游志清，郎紅梅，程 瑩，劉君靜，任 麗，萬(wàn) 勇，郭 蔚，李寧娜，艾智華

C肽對(duì)高糖下腎足細(xì)胞凋亡和腎病蛋白的影響

游志清，郎紅梅，程 瑩，劉君靜，任 麗，萬(wàn) 勇，郭 蔚，李寧娜，艾智華

目的探討C肽對(duì)高糖下腎足細(xì)胞凋亡和腎病蛋白的影響。方法將腎足細(xì)胞分成4組：對(duì)照組（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖，下同）、C肽組（高糖+C肽）、百日咳毒素（PTX）組（高糖+C肽+PTX），干預(yù)24 h后，Western blot檢測(cè)磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和mTOR蛋白，免疫熒光法檢測(cè)腎病蛋白，TUNEL一步法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡。結(jié)果5 nmol/L C肽即能顯著抑制高糖下足細(xì)胞mTOR的表達(dá)（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，高糖組PI3K、Akt和 mTOR表達(dá)顯著升高（P＜0.05），腎病蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01），足細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.01）；與高糖組相比，C肽能逆轉(zhuǎn)高糖所致的上述變化 （P＜0.01），而PTX能消除或減弱C肽的上述逆轉(zhuǎn)作用 （P＜0.05）。結(jié)論C肽可抑制高糖激活的足細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，并減少高糖所致的足細(xì)胞腎病蛋白減少和足細(xì)胞凋亡。

C肽；足細(xì)胞；雷帕霉素靶蛋白；腎病蛋白；凋亡

足細(xì)胞在腎小球?yàn)V過(guò)屏障和結(jié)構(gòu)完整性方面起到非常重要的作用，其受損是糖尿病腎病發(fā)生的重要啟動(dòng)因素[1]。足細(xì)胞內(nèi)mTOR活性的異常，可能是糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵因素[1-2]。在高糖刺激下，足細(xì)胞mTOR的活性明顯升高，導(dǎo)致腎小球肥大和基質(zhì)合成增加，后者又導(dǎo)致基底膜和系膜增厚[3]。在1型糖尿病患者及大鼠的腎小球足細(xì)胞內(nèi)，mTOR的活性明顯升高，并與尿白蛋白排泄呈明顯正相關(guān)[4]。PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路是經(jīng)典的調(diào)節(jié)mTOR活性的通路。越來(lái)越多的證據(jù)表明，C肽是具有生物學(xué)功能的肽，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，生理濃度范圍C肽能減輕1型糖尿病患者腎小球的高濾過(guò)狀態(tài)，減少尿白蛋白排泄[5-6]，但其機(jī)制尚未明了。因此，本研究旨在探討C肽是否對(duì)足細(xì)胞內(nèi) PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路有調(diào)控作用及其對(duì)足細(xì)胞腎病蛋白和凋亡的影響，以進(jìn)一步闡明C肽的腎保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑 小鼠腎足細(xì)胞（含tsSV40T序列）（江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，中國(guó)無(wú)錫）；胎牛血清（Hyclone，美國(guó))；青-鏈霉素雙抗(GIBCO，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó))；胰蛋白酶(Trypsin)(上海生工生物工程有限公司)；PI3K，Akt，mTOR多克隆抗體（santaz cruz，美國(guó)），兔抗nephrin多克隆抗體（博奧森，bs-10233），Alexa Flour 488標(biāo)記山羊抗兔抗體 （碧云天，A0423）；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）（碧云天）。人C肽（上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司）；百日咳毒素（EBZO，美國(guó)）；葡萄糖（上海生物工程有限公司）。

1.1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱 (TC2323型，SHELDON，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(XDS-1型，重慶光學(xué)儀器廠)；電子天平 (Shangping JA 21002，上海天平儀器廠)；凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；TE2000-U倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠腎足細(xì)胞用DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗)于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%左右時(shí)開(kāi)始傳代，經(jīng)3～5次傳代，將細(xì)胞以5000個(gè)/cm2的密度接種至玻片上，給予無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 梯度實(shí)驗(yàn) 將足細(xì)胞分為5組，分別是對(duì)照組(Cont組)（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖，下同）(HG組)、高糖+1 nmol/L C肽組(1 nMC肽組)、高糖+5 nmol/L C肽組(5 nMC肽組)和高糖+ 10 nmol/L C肽組(10 nMC肽組)。干預(yù)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mTOR，確定C肽的最適干預(yù)濃度為5 nmol/L（表1）。

1.2.3 干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將足細(xì)胞分為分為4組，Cont組（同上）、HG組（同上）、高糖+5 nmol/L C肽組(C肽組)和高糖+5 nmol/L C肽+100 ng/ml PTX組(PTX組)，干預(yù)時(shí)間均為24 h。干預(yù)結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)PI3K、Akt和mTOR蛋白水平，具體檢測(cè)方法參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶光密度值(OD值)，計(jì)算各蛋白條帶光密度值與內(nèi)參照GAPDH光密度值的比值。免疫熒光法檢測(cè)足細(xì)胞上nepherin蛋白，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在TE2000-U倒置熒光顯微鏡下觀察，用NISElements成像軟件照相和蛋白定量分析，以對(duì)照組的熒光值為1，計(jì)算其他組的熒光值與其的比值作為其蛋白定量值。

1.2.4 足細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用一步法TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，足細(xì)胞在玻片上生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出。倒去培養(yǎng)液，PBS洗滌1次。免疫染色固定液（碧云天）固定30 min。PBS洗滌一次。加入含有0.1%Trinton X-100的PBS，冰浴孵育2 min。配置TUNEL檢測(cè)液，充分混勻。PBS洗滌2次，在樣品上加50 μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min。用抗熒光淬滅封片液后，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad.Prism.v5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同條件下mTOR表達(dá) 5 nmol/L的C肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞mTOR表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 不同條件下mTOR的表達(dá)

2.2 不同條件下足細(xì)胞PI3K、Akt和mTOR腎病蛋白表達(dá)和凋亡 高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞PI3K、Akt和mTOR蛋白高表達(dá)，腎病蛋白表達(dá)下降，足細(xì)胞凋亡增加；C肽能逆轉(zhuǎn)高糖所致的上述變化 （P＜0.01），而PTX能消除或減弱C肽的上述逆轉(zhuǎn)作用 （P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1、2。

圖1 不同條件下足細(xì)胞PI3K、Akt和m TOR蛋白的表達(dá)

表2 不同條件下足細(xì)胞pI3K、Akt、mTOR、腎病蛋白表達(dá)和凋亡情況

圖2 不同條見(jiàn)下足細(xì)胞腎病蛋白表達(dá)和足細(xì)胞凋亡（白色箭頭指示）情況

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，5 nmol/L的C肽（生理濃度范圍內(nèi)）能抑制高糖誘導(dǎo)的腎足細(xì)胞mTOR表達(dá)增加，而再提高C肽濃度并不能增加這種抑制能力。PI3K、Akt處于PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的上游，是調(diào)節(jié)mTOR表達(dá)的重要路徑[7]。本研究結(jié)果顯示，高糖下，足細(xì)胞PI3K、Akt表達(dá)也增加，提示高糖是通過(guò)激活PI3K-Akt途徑，調(diào)節(jié)mTOR表達(dá)增加。還發(fā)現(xiàn)C肽也能抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞PI3K、Akt的高表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，PTX能阻斷C肽逆轉(zhuǎn)高糖下腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用[8]。因此，PTX被認(rèn)為是C肽的阻斷劑。本研究也觀察到，C肽抑制高糖誘導(dǎo)的腎足細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR高表達(dá)作用被PTX阻斷。因此，在高糖環(huán)境下，生理濃度C肽對(duì)PI3K-AktmTOR信號(hào)通路可能有抑制作用。

Inoki等[1]通過(guò)特異性敲除鼠足細(xì)胞mTOR復(fù)合體1基因上游的抑制性調(diào)節(jié)子后，鼠足細(xì)胞內(nèi)mTOR復(fù)合體1活性明顯升高，并復(fù)制出了糖尿病腎病的特征：足細(xì)胞丟失，腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增加和蛋白尿形成。提示足細(xì)胞mTOR復(fù)合體1活性升高與糖尿病腎病的發(fā)生密切相關(guān)。足細(xì)胞膜上的腎病蛋白是腎小球基底膜中裂孔膜的重要組成，主要分布在細(xì)胞膜表面，起作阻止蛋白濾過(guò)的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高糖下腎病蛋白表達(dá)顯著下降，提示高糖下腎小球基底膜上裂孔膜屏障受損。生理濃度C肽能逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)腎病蛋白的這種作用。同樣地，C肽的這種作用也被PTX阻斷，鼠足細(xì)胞內(nèi)mTOR復(fù)合體1被激活引起腎病蛋白表達(dá)顯著減少并移位[1]。因此，C肽逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對(duì)足細(xì)胞腎病蛋白表達(dá)的影響，可能與C肽抑制高糖誘導(dǎo)mTOR高表達(dá)有關(guān)。

同時(shí)，25 mmol/L葡萄糖刺激下，足細(xì)胞凋亡較5 mmol/L生理濃度葡萄糖刺激下明顯升高，而5 nmol/L的生理濃度C肽能顯著減少高糖刺激下的足細(xì)胞凋亡。同樣地，C肽逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的腎足細(xì)胞凋亡的這種作用也被PTX阻斷。Eid等[8]報(bào)道，高糖通過(guò)增加mTOR活性，促進(jìn)腎足細(xì)胞凋亡，推測(cè)C肽可能通過(guò)抑制高糖激活的PI3K-Akt-mTOR通路，減少足細(xì)胞凋亡。

綜上所述，高糖環(huán)境下，腎小球足細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR通路被激活，導(dǎo)致足細(xì)胞膜上的腎病蛋白表達(dá)下降，使腎小球基底膜中裂孔膜濾過(guò)屏障受損；同時(shí)，促進(jìn)腎足細(xì)胞凋亡，二者可能是引起蛋白尿的重要原因。但生理濃度的C肽能逆轉(zhuǎn)高糖的前述作用。因此，C肽在防治1型糖尿病腎病中可能具有重要作用。鑒于Akt及mTOR對(duì)于足細(xì)胞功能及存活影響的復(fù)雜性，還需進(jìn)一步研究，如觀察Akt或mTOR的磷酸化情況。

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Effects of C peptide on nephrin and apotosis in podocyte under high glucose

You Zhiqing,Lang Hongmei,Cheng Ying,Liu Junjing,Ren Li,Wan Yong,Guo Wei,Li Ningna,Ai Zhihua Department of Endocrinology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To explore the effects of C peptide on nephrin and apotosis in podocyte under high glucose.Methods Podocytes were divided into four groups:the control group (5 mmol/L glucose),the high glucose group (25 mmol/L glucose),the C peptide group(HG+C peptide),and the pertussis toxin(PTX)group(HG+C peptide+PTX).24 hours after the intervention,the levels of phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K),protein kinase B(Akt)and mTOR protein were detected by use of Western blotting method.The levels of nephropathy protein were detected by immunofluorescence.Podocyte apoptosis was detected by one-step method of TUNEL.Results5 nmol/L C peptide could significantly inhibit the expression of podocyte mTOR (P＜0.01).Compared with the control group,the levels of PI3K,Akt and mTOR in the high glucose group increased greatly (P＜0.05),the levels of nephropathy protein decreased significantly(P＜0.01),and podocyte apoptosis obviously increased (P＜0.01);compared with the high glucose group,C peptide could reverse the above changes caused by high glucose(P＜0.01),while PTX could eliminate or weaken the above reverse effect of C peptide(P＜0.05).ConclusionC peptide can inhibit the podocyte PI3K-Akt-mTOR signal channel activated by high glucose and lower the reduction of podocyte nephropathy protein and podocyte apoptosis.

Cpeptide;podocyte;mTOR;nephropathy protein;apotosis

R 692

A

1004-0188（2016）12-1413-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.017

2015-10-29）

四川省衛(wèi)生廳科研課題（120567）

610083成都 成都軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科