王榮國 李凱強 章志堅 王強

山竹提取物對胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外實驗研究

王榮國 李凱強 章志堅 王強

目的 觀察山竹提取物（GME）對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖情況的影響，探討其作用機制。方法 采用新型四氮唑鹽法（MTS）檢測GME對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測GME對SGC-7901細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)活性氧（ROS）水平的影響；采用Western blot檢測不同濃度GME對BGC-7901細(xì)胞的PTEN、Bax、Bcl-2表達的影響。結(jié)果 GME顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖（P＜0.05），與陽性對照組5-氟尿嘧啶（5-FU）相比抑制率也較高（P＜0.05），其半數(shù)抑制濃度為：7.89μg/ml。經(jīng)5、7.5μg/ml的GME處理24h后，可有效促進SGC-7901細(xì)胞凋亡（P＜0.05），ROS水平的累積；GME相同方式處理后，SGC-7901細(xì)胞中PTEN和Bax的蛋白表達量上調(diào)，Bcl-2蛋白表達量降低（P＜0.05）。結(jié)論 GME能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞ROS水平的累積，并通過影響PTEN、Bax和Bcl-2蛋白的表達，促進其凋亡。

山竹提取物 增殖 胃癌 SGC-7901細(xì)胞

胃癌發(fā)病率極高，其病死率在所有癌癥中居第二[1]。目前，消化道惡性腫瘤的治療手段主要有手術(shù)、化療、放療、免疫、中藥治療等[2]。以胃癌為代表的消化道惡性腫瘤已成為我國主要的惡性腫瘤類型，因此，尋找安全、有效的新治療手段是迫切需要解決的問題。山竹又稱莽吉柿、鳳果、倒稔子，屬藤黃科藤黃屬，常用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、化膿、慢性潰瘍、淋病等疾病的治療[3]。本研究采用新型四氮唑鹽法（MTS）檢測山竹提取物（GME）組分對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞技術(shù)檢測GME組分對SGC-7901細(xì)胞凋亡和活性氧（ROS）的影響Western bolt技術(shù)檢測GME組分對SGC-7901細(xì)胞中PTEN、Bax和Bcl-2表達的影響，從而探索GME是否影響胃癌SGC-7901細(xì)胞及其影響機制。

1 資料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌SGC-7901細(xì)胞系（由浙江省人民醫(yī)院胃腸道重點實驗室贈送）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國invitrogen公司）中，在37℃、飽和濕度、含5%CO2、100U/ml青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48～72h傳代，采用0.25%胰酶消化，1∶3傳代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行進一步實驗研究。

1.2 MTS檢測法 GME經(jīng)萃取和色譜分離（由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院純化和贈送）。將GME溶于二甲基亞砜（DMSO）配成高濃度的儲存液，分別使用1、1.25、2.5、5、10、20μg/ml的GME處理SGC-7901細(xì)胞24h，陽性對照組采用8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）；采用MTS檢測不同濃度GME對體外培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，并根據(jù)吸光度（OD）值計算細(xì)胞增殖抑制率作圖得到劑量-效應(yīng)圖譜[2]。實驗重復(fù)3次，取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS水平和凋亡 分別使用0.10%DMSO、5μg/ml和7.5μg/ml GME處理SGC-7901細(xì)胞24h，使用流式細(xì)胞術(shù)（美國BD公司）檢測3組SGC-7901細(xì)胞ROS和凋亡的差異[3]。

1.4 Western blot檢測 分別使用0.10%DMSO、5μg/ ml和7.5μg/ml的GME處理SGC-7901細(xì)胞24h，抽提總蛋白（中國碧云天公司），定量后，10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，蛋白上樣量為30μg，半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜30min，含5%脫脂奶粉的TBST（tris-Buffered saline Tween-20）室溫封閉2h；用1%含脫脂奶粉的TBST稀釋PTEN（美國Cell Signaling Technology公司），Bax（美國invitrogen公司），Bcl-2（美國invitrogen公司），β-actin（中國中杉金橋公司），4℃過夜，1×TBST洗3遍，二抗（中國中杉金橋公司）孵育2h，1×TBST洗3遍，使用ECL工作液與膜充分接觸（約1min），使用Bio-rad化學(xué)成像系統(tǒng)顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prizm 5統(tǒng)計軟件，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 GME抑制細(xì)胞增殖的MTS實驗 GME的SGC-7901的IC50值為為7.89μg/ml。與0μg/ml MTE組比較，1.25、2.5、5、10和20μg/ml MTE和陽性對照組（5-FU)對C6細(xì)胞增殖抑制率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且隨MTE組分濃度的升高其抑制率增強（表1）。

表1 GME不同濃度對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

2.2 GME對SGC-7901細(xì)胞ROS的影響 5μg/ml和7.5μg/ml GME處理SGC-7901細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS水平發(fā)現(xiàn)，GME能夠促進SGC-7901細(xì)胞ROS水平的累積（圖1）。

圖1 GME對SGC-7901細(xì)胞ROS水平的影響

2.3 GME對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 5μg/ml和7.5μg/ml GME處理24h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明DMSO對照組、5μg/ml和7.5μg/ml GME組的凋亡率分別為（1.08±0.17）%，（2.47±0.52）%，（11.11± 3.35）%；與DMSO對照組比較，7.5 μg/ml GME組凋亡差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2），GME組的凋亡率隨著GME濃度提高而提高（P＜0.05）。

2.4 GME影響PTEN、Bax和Bcl-2的蛋白表達 經(jīng)5、7.5μg/ml GME處理后，SGC-7901細(xì)胞的PTEN和Bax蛋白表達量提高；Bcl-2蛋白的表達量減低（均P＜0.05）（圖3）。

3 討論

山竹是一類藤黃屬植物，具有清熱、解毒之效，既往常用于泌尿系統(tǒng)疾病的應(yīng)用。近年來，有學(xué)者提出，藤黃酸在免疫調(diào)節(jié)、敗毒抗癌中的功效有望應(yīng)用于各類惡性腫瘤的治療，已經(jīng)進入臨床Ⅱa期研究階段，是藤黃的抗腫瘤活性成分之一[4]。然而，目前關(guān)于山竹對于癌細(xì)胞的作用機制研究尚不深入。故本研究中，采用GME在體外實驗中研究它們對胃癌SGC-7901凋亡有無促進作用，期望為今后開發(fā)治療腫瘤藥物奠定實驗基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用自己提純的GME對SGC-7901研究發(fā)現(xiàn)，GME對SGC-7901細(xì)胞的IC50顯著低于陽性對照，且隨著時間、濃度的提高，對SGC-7901細(xì)胞抑制增殖能力越強。進一步研究發(fā)現(xiàn)，GME處理后，SGC-7901細(xì)胞ROS水平顯著提高，且隨著濃度的提高凋亡加劇。在Western實驗中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)GME處理后SGC-7901細(xì)胞的PTEN和Bax蛋白表達量顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達水平顯著下調(diào)。眾所周知，PTEN同時具有脂質(zhì)和蛋白雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑癌基因，該基因的編碼蛋白脂質(zhì)磷酸酶的活性對細(xì)胞周期阻滯和調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的作用，其突變的高表達可以抑制細(xì)胞的遷移和黏附功能[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，癌基因Bcl-2的過表達會抑制細(xì)胞凋亡，促進腫瘤的增殖[7]，其家族的Bax與其相對立，Bax的表達量提高，阻礙腫瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化[8]。此外，Park等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的ROS水平提高會導(dǎo)致Bax異位到線粒體，從而影響線粒體膜電位，激活Caspase3，Caspase9和PARP，隨后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過促進PTEN和Bax蛋白表達，抑制Bcl-2蛋白，促進ROS的發(fā)生這一結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測凋亡現(xiàn)象一致，進一步明確了GME對胃癌SGC-7901抑制增殖的作用機制。因此，尋找有效的治療藥物在抑制腫瘤形成，降低其生長速度從而改善患者預(yù)后具有重要的意義。

圖2 GME對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響（a：DMSO對照組，b：5μg/ml GME組，c：7.5μg/ml GME組）

圖3 GME對SGC-7901細(xì)胞PTEN、Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響

綜上所述，山竹制劑能夠明顯影響SGC-7901細(xì)胞PTEN、Bax和Bcl-2的表達，提示山竹制劑將有可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化，促進細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的目的。該研究對于篩選有益的傳統(tǒng)中藥抗癌成分，豐富中藥的藥理理論具有重要的意義，對今后科學(xué)提取和使用藤黃屬類抗腫瘤活性成分具有指導(dǎo)價值，有待更深入的研究。

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Effect of Garcinia mangostana extract on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells in vitro

WANG Rongguo,LI Kaiqiang, ZHANG Zhijian,et al.Department of Gastrointestinal Surgery Surgery,Taizhou First People's Hospital,Taizhou 318020,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Garcinia mangostana Extract(GME)on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells. Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells were treated with 5μg/ml and 7.5μg/ml GME for 24h. SGC-7901 cell proliferation was determined by tetrazolium salt reduction method (MTS),cell apoptosis and reactive oxygen species(ROS)were measured by flow cytometry,PTEN,Bax and Bcl-2 protein expressions in SGC-7901 cells were detected by Western blot.Results GME significantly inhibited the proliferation ofSGC-7901 cells(P＜0.05)with a 50%inhibitory concentrations of 7.89μg/ml,the inhibition rate was higher than that of 5-fluorouracil(5-FU)(P＜0.05).After treated with 5 μg/ml and 7.5μg/ml of GME for24h,apoptosis ofSGC-7901 cells was increased(P＜0.05),and the cellROS levels was also increased;the expressions of PTEN and Bax proteins in SGC-7901 cells were increased,while Bcl-2 expression levels were reduced(P＜0.05). Conclusion This study suggests that GME can significantly inhibit proliferation ofSGC-7901 cells,enhance ROS levels,and promote apoptosis ofSGC-7901 cells,which is associated with up-regulation ofPTEN,Bax and down-regulation ofBcl-2 expression.

Garcinia mangostana extractProliferation Gastric cancer SGC-7901 cellline

2015-12-25）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金（2014ZQ005）

318020 臺州市第一人民醫(yī)院胃腸外科（王榮國、章志堅、王強）；浙江省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心（李凱強）

王榮國，E-mail：s753456@163.com