2)us3(3)合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us3(Vr)Relatedcombineduncertainty100mL容量瓶(A級(jí))±0．10mL0．04080．00040．0606us3(V100)=0．000710mL容量瓶(A級(jí))±0．020mL0．00820．00070．0061us3(V10)=0．00101mL移液器±1．0%0．00410．00290．0006us3(V1)=0．00512．5mL移液器±0．5%0．00510．00120．0015us3(V2．5)=0．00225mL移液器±0．6%0．01220．00120．0030us3(V5)=0．0025

2.3.2 試樣移取定容過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uv

2.3.3 試樣重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urep

按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行試樣測(cè)定，試樣平行檢10次，測(cè)定結(jié)果，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試樣中L-羥脯氨酸含量重復(fù)檢測(cè)結(jié)果

Tab.2 L-hydroxyproline content of the sample parallel test

平行實(shí)驗(yàn)/(mg·L-1)Paralleltest12345678910平均值/(mg·L-1)Averagevalue相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD50．06251．55848．42452．02251．29852．30251．47848．72050．27848．24450．443．03

根據(jù)A類不確定度評(píng)定，計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

=0.009 6(n=10)。

2.3.4 L-羥脯氨酸回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urec

由于是新開(kāi)發(fā)的L-羥脯氨酸檢測(cè)方法，方法的回收率是否符合相關(guān)要求也是需要考慮的重點(diǎn)，需進(jìn)

行不確定度評(píng)定。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)定試樣的L-羥脯氨酸含量，分別進(jìn)行了10、20、30 mg/L 3個(gè)水平的添加，每個(gè)添加水平做4次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

=0.005 2(n=12)。

顯著性檢測(cè)是用來(lái)確定平均回收率是否與理想狀態(tài)100%回收有顯著性差異。采用t-檢驗(yàn)確定平均回收率與理想狀態(tài)100%回收是否有顯著性差異。假設(shè)顯著性水平α=0.05，查表得n-1自由度的雙邊臨界值tcrit=2.201(n=12)。

表3 試樣回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Recovery test results of samples

編號(hào)No．加標(biāo)量/(mg·L-1)Addingstandard回收量/(mg·L-1)Recovery回收率/%Recoveryrate平均回收率/%Averagerecoveryrate1109．7897．802109．8998．903109．7297．204109．7797．7052020．02100．1062019．8999．4572020．05100．2597．8182019．7698．8093028．9196．37103028．7898．09113028．6395．43123029．0496．80

平均回收率與理想狀態(tài)100%回收有顯著性差異，必須考慮L-羥脯氨酸回收率引入的不確定度。

2.3.5 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求試樣含量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc

將10、25、50、100、250、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液各測(cè)定3次，得到相應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，其結(jié)果見(jiàn)表4。

根據(jù)表4的測(cè)定數(shù)據(jù)，用最小二乘法擬合求出標(biāo)

表4 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度和相應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度

Tab.4 L-hydroxyproline standard mass concentration and corresponding ECL intensity

質(zhì)量濃度/(mg·L-1)MassconcentrationI1I2I3I1032．131．633．132．32581．982．782．182．250164．5167．8167．4166．6100330．1322．7328．7327．2250845．2840．9837．6841．25001744．21759．61740．81749．7

注：I為實(shí)驗(yàn)條件下的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

對(duì)試樣進(jìn)行10次平行測(cè)定，測(cè)得試樣檢測(cè)液中的L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為25.22 mg/L，則魚(yú)露中的L-羥脯氨酸含量為50.44 mg/L。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

2.3.6 計(jì)算相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

不確定度各分量按正態(tài)分布處理，取置信因子k=2.576(置信區(qū)間99%)，則擴(kuò)展不確定度U=c0×k×uc=8.80 mg/L。

2.3.7 不確定度分量比例

圖1 各個(gè)不確定度分量分布圖Fig.1 Distribution diagram of each component of uncertainty

通過(guò)對(duì)魚(yú)露中L-羥脯氨酸含量測(cè)定過(guò)程中各個(gè)不確定度來(lái)源進(jìn)行分析，將各個(gè)不確定度分量按比例繪制成圖，如圖1所示。由圖1可以看出，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求試樣含量引入的不確定度uc對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的貢獻(xiàn)最大，其次是試樣重復(fù)測(cè)定引入的不確定度urep，再者L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的不確定度us也不容小覷。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，魚(yú)露中的L-羥脯氨酸含量為(50.44±8.80) mg/L，k=2.576。新開(kāi)發(fā)的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)魚(yú)露中的L-羥脯氨酸檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度得到驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的不確定度分析發(fā)現(xiàn)，此新開(kāi)發(fā)的L-羥脯氨酸檢測(cè)方法中最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求試樣含量引入的不確定度uc對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的貢獻(xiàn)最大，其次是試樣重復(fù)測(cè)定引入的不確定度urep，再者L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的不確定度us也不容小覷，對(duì)此以后改進(jìn)此新方法的過(guò)程中，需要特別注意在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)程中要規(guī)范操作及增加平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)。本研究為此L-羥脯氨酸測(cè)定新方法的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

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[18] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 9695.23—2008 肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[19] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 3929—2014 出口食品中L-羥脯氨酸的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2014.

[20] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJF1059.1—2012測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)與表示[S]. 北京:中國(guó)計(jì)量出版社, 2012.

[21] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). CNAS-GL05:2011測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南[S]. 北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì), 2011.

[22] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). CNAS-GL06:2006化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S]. 北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì), 2006.

[23] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJG196—2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S]. 北京:中國(guó)計(jì)量出版社, 2006.

[24] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJG64—2006移液器檢定規(guī)程[S]. 北京:中國(guó)計(jì)量出版社, 2006.

Evaluation of uncertainty in detection of L-hydroxyproline in fish sauce by capillary electrophoresis electrochemiluminescence

SHEN Junbing*

(Zhao’an Institute of Quality Inspection and Metrological Verification, Zhao’an 363500, China)

In order to verify the ability of capillary electrophoresis of the inspection body and compare the ability of capillary electrophoresis, the uncertainty evaluation of the new method for detection of L-hydroxyproline in fish sauce through capillary electrophoresis electrochemiluminescence was conducted in accordance with JJF 1059.1—2012 "Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement", CNAS-GL05:2011 "Guidance on the Application of the Requirements for Measurement Uncertainty" and CNAS-GL06:2006 "Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis". After the analysis of L-hydroxyproline measurement, the uncertainty sources included standard solution, pipetting volume by volume, repetitive sample measurement, recovery and least-squares fitting standard curve. The results showed that in the L-hydroxyproline detection method, the uncertaintyucintroduced for the mea-surement of content by the least square method to fit the standard curve contributes highest to combined standard uncertainty, followed by uncertaintyurepintroduced for repeated measurement. Furthermore, the uncertaintyusintroduced for the L-hydroxyproline standard solution preparation process should not be underestimated. Attention should be paid to the above three aspects in the experiment process, in order to improve the accuracy of the experiment. Through each quantified uncertainty components on fish sauce, the results showed that L-hydroxyproline content was (50.44±8.80) mg/L,k=2.576. The research results provide a theoretical basis for the quality control of new determination methods of L-hydroxyproline content. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(4):31-36]

capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; L-hydroxyproline; uncertainty; fish sauce

SHEN Junbing, cysjbsjb@163.com

2016-04-27；接收日期：2016-06-16

詔安縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所事業(yè)發(fā)展基金〔2016〕004號(hào)

沈俊炳(1989-)，男，碩士，助理工程師，研究方向?yàn)槭称房勺匪蒹w系和食品檢驗(yàn)質(zhì)量控制，cysjbsjb@163.com

S94

A

2095-1833(2016)04-0031-06