姜 博

謝 定1

鄭瑞娜1ZHENG Rui-na1

楊倩園1

謝艷萍2

盛 敏2

(1. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2. 湖南匯升生物科技有限公司，湖南 耒陽 421800)

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海藻糖合成酶基因工程菌玉米漿培養(yǎng)基配方優(yōu)化

姜 博1

謝 定1

鄭瑞娜1ZHENGRui-na1

楊倩園1

謝艷萍2

盛 敏2

(1. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2. 湖南匯升生物科技有限公司，湖南 耒陽 421800)

以玉米漿作為重組大腸桿菌培養(yǎng)基的主要碳源和氮源，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇玉米漿、MgSO4和微量元素3個因素對玉米漿培養(yǎng)基進行響應(yīng)面設(shè)計，采用Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法，確定基因工程菌最佳的玉米漿培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，最佳的玉米漿培養(yǎng)基配方為：玉米漿26 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7 mL/L。該條件下，重組大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶酶活達到120.5 U/mL。試驗證明了玉米漿作為重組大腸桿菌培養(yǎng)基唯一的碳源和氮源生產(chǎn)海藻糖合成酶的可行性。

玉米漿；海藻糖合成酶；重組大腸桿菌；培養(yǎng)基

海藻糖是由兩分子葡萄糖通過α，α-1，1糖苷鍵構(gòu)成的一種非還原性二糖[1]?；瘜W(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，高溫下不會發(fā)生美拉德褐變[2]。不僅如此，海藻糖在生物體內(nèi)既可以作為結(jié)構(gòu)成分，又能提供能量，是良好的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，以其優(yōu)良的抗逆保護作用而備受矚目[3-4]。

海藻糖的生產(chǎn)方法有天然生物提取法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、轉(zhuǎn)基因法和酶轉(zhuǎn)化法5大類[5]。其中酶轉(zhuǎn)化法合成海藻糖以淀粉、葡萄糖或麥芽糖等碳水化合物為底物，能有效降低生產(chǎn)成本，易于工業(yè)化生產(chǎn)而被廣泛關(guān)注。

利用重組大腸桿菌生產(chǎn)海藻糖合成酶，培養(yǎng)基的配方是影響成本的關(guān)鍵因素。目前，海藻糖合成酶基因工程菌多用酵母粉、甘油作為氮源，而工業(yè)級的酵母浸粉平均價格在4萬/t，成本較高。中國玉米種植面積排世界第二，玉米淀粉是玉米深加工的主要產(chǎn)品[6]。玉米浸泡水的量約是淀粉生產(chǎn)量的1.5倍，玉米漿就是將玉米浸泡水濃縮到固形物含量在50%～70%的產(chǎn)物，是玉米淀粉加工過程中的副產(chǎn)物[7]。中國玉米淀粉年產(chǎn)量約1 200萬t[8]。目前玉米漿的市場價格在1 000～3 000元/t，成本低廉，來源廣泛[9]。玉米漿中含有較多的蛋白質(zhì)、氨基酸、無機鹽和糖類等，營養(yǎng)豐富，已有青霉素的大規(guī)模生產(chǎn)用玉米漿作為培養(yǎng)基的報道[10]，但尚未見其用于海藻糖合成酶相關(guān)菌發(fā)酵培養(yǎng)的報道。

本研究以玉米漿為培養(yǎng)基的主要成分，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗對海藻糖合成酶基因工程菌玉米漿培養(yǎng)基進行優(yōu)化研究，嘗試用廉價的玉米漿替代酵母粉、甘油等成本較高的培養(yǎng)基成分進行海藻糖合成酶生產(chǎn)，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

海藻糖合成酶基因工程菌pET28(+)-BL21(DE3)：由本實驗室構(gòu)建和保藏；

Top10質(zhì)粒：含有灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因，長沙金斯瑞生物公司。

1.1.2 原料和培養(yǎng)基

玉米漿(干)：總氮含量5.3%，華北制藥康欣有限公司；

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：胰蛋白胨 10 g/L、氯化鈉 5 g/L、葡萄糖 1 g/L、酵母粉5 g/L，pH=7.0；

玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿 25 g/L、MgSO42.0 g/L、微量元素6.0 mL/L；

微量元素：FeSO4·7H2O 10 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·4H2O 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 2.25 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.23 g/L、CaCl22 g/L、(NH4)6Mo7O240.1 g/L 用5 mol/L濃鹽酸溶解并儲存于棕色試劑瓶中;

胰蛋白胨、酵母粉：生化試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

其他化學(xué)試劑均為國藥分析純。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

超聲波細胞粉碎機：SCIENTZ-ⅡD型，寧波新芝生物科技有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20AD型(RID-20A示差折光檢測器)，島津制作所；

電子天平：FA1004型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 冷凍保藏的菌種經(jīng)斜面活化后接入50 mL(含有終濃度為50 mmol/L的卡拉霉素)的種子培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，然后按5%的接種量接入100 mL(含有終濃度為50 mmol/L的卡拉霉素)的玉米漿培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時加入終濃度為0.5 mmol/L的乳糖作為誘導(dǎo)劑，在25 ℃，200 r/min誘導(dǎo)20 h。取發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，用pH=7.5的磷酸緩沖液洗滌兩次后重懸，冰浴超聲，超聲工作條件：功率300 W，工作3 s，間隔5 s，時間30 min。超聲破碎后8 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.2 酶活測定方法 粗酶液按體積比1∶20加入到10%用pH=7.5磷酸緩沖液配制的麥芽糖溶液中，35 ℃反應(yīng)30 min后沸水浴滅酶5 min，離心取上清液用HPLC法檢測海藻糖含量。

酶活力單位定義：上述反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1 U。

色譜條件：氨基柱(Agela Innoval NH2，5 μm，4.6×250 mm)；流動相：乙腈/水=80/20(體積比)；流速：1.0 mL/min；檢測器：視差折光檢測器；進樣量：10 μL；檢測池溫度：35 ℃。

1.2.3 玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1) 玉米漿濃度對海藻糖合成酶酶活的影響：在培養(yǎng)基其他條件不變的情況下設(shè)置不同的玉米漿濃度(5，10，15，20，25，30 g/L)37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6后加入乳糖誘導(dǎo)劑25 ℃，200 r/min誘導(dǎo)20 h制得粗酶液，然后測定酶活力。

(2) MgSO4濃度對海藻糖合成酶酶活的影響：在培養(yǎng)基其他條件不變的情況下設(shè)置不同的MgSO4濃度梯度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L)37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600約為0.6后加入乳糖誘導(dǎo)劑25 ℃，200 r/min誘導(dǎo)20 h制得粗酶液，然后測定酶活力。

(3) 微量元素濃度對海藻糖合成酶酶活的影響：在培養(yǎng)基其他條件不變的情況下設(shè)置不同的微量元素濃度梯度(2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL/L)37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600約為0.6后加入乳糖誘導(dǎo)劑25 ℃，200 r/min誘導(dǎo)20 h制得粗酶液，然后測定酶活力。

(4) 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基：在單因素的基礎(chǔ)上確定玉米漿、MgSO4和微量元素的最佳濃度，然后通過響應(yīng)面設(shè)計對最佳培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化以獲得最佳配比。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

“不以規(guī)矩，不成方圓”。這句古語很好地詮釋了規(guī)章制度的重要性。全面預(yù)算管理可以把“觸角”延伸到高校醫(yī)院各個部門的經(jīng)濟活動，必須有完善的規(guī)章制度保證。強化預(yù)算的執(zhí)行是實現(xiàn)全面預(yù)算管理的關(guān)鍵，而強化預(yù)算的執(zhí)行，必須以落實相應(yīng)的管理制度作為強有力的保障條件，例如編制高校醫(yī)院預(yù)算管理章程等，配備好相應(yīng)的軟硬件設(shè)備等。健全的全面預(yù)算管理制度是高校醫(yī)院完善內(nèi)部控制制度的集中體現(xiàn)，是高校醫(yī)院走向精細化管理的強力“助推器”。

由圖1～3可知，海藻糖合成酶酶活最高的培養(yǎng)基單因素組成和濃度為玉米漿25 g/L、MgSO42.0 g/L、微量元素6.0 mL/L。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化玉米漿培養(yǎng)基

在單因素的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以海藻糖合成酶酶活為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計三因素三水平試驗，共有15個試驗點，其中析因點有12個，零點有3個以估計誤差。因素水平見表1，試驗設(shè)計方案與響應(yīng)值結(jié)果見表2。

圖1 玉米漿濃度對海藻糖合成酶酶活的影響Figure 1 Effects of corn steep liquor concentrations on trehalose synthase activity

圖2 MgSO4濃度對海藻糖合成酶酶活的影響Figure 2 Effects of MgSO4 concentrations on trehalose synthase activity

圖3 微量元素濃度對海藻糖合成酶酶活的影響Figure 3 Effects of trace elements concentrations on trehalose synthase activity表1 Box-Behnken 因素水平Table 1 Box-Behnken factors and levels

水平A玉米漿/(g·L-1)BMgSO4/(g·L-1)C微量元素/(mL·L-1)-1201.54.00252.06.01302.58.0

表2 Box-Behnken 設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and response results

2.2.1 響應(yīng)面方差分析 利用 Design-Expert 8.0.6 對試驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合，對表2中的數(shù)據(jù)進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程為：

Y=120.00+5.07A+5.75B+3.43C-2.57AB-1.08AC-1.22BC-11.59A2-16.99B2-4.29C2。

(1)

對此模型進行方差分析見表3。

由表3可知，模型的P值為0.000 1<0.01，而失擬項P=0.341 6>0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占的比例小，表明響應(yīng)值Y與回歸方程的關(guān)系是極顯著的。從表3中還可以看出在此模型中A、B、C、AB、A2、B2、C2均顯著，AC、BC不顯著。

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Analysis of Variance in Regression Model

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05；-表示差異不顯著，P>0.05。

經(jīng)手動優(yōu)化后的回歸方程為：

Y=120.00+5.07A+5.75B+3.43C-2.57AB-11.59A2-16.99B2-4.29C2。

(2)

由表4可知，失擬項不顯著(P=0.338 7>0.05)，而模型的P值<0.000 1，表明模型高度顯著；同時軟件的復(fù)相關(guān)系數(shù)R的R2=0.986 4，校正后的R2(adj)=0.972 8，這表明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型可以對發(fā)酵產(chǎn)海藻糖合成酶進行分析和預(yù)測；從上面的結(jié)果可以看到，玉米漿、MgSO4和微量元素均是生產(chǎn)海藻糖合成酶的關(guān)鍵因素，其中玉米漿和MgSO4有較大程度的相互作用，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素對酶活影響的主次順序為：MgSO4>玉米漿>微量元素。

表4 去掉交互項AC和BC后的優(yōu)化結(jié)果?Table 4 Optimization results after removal of AC and BC

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

圖4為AB因素的三維響應(yīng)曲面圖和等高線圖。由圖4可知，在微量元素一定時，酶活隨著玉米漿和MgSO4濃度的增加都是先增后減，可以看出玉米漿和MgSO4的交互作用比較顯著，這與表4的結(jié)果一致。從AB兩因素的響應(yīng)面等高線圖可知，最大橢圓表示在該圓上取值，酶活最低，產(chǎn)量最小；而最小橢圓取值，酶活最高，產(chǎn)量最大。大小橢圓之間酶活逐漸遞進。

圖4 玉米漿和MgSO4對海藻糖合成酶活的影響Figure 4 Effects of corn steep liquor and MgSO4 on trehalose synthase activity

2.2.3 最佳條件的預(yù)測和驗證 通過Design-Expert 8.0.6軟件對經(jīng)手動優(yōu)化的二次回歸方程求解。響應(yīng)值Y物理意義是海藻糖合成酶酶活，因而優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為最大值，同時設(shè)置上限(響應(yīng)值的上限設(shè)置為不可能達到的數(shù)值用來確定最佳響應(yīng)值點，此次試驗響應(yīng)值最大上限設(shè))為200(200近似為麥芽糖完全轉(zhuǎn)化為海藻糖的理論極限酶活)，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方只有一種：玉米漿26.01 g/L，MgSO42.08 g/L，微量元素6.80 mL/L。預(yù)測酶活達到121.6 U/mL?？紤]到實際操作的可行性，對配方進行取整驗證，玉米漿26 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7 mL/L在此條件下進行3次驗證性實驗，測得海藻糖合成酶酶活平均值為120.5 U/mL，與理論值基本吻合，因此該模型可以較好地預(yù)測實際培養(yǎng)情況。

3 結(jié)論

試驗證明，Box-Behnken設(shè)計法能有效地篩選出重要影響因素并實現(xiàn)條件優(yōu)化。經(jīng)上述方法優(yōu)化，產(chǎn)海藻糖合成酶的玉米漿培養(yǎng)基配方為：玉米漿26 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7 mL/L。用最佳培養(yǎng)基配方培養(yǎng)重組大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶酶活力為120.5 U/mL，與響應(yīng)面分析值接近。由此可見，使用玉米漿作為重組大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶的培養(yǎng)基唯一碳源和氮源是可行的，而且玉米漿成本低廉，這就為使用玉米漿培養(yǎng)基進行大規(guī)模發(fā)酵提供了依據(jù)。

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Optimization ofcorn steep liquor medium for trehalose synthase gene engineering bacteria by response surface methodology

JIANG Bo1

XIEDing1

YANGQian-yuan1

XIEYan-ping2

SHENGMing2

(1.CollegeofChemistryandBioengineering,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China; 2.HunanHuishengBio-TechnologyCo.Ltd,Leiyang,Hunan421800,China)

Corn steep liquor was used as the sole carbon and nitrogen source for recombinantE.coliculture medium. Based on the single factor optimization, three factors of corn steep liquor, MgSO4and trace elements were chosen to design the response surface of corn steep liquor medium components. With Box-Behnhen experimental design and response surface analysis, the optimum components of corn steep liquor medium were determined. The results showed that the optimum medium components were 26 g/L for corn steep liquor, 2.1 g/L for MgSO4and 7 mL/L for trace elements. Under these conditions, the activity of trehalose synthase produced by recombinantE.colireached 120.5 U / mL. The experiment proved that this medium is feasible, in which corn steep liquor was the sole carbon and nitrogen source of trehalose synthase.

corn steep liquor; trehalose synthase; recombinantE.coli; medium

湖南省自然科學(xué)基金(編號：2015JJ2010)；衡陽市創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才團隊計劃(編號：2016)

姜博，男，長沙理工大學(xué)在讀碩士研究生。

謝定(1962-)，男，長沙理工大學(xué)教授，博士。 E-mail:cslg5148495@126.com

2016—09—24

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.042