周 芳，王金祥，李自安，劉菊芬，白盈盈，楊建勇，朱光旭，潘興華

骨髓單個核細胞體外培養(yǎng)誘導分化為脂肪細胞

周 芳，王金祥，李自安，劉菊芬，白盈盈，楊建勇，朱光旭，潘興華

目的體外培養(yǎng)骨髓單個核細胞(BMNCs)，并觀察其成脂肪細胞分化能力。方法無菌取SD大鼠骨髓制作細胞懸液，差速貼壁法培養(yǎng)第三次貼壁細胞，傳代擴增，取3～5代細胞用于實驗。流式細胞分析檢測CD34、CD44、CD45、CD90、CD144 (VE-cadherin)和血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2(KDR)表達；STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit檢測細胞成脂肪分化能力。結(jié)果通過差速貼壁法可獲得相對單一的BMNCs，流式細胞分析表明培養(yǎng)的BMNCs細胞表達CD34、CD44、CD45及CD90等表面標志，但不表達CD144和KDR；在未經(jīng)誘導的情況下，培養(yǎng)的BMNCs能自發(fā)分化為脂肪細胞；培養(yǎng)BMNCs成脂肪細胞誘導后在第3、5、7 d，成脂率分別為（22.4±3.8）%、（55.6±11.4）%以及（82.4±17.7）%，顯著高于誘導培養(yǎng)第1 d[（1.3±1.1）%，P＜0.01]。結(jié)論骨髓單個核細胞體外培養(yǎng)后可以誘導分化為脂肪細胞。

骨髓單個核細胞；間充質(zhì)干細胞；脂肪細胞分化

人脂肪細胞在整個成年期都存在更新?lián)Q代，具有脂肪分化潛能的干、祖細胞的持續(xù)性供應對于維持脂肪生成極其重要。最新研究表明，骨髓源性干細胞（BBSCs）可參與脂肪生成。對于一般患者，BSCs對皮下脂肪細胞的貢獻率大約占10%，對于肥胖患者則可高達25%，證明至少在骨髓移植患者，骨髓可以被認為是脂肪前體細胞的儲存庫[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）可向脂肪細胞分化，然而其向脂肪細胞分化能力并不一致，甚至有文獻報道人原代培養(yǎng)的BMSC在體外誘導時，絕大部分細胞并不能分化為脂肪細胞[2]，因此，除了BMSCs外，骨髓內(nèi)其他細胞極可能也具有脂肪細胞分化潛能。本實驗利用差速貼壁法獲得相對單一的骨髓單個核細胞（BMNCs），經(jīng)體外培養(yǎng)后研究其成脂肪細胞分化能力，以期為脂肪生成和脂肪組織再生研究提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 昆明醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(滇)K2015-0002]提供的1～2月齡雄性SD大鼠。DMEM/F12干粉培養(yǎng)基 （Hyclone公司），STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit(Gibco)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清（PAA公司），內(nèi)皮生長因子添加劑（ECGs,Millipore），內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基 -2（EBM-2，Lonza），4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma），CO2培養(yǎng)箱 （Harris公司），流式細胞分析儀(FACScan, Becton Dickinson)，倒置熒光相差顯微鏡(Leica)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 脫臼處死1～2月齡雄性SD大鼠，無菌取髓制作細胞懸液，EBM-2培養(yǎng)基差速貼壁法培養(yǎng)第三次貼壁細胞，傳代擴增，取3～5代（P3）細胞用于實驗。

1.2.2 流式細胞分析 取P3細胞制作細胞懸液，與相應抗體混合，4℃孵育45 min，加入冷PBS 1 ml，洗滌2次，再加入冷PBS 500 μl，混勻，放入流式管中，4℃避光保存。對非直接熒光標記抗體，用冷PBS稀釋第一抗體，4℃孵育1.5 h，離心棄上清；加入第二抗體，4℃孵育避光30 min，將細胞重新懸浮于500 μl PBS中混勻，放入流式管中，4℃避光保存，用流式細胞分析儀檢測。

1.2.3 成脂肪細胞分化 收集P4細胞，接種到12孔板中，培養(yǎng)至細胞100%甚至過度融合時，棄培養(yǎng)液，加入成脂肪分化誘導液培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定，加入油紅O染色。為進行細胞成脂肪細胞百分率計算，采用DAPI標記細胞核，計算公式為：脂肪細胞百分率=（油紅O染色陽性細胞數(shù)÷細胞總數(shù))× 100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMNCs的體外培養(yǎng)及生長特征 由于骨髓內(nèi)不同細胞的貼壁時間和營養(yǎng)要求不同，因此，通過差速貼壁可以達到初步純化細胞的目的。應用DMEM/F12和EBM-2培養(yǎng)基分別培養(yǎng)第一次貼壁細胞（FACs)、第二次貼壁細胞（SACs）和第三次貼壁細胞（TACs），48 h后觀察培養(yǎng)細胞狀態(tài)，EBM-2培養(yǎng)的PACs（圖1A）密度明顯高于DMEM/F12培養(yǎng)組(圖1D)；DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的SACs見有少量形態(tài)已發(fā)生改變的細胞生長(圖1E)，而EBM-2培養(yǎng)組可見少量梭形細胞和大量形態(tài)尚未發(fā)生改變的細胞(圖1B)；對于TACs，EBM-2培養(yǎng)可見大量形態(tài)未發(fā)生改變的貼壁細胞 (圖1C)，DMEM/F12組幾乎未見貼壁生長細胞(圖1F)。TACs培養(yǎng)4～6 d(圖1G和H)，大量細胞形態(tài)發(fā)生改變，主要呈長三角形或“海蝦樣”形狀，至約第10 d，細胞呈融合生長狀態(tài)（圖1I)。

圖1 骨髓單個核細胞的體外培養(yǎng)以及生長特征

2.2 培養(yǎng)BMNCs表面標志表達分析 流式細胞分析表明，培養(yǎng)的BMNCs細胞CD34表達率為（86.6±6.7）%，CD44為（92.1±7.9）%，CD45為（88.4± 3.6）%，CD9為（81.3±7.8）%，幾乎不表達CD144(VE-cadherin)和血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2（VEGFR-2）(也稱KDR）（圖2）。

2.3 BMNCs向脂肪細胞誘導分化 在未經(jīng)誘導的情況下，BMNCs原代培養(yǎng)第4 d，發(fā)現(xiàn)少數(shù)培養(yǎng)的BMNCs疑似自發(fā)分化為脂肪細胞（圖3A和B）。在成脂肪細胞分化誘導的條件下，誘導培養(yǎng)第1 d，有少量脂肪細胞出現(xiàn)，在第3、5、7 d，BMNCs成脂率分別為（22.4±3.8）%、（55.6±11.4）%以及（82.4±17.7）%，顯著高于誘導培養(yǎng)第1 d（P＜0.01）。

圖2 細胞表面標志表達的流式細胞分析

圖3 培養(yǎng)的BMNCs向脂肪細胞誘導分化

3 討論

脂肪組織在人能量平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而成熟脂肪細胞不能通過有絲分裂增殖，增生是通過脂肪細胞前體細胞以及干、祖細胞分化得以實現(xiàn)[3]。既往研究顯示，BMSCs、脂肪干細胞以及一些脂肪前體細胞可分化為脂肪細胞，但是其能力并不一致。有文獻報道，人原代培養(yǎng)的BMSC在體外誘導時，絕大部分細胞并不能分化為脂肪細胞[2]，如果BMSCs并不是骨髓脂肪細胞的主要來源，那么骨髓內(nèi)就還存在其他可以分化為脂肪細胞的干、祖或前體脂肪細胞。

正常情況下骨髓內(nèi)含有BMSCs、造血干細胞（HSCs）、內(nèi)皮細胞等多種類型的細胞，采用差速貼壁法培養(yǎng)全骨髓，可獲得相對單一的 BMNCs[4]。EBM-2培養(yǎng)基可促進多種細胞生長；ECGs適合于低血清或無血清條件下刺激內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮祖細胞（EPCs）等細胞生長[5]。本實驗應用DMEM/F12和EBM-2培養(yǎng)基分別培養(yǎng)PACs、SACs、TACs，DMEM/F12培養(yǎng)的TACs基本上無細胞生長，而EBM-2培養(yǎng)下見大量細胞生長，表明TACs基本上排除了BMSCs、成纖維細胞等早期貼壁細胞的污染，獲得了相對單一的BMNCs。流式細胞分析表明，BMNCs表達CD34、CD44、CD45以及CD90等表面標志，這與文獻報道的MSCs表面標志表達有明顯區(qū)別，MSCs未見有CD34、CD45表達[6]，而本實驗培養(yǎng)的BMNCs CD34表達率高達（86.6±6.7）%。骨髓中，CD34是HSCs的主要標志，表明培養(yǎng)的BMNCs應由HSCs分化而來；CD45為典型的淋巴細胞標志，培養(yǎng)細胞CD45表達率為（88.4±3.6）%，提示BMNCs可能具有重要免疫學特性。由于文獻中常用EBM-2培養(yǎng)EPC，但是培養(yǎng)細胞不表達VE-cadherin和KDR這兩種比較典型的EPCs標志，表明該細胞和EPCs一樣來源于HSCs，但是具有不完全一樣的生物學特性。即使在未經(jīng)誘導情況下，BMNCs原代培養(yǎng)第4 d，也可以發(fā)現(xiàn)少數(shù)BMNCs疑似自發(fā)分化為脂肪細胞。成脂肪分化實驗表明，誘導后第7 d，成脂率高達（82.4±17.7）%，表明培養(yǎng)的BMNCs具有較高的成脂肪細胞分化能力。

目前關(guān)于脂肪分化的文獻多數(shù)聚焦于BMSCs、脂肪干細胞等的脂肪分化研究[7]，鮮見有對骨髓源性的其他類型細胞脂肪分化的報道，本實驗證實骨髓源性BMNCs可以分化為脂肪細胞，表明骨髓脂肪細胞除BMSCs外，尚存在其他重要來源，而且與MSCs的脂肪分化能力相比，BMNCs可能較BMSCs在脂肪增生中發(fā)揮更為主導的作用[2]，這為脂肪組織更新和增生的深入研究提供了部分新的實驗基礎(chǔ)。本實驗培養(yǎng)條件簡單，獲得的細胞具有極強的增殖和脂肪分化能力，并且可以傳代培養(yǎng)，因此，可能為脂肪分化相關(guān)研究提供一種較好的細胞模型。

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Differentiation of BMNCs cultivated in vitro into fat cells

Zhou Fang1,2,Wang Jinxiang1,Li Zi'an1,Liu Jufen1,Bai Yingying1,2,Yang Jianyong1,Zhu Guangxu1,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;2.Clinical College of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming Medical University,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the capacity of in vitro cultured bone marrow mononuclear cells(BMNCs)to differentiate into fat cells.MethodsThe bone marrow of SD rats was sampled in a sterile manner to prepare cell suspension.The third adherent cells were cultivated by differential adhesion method for passage and amplification.Passage three (P3)-passage five (P5)of the third adherent cells were used in the experiments.The expressions of CD34,CD44,CD45,CD90,CD144(VE-cadherin)and the vascular endothelial growth factor receptor-2(KDR)were detected by flow cytometry;the capacity of cells to differentiate into fat cells was detected by STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit.ResultsRelatively homogeneous BMNCs were obtained by differential adhesion method.Flow cytometry indicated that the cultured BMNCs cells expressed CD34,CD44,CD45 and CD90 while did not express CD144 and KDR.Even in the absence of adipocyte differentiation induction,the cultured BMNCs might be spontaneously differentiated into fat cells.On the 3rd,5th and 7th day since BMNCs were induced to fat cells,the fat cell percentages were(22.4± 3.8)%,(55.6±11.4)%and(82.4±17.7)%respectively,which were all significantly higher than that on the first day of induction culture [(1.3±1.1)%,P＜0.01].ConclusionBMNCs cultivated in vitro may be differentiated into fat cells.

BMNC;MSC;fat cell differentiation

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1382-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.009

2016-06-27）

國家自然科學基金（81170316）；國家科技支撐計劃項目（2014BI01B00）；云南省科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（20140810）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心,干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合實驗室，云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室（周 芳，王金祥，李自安，劉菊芬，白盈盈，楊建勇，朱光旭，潘興華）；昆明醫(yī)科大學成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學院（周 芳，白盈盈）

朱光旭：E-mail:zhguxu@aliyun.com;潘興華：E-mail: panxinghua@aliyun.com