蔡 準(zhǔn)，陳國福，吳麗君，張雪鵬，孟祥潮

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤外科，河北 唐山 063000)

論 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.05

shRNA沉默ADAM17基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖的影響

蔡 準(zhǔn)，陳國福，吳麗君，張雪鵬，孟祥潮

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤外科，河北 唐山 063000)

目的 利用shRNA干擾沉默人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的解聚素-金屬蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17，ADAM17)基因，觀察其對細(xì)胞增殖的影響。方法 針對ADAM17基因設(shè)計合成具有特異性的ADAM17-shRNA，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。實驗設(shè)對照組(空白PBS)、干擾組(轉(zhuǎn)染干擾無義序列ADAM17-shNC)、實驗組(轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA)，采用Realtime PCR檢測各組細(xì)胞ADAM17 mRNA的表達(dá)水平，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細(xì)胞的增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。結(jié)果 實驗組ADAM17 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組和干擾組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組的MCF-7細(xì)胞增殖活性較其他兩組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組的MCF-7細(xì)胞進(jìn)入S期(23.60±1.09)%和G2/M期(6.30±0.82)%的比例降低，絕大多數(shù)細(xì)胞停留在G0/G1期(65.17±1.35)%，細(xì)胞周期延緩，與對照組、干擾組相比較差異具有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論 ADAM17-shRNA對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的ADAM17基因具有沉默作用，從而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖活性，延緩細(xì)胞周期進(jìn)展。

解聚素-金屬蛋白酶17；短發(fā)夾RNA；乳腺癌；增殖

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近年來，在全球范圍內(nèi)，每年新增乳腺癌患者約有138萬例，占女性癌癥病例的23%[1]。中國成為乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一[2]。解聚素-金屬蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17，ADAM17)是解聚素-金屬蛋白酶家族的重要成員之一。具有解聚素和金屬蛋白酶的活性，ADAM17發(fā)揮蛋白剪切酶樣的作用，釋放或啟動大量結(jié)構(gòu)和功能不同的分子，在腫瘤細(xì)胞中參與多種生物學(xué)行為[3-4]。國內(nèi)外研究均表明ADAM17在多種惡性腫瘤中都有高表達(dá)，而在正常組織和細(xì)胞中卻表達(dá)量很少，參與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程[5-7]。本研究利用ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化，從而揭示ADAM17與乳腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材 料

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7系購買于天津腫瘤研究所；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自上海生物工程有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Platimum SYBR PCR試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000均購置于Invitrogen公司；ADAM17-shRNA和ADAM17-shNC載體購買于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，靶序列如下。

表1 ADAM17的各組靶序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7用含有10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法

采用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Invitrogen公司的產(chǎn)品說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實驗分為對照組、干擾組和實驗組，實驗組加入轉(zhuǎn)染試劑和ADAM17-shRNA載體，同樣的方法轉(zhuǎn)染干擾組和對照組，干擾組加入轉(zhuǎn)染試劑和ADAM17-shNC載體，對照組加入與轉(zhuǎn)染試劑和ADAM17-shRNA載體混合總量等量的PBS。轉(zhuǎn)染48～72 h后，利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率，選取5個不同視野，轉(zhuǎn)染率=熒光個數(shù)/透光圖細(xì)胞個數(shù)×100%。

1.4 Realtime PCR法檢測ADAM17基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24～48 h，收集各組細(xì)胞，經(jīng)Trizol試劑說明書一步法提取總RNA，測定總RNA的純度和濃度符合實驗要求后采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，Platimum SYBR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)ADAM17引物序列：上游5'-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3'，下游5'-CAAACCCATCCTCGTCCA-3’，擴(kuò)增片段154 bp；β-actin內(nèi)參引物序列：上游5'-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'，下游5'-TTCTTTCCCACATTGCGTTGATTC-3'，擴(kuò)增片段175 bp；檢測ADAM17 mRNA的表達(dá)情況，對RT-PCR的結(jié)果采用相對定量的方法進(jìn)行分析。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

取處于對數(shù)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以1.5×105/孔接種于96孔板中(每組設(shè)9個復(fù)孔)，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法操作。轉(zhuǎn)染成功后，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的四甲基偶氮唑鹽(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，并均勻震蕩10 min，充分溶解，用分光光度計570 nm波長測定各孔的吸光度(OD值)，取每組的平均值。計算腫瘤細(xì)胞抑制率，腫瘤細(xì)胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組細(xì)胞OD值)×100%。

1.6 流式細(xì)胞技術(shù)儀分析細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染成功后培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷2 mL的70%乙醇充分懸浮細(xì)胞，并置于4 ℃冰箱固定細(xì)胞24 h以上。細(xì)胞固定好后，加入碘化丙啶(PI)染液500 μL(濃度50 μg/mL)，染色30 min常溫避光。用300鉬濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，選用標(biāo)準(zhǔn)程序經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。統(tǒng)計分析進(jìn)行組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的評價

轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)48 h，實驗中脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染法的效率高達(dá)85%以上。見圖1。

圖1 倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖(×100)Fig 1 Transfection images of MCF-7 cells under fluorescence microscope(×100)A:轉(zhuǎn)染ADAM-shRNA透光檢測; B:轉(zhuǎn)染ADAM-shRNA熒光檢測; C:A和B合成的圖像

2.2 ADAM17 mRNA的表達(dá)水平

Realtime PCR法檢測ADAM17 mRNA的表達(dá)，干擾組與實驗組的相對表達(dá)量分別為0.95±0.11及0.64±0.11。實驗組與對照組及干擾組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組ADAM17 mRNA 的相對表達(dá)量Fig 2 Relative expression of mRNA ADAM17 in each group*與對照組及干擾組比較，P<0.05

2.3 細(xì)胞增殖能力

實驗組在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，與對照組、干擾組相比，細(xì)胞的增殖能力明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.05)。見圖3，表2。

圖3 各組細(xì)胞不同時間點的吸光度Fig 3 The optical density of each group in different time

表2 各組細(xì)胞不同時間點的吸光度

1)與對照組及干擾組比較，P<0.05

2.4 細(xì)胞周期的變化

實驗組 G0/G1期的細(xì)胞比例為(65.17±1.35)%，高于對照組及干擾組，處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例為(23.60±1.09)%及(6.30±0.82)%，低于對照組及干擾組，差異有顯著性意義(P<0.05)；對照組和干擾組間無顯著性差異(P>0.05)。見表3和圖4。

圖4 MCF-7細(xì)胞的流式細(xì)胞周期圖Fig 4 Cell cycle distribution of MCF-7 cellsa：對照組；b：干擾組；c實驗組

表3 各組細(xì)胞的G0/G1期，S期，G2/M期比例情況

1)與對照組及干擾組比較，P<0.05

3 討 論

去整合素-金屬蛋白酶家族(adisintegrin and metalloprotease domain, ADAMs)是一類固定于細(xì)胞膜上的細(xì)胞表面蛋白類家族。研究發(fā)現(xiàn)該家族含有40余種類型，屬于I型跨膜蛋白[8]。近年來ADAM17在乳腺癌中的作用也越來越被關(guān)注。Narita D等[9]研究證明ADAM17在乳腺癌組織中高表達(dá)，且隨惡性程度、臨床分期的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而表達(dá)增多。盛英文等[10]采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)ADAM17蛋白在浸潤性乳腺癌中高表達(dá)，在乳腺纖維腺瘤及正常乳腺組織中呈低表達(dá)，且與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況存在正相關(guān)性。這些均提示了ADAM17在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的整個進(jìn)程中起到了極其重要的作用，ADAM17極具作為乳腺癌基因靶向治療的一個新靶點的潛力。

本研究首先利用RNAi技術(shù)針對ADAM17基因設(shè)計并構(gòu)建具有特異性的ADAM17-shRNA，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，從基因水平、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期等方面研究靶向針對ADAM17基因的shRNA對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響。結(jié)果顯示ADAM17-shRNA對細(xì)胞ADAM17基因的表達(dá)具有抑制作用，實驗組細(xì)胞的ADAM17mRNA表達(dá)水平與對照組及干擾組相比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組的細(xì)胞增殖活性較對照組與干擾組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組的細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期的比例降低，絕大多數(shù)細(xì)胞停留在G0/G1期，與對照組、干擾組比較差異顯著(P<0.05)。說明特異性ADAM17-shRNA表達(dá)載體能有效沉默ADAM17基因的表達(dá)，從而抑制其下游EGFR-PI3K-AKT通路，進(jìn)而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，延緩細(xì)胞周期進(jìn)展[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染的SD大鼠BMSC對人乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞MCF-7的增殖能力和體外侵襲能力都有顯著的抑制作用[12-13]。RNAi的發(fā)現(xiàn)為研究生物體功能基因提供了有效的工具，更提供了特異性阻斷基因表達(dá)的新方法。

綜上所述表明，通過RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA可以沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7的ADAM17 mRNA表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞的增殖活性，延緩細(xì)胞周期進(jìn)展。ADAM17作為抗腫瘤藥物研究的一個靶點，為今后以ADAM17為新靶點的靶向藥物開發(fā)提供了研究方向，同時為乳腺癌臨床的診斷和治療提供實驗理論依據(jù)。

[1] 郭曉龍, 鄭美珠, 左文述, 等. 三陰性乳腺癌靶向治療的研究前景[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2014, 21(21): 1751-1756.

[2] Yu ZG, Jia CX, Geng CZ, et al. Risk factors related to female breast cancer in regions of Northeast China: a 1:3 matched case-control population-based study[J]. Chin Med J, 2012, 125(5): 733-740.

[3] Borrell-Pagès M, Rojo F, Albanell J, et al. TACE is required for the activation of the EGFR by TGF-alpha in tumors[J]. EMBO J, 2003, 22(5): 1114-1124.

[4] Black RA. Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2002, 34(1): 1-5.

[5] Narita D,Seclaman E,Ursoniu S,et al. Increased expression of ADAM12 and ADAM17 genes in laser-capture microdissected breast cancers and correlations with clinical and pathological characteristics[J]. Acta Histochem, 2012,114(2): 131-139.

[6] 呼鐵民, 孫影. ADAM17和EGFR在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2015, 31(8): 3-8.

[7] Giricz O, Calvo V, Peterson EA, et al. TACE-dependent TGFα shedding drives triple-negative breast cancer cell invasion[J]. Int J Cancer, 2013, 133(11): 2587-2595.

[8] Lee DC, Sunnarborg SW, Hinkle CL, et al. TACE/ADAM17 processing of EGFR ligands indicates a role as a physiological convertase[J]. Ann NY Acad Sci, 2003, 995: 22-38.

[9] Narita D, Seclaman E, Ursoniu S, et al. Increased expression of ADAM12 and ADAM17 genes in laser-capture microdissected breast cancers and correlations with clinical and pathological characteristics[J]. Acta Histochem, 2012, 114(2): 131-139.

[10] 盛英文, 胡寶山, 張雪鵬, 等. ADAM17和EMMPRIN在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 17(10): 1555-1559.

[11] Meng X,Hu B,Hossain MM,et al.ADAM17-siRNA inhibits MCF-7 breast cancer through EGFR-PI3K-AKT activation[J]. Int J Oncol, 2016,49(2): 682-690.

[12] 彭曉兵, 孫影, 張雪鵬, 等. 轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2015, 36(19): 2955-2958.

[13] 丁華, 孫影, 張雪鵬, 等. 轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2014, 35(14): 2154-2156.

Effects of shRNA-targeted ADAM17 gene on proliferation of human breast cancer cells MCF-7

CAI Zhun, CHEN Guo-fu, WU Li-jun, ZHANG Xue-peng, MENG Xiang-chao

(DepartmentofSurgicalOncology,AffiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effect of ADAM17-shRNA on the proliferation of human breast Cancer MCF-7cells by shRNA silence ADAM17 gene. Methods The specific ADAM17-shRNA,which was designed for ADAM17gene,They were transfected into MCF-7 cells by lipofectamine TM2000. Experiment groups were divided into control group(PBS), Interference group(was transfected with ADAM17-shNC) and experience group(was transfected with ADAM17-shRNA). ADAM17 mRNA expression were detected by Real-time PCR, The proliferative ability of MCF-7 cells were detected by MTT, Cell cycle distribution of MCF-7 cells was analyzed by FCM. Results The relative expression of ADAM17mRNA in experience group was significantly lower than control groups and interferencegroup.So the difference was statistically significant (P<0.05), the proliferation of MCF-7 cells in experiencegroup was significantly reduced than control groups and Interference group. So the difference was statistically significant (P<0.05), with experiencegroup, the proportion of MCF-7 cells into the S phase (23.60±1.09)% and G2/M phase (6.30±0.82)% was lowered, with the vast majority of cells remaining in the G0/G1phase (65.17±1.35)%. Compared with the control group and Interference group, so the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusions ADAM17-shRNA could effectively silence the expression of ADAM17 gene in human breast cancer MCF-7 cells, so that the proliferation of MCF-7 cells is inhibited and the cell cycle is delayed.

ADAM17; shRNA;breast cancer;proliferation

河北省自然科學(xué)基金項目(C2010001767);唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(14130256B);華北理工大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(2016S06)

蔡 準(zhǔn)(1986-)，男，浙江臺州人，碩士研究生。E-mail：caizhun1986317@163.com

張雪鵬，教授。E-mail：syzxp@sina.com

R737

A

1671-7295(2016)06-0542-04

蔡準(zhǔn)，陳國福，吳麗君，等.shRNA沉默ADAM17基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016,38(6)：542-545.

2016-09-04;

2016-10-31)