摘要：目的 探討Y-盒結(jié)合蛋白-1（Y-box binding protein-1，YB-1）在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)生中的作用及可能機(jī)制，為研究宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論依據(jù)。方法 應(yīng)用二氯化鈷（CoCl2）處理宮頸癌Hela細(xì)胞模擬細(xì)胞低氧微環(huán)境，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，篩選CoCl2最適作用濃度及時(shí)間；倒置顯微鏡觀察低氧6 h后細(xì)胞形態(tài)特征；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)低氧6 h后細(xì)胞中YB-1、Vimentin和MMP-2的蛋白表達(dá)及其相互關(guān)系。結(jié)果 模擬低氧微環(huán)境的CoCl2最適作用濃度為150 μmol/L，最適作用時(shí)間為6 h（P<0.05）；低氧使Hela細(xì)胞逐漸獲得了間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征；低氧6 h后，Hela細(xì)胞中YB-1、Vimentin、MMP-2表達(dá)較常氧組顯著增高（P<0.05），且YB-1、Vimentin、MMP-2之間相互呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論 YB-1可能通過YB-1-MMP-2-Vimentin途徑，上調(diào)Vimentin表達(dá)從而在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌EMT發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：Y-盒結(jié)合蛋白-1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；宮頸癌；低氧微環(huán)境

中圖分類號(hào)：R737.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

宮頸癌是涉及多因素、多基因共同作用的婦科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均居女性腫瘤第二位[1]。盡管宮頸癌篩查不斷普及，但仍有大量未經(jīng)篩查的中晚期患者因腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及對(duì)放化療耐藥，從而導(dǎo)致患者不良預(yù)后或死亡。近年研究表明，EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞的過程，是多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[2]。目前體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，EMT在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和宮頸癌等多種腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[3]。 因此，研究EMT與宮頸癌的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)尋找治療宮頸癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的目標(biāo)靶點(diǎn)有著重要的意義。

1資料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑 宮頸癌Hela細(xì)胞由昆明醫(yī)科大學(xué)云南省藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周軼平老師饋贈(zèng)。CoCl2購自廣州金華大化學(xué)試劑有限公司；DMSO 、DAPI、兔抗人YB-1多克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所；單克隆小鼠抗人Vimentin、兔抗人MMP-2單克隆抗體購自武漢博士德生物公司；山羊抗兔-TRITC、山羊抗小鼠-FITC購自康為世紀(jì)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)CoCl2對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響

1.3.1 MTT法檢測(cè)CoCl2不同濃度對(duì)Hela細(xì)胞增殖活力的影響 Hela細(xì)胞接 種于96孔板，加含CoCl2（0、50、100、150、200、250 μmol/L）的培養(yǎng)基，6 h加MTT，4 h加DMSO，振蕩、酶標(biāo)儀測(cè)量OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.2MTT法檢測(cè)CoCl2不同時(shí)間對(duì)Hela細(xì)胞增殖活力的影響 Hela細(xì)胞接種于96孔板，0、3、6、12、24 h加入含150 μmol/LCoCl2的培養(yǎng)基，6 h加MTT 4 h加DMSO，振蕩、酶標(biāo)儀測(cè)量OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4低氧對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 分低氧組、常氧組，低氧組用含終濃度為150 μmol/L的CoCl2溶液的培養(yǎng)基，常氧組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理6 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，鏡檢、拍照。

1.5免疫熒光法檢測(cè)低氧對(duì)Hela細(xì)胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響 制備細(xì)胞爬片、固定、血清封閉、分別滴加YB-1、Vimentin、MMP-2、YB-1與Vimentin、YB-1與MMP-2混合一抗（1∶100），4℃過夜后分別滴加相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，室溫避光孵育、DAPI工作液染核、封片，觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以（x±s）表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Pearson線性相關(guān)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1低氧對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，以50、100、150、200、250 μmol/L 的CoCl2 處理Hela細(xì)胞6 h 后，細(xì)胞存活率分別為（117±16）%、（103±13）%、（96±17）%、（66±16）%、（55±16）%。CoCl2 對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性，與未加用CoCl2的細(xì)胞相比，CoCl2濃度為150 μmol/L時(shí)顯示顯著的細(xì)胞抑制作用。用含150 μmol/L的 CoCl2培養(yǎng)基處理Hela細(xì)胞3 h、6 h、12 h、24 h后細(xì)胞的存活率分別為（109±11.9）%、（103±6.5）%、（88±4.7）%、（69±14.5）%，表明CoCl2作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞存活率越低，與0 h相比，作用后6 h細(xì)胞存活率顯著下降（P<0.05）。表明CoCl2 對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度-時(shí)間依賴性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考文獻(xiàn)，選擇150 μmol/L的CoCl2、作用6 h作為低氧組培養(yǎng)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2低氧對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 濃度為150 μmol/L的CoCl2溶液刺激Hela細(xì)胞6 h后發(fā)現(xiàn)，Hela細(xì)胞獲得了間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征，大部分細(xì)胞逐漸伸展、變形，細(xì)胞間空隙變寬，突起變得更為狹長(zhǎng)，見圖1。

圖1 150 μmol /L CoCl2處理6h后細(xì)胞形態(tài)的變化

（倒置顯微鏡×100）

2.3低氧對(duì)Hela細(xì)胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響 熒光顯微鏡下觀察，YB-1陽性表達(dá)呈紅色熒光，主要定位在胞核或胞漿內(nèi)，胞核為主。Vimentin的陽性表達(dá)呈綠色熒光，定位在細(xì)胞質(zhì)。MMP-2陽性表達(dá)呈綠色熒光，主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。與常氧組比較，低氧組Hela細(xì)胞中YB-1、MMP-2、Vimentin蛋白的表達(dá)顯著增高（P<0.05）。雙重?zé)晒夥ㄍ瑫r(shí)檢測(cè)Hela細(xì)胞中YB-1與MMP-2及YB-1與Vimentin蛋白表達(dá)，Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下YB-1、MMP-2、Vimentin蛋白表達(dá)兩兩呈正相關(guān)（P<0.05），見圖2，表1，表2。

單標(biāo)法 雙標(biāo)法

圖2 低氧對(duì)Hela細(xì)胞YB-1、MMP-2、Vimentin的表達(dá)影響（單、雙標(biāo)法）（×200）

3討論

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移包括粘附性下調(diào)、基質(zhì)降解、遷移性增強(qiáng)3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前研究認(rèn)為EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移早期始動(dòng)的關(guān)鍵步驟[4]，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中MTT結(jié)果表明CoCl2 對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CoCl2可導(dǎo)致Hela細(xì)胞發(fā)生了明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，說明低氧可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下宮頸癌Hela細(xì)胞中Vimentin表達(dá)明顯增強(qiáng)，Vimentin作為間質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架成分之一，參與調(diào)解細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增殖，是EMT的標(biāo)志，低氧組宮頸癌Hela細(xì)胞Vimentin表達(dá)增高，提示低氧狀態(tài)下宮頸癌細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了EMT。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色法檢測(cè)了宮頸癌Hela細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與常氧組比較，低氧組宮頸癌Hela細(xì)胞中MMP-2表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)低氧組宮頸癌Hela細(xì)胞YB-1、MMP-2、Vimentin兩兩呈正相關(guān)。提示低氧誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)上調(diào)。因此，YB-1可能通過YB-1-MMP-2-Vimentin途徑，上調(diào)Vimentin表達(dá)從而在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌EMT發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。

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編輯/申磊