王榮國 李凱強 章志堅 王強
山竹提取物對胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外實驗研究
王榮國 李凱強 章志堅 王強
目的 觀察山竹提取物(GME)對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖情況的影響,探討其作用機制。方法 采用新型四氮唑鹽法(MTS)檢測GME對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測GME對SGC-7901細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)活性氧(ROS)水平的影響;采用Western blot檢測不同濃度GME對BGC-7901細(xì)胞的PTEN、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果 GME顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖(P<0.05),與陽性對照組5-氟尿嘧啶(5-FU)相比抑制率也較高(P<0.05),其半數(shù)抑制濃度為:7.89μg/ml。經(jīng)5、7.5μg/ml的GME處理24h后,可有效促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡(P<0.05),ROS水平的累積;GME相同方式處理后,SGC-7901細(xì)胞中PTEN和Bax的蛋白表達(dá)量上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。結(jié)論 GME能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖,能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞ROS水平的累積,并通過影響PTEN、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá),促進(jìn)其凋亡。
山竹提取物 增殖 胃癌 SGC-7901細(xì)胞
胃癌發(fā)病率極高,其病死率在所有癌癥中居第二[1]。目前,消化道惡性腫瘤的治療手段主要有手術(shù)、化療、放療、免疫、中藥治療等[2]。以胃癌為代表的消化道惡性腫瘤已成為我國主要的惡性腫瘤類型,因此,尋找安全、有效的新治療手段是迫切需要解決的問題。山竹又稱莽吉柿、鳳果、倒稔子,屬藤黃科藤黃屬,常用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、化膿、慢性潰瘍、淋病等疾病的治療[3]。本研究采用新型四氮唑鹽法(MTS)檢測山竹提取物(GME)組分對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率,流式細(xì)胞技術(shù)檢測GME組分對SGC-7901細(xì)胞凋亡和活性氧(ROS)的影響Western bolt技術(shù)檢測GME組分對SGC-7901細(xì)胞中PTEN、Bax和Bcl-2表達(dá)的影響,從而探索GME是否影響胃癌SGC-7901細(xì)胞及其影響機制。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌SGC-7901細(xì)胞系(由浙江省人民醫(yī)院胃腸道重點實驗室贈送)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國invitrogen公司)中,在37℃、飽和濕度、含5%CO2、100U/ml青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48~72h傳代,采用0.25%胰酶消化,1∶3傳代后,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實驗研究。
1.2 MTS檢測法 GME經(jīng)萃取和色譜分離(由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院純化和贈送)。將GME溶于二甲基亞砜(DMSO)配成高濃度的儲存液,分別使用1、1.25、2.5、5、10、20μg/ml的GME處理SGC-7901細(xì)胞24h,陽性對照組采用8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶(5-FU);采用MTS檢測不同濃度GME對體外培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響,并根據(jù)吸光度(OD)值計算細(xì)胞增殖抑制率作圖得到劑量-效應(yīng)圖譜[2]。實驗重復(fù)3次,取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值。
1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS水平和凋亡 分別使用0.10%DMSO、5μg/ml和7.5μg/ml GME處理SGC-7901細(xì)胞24h,使用流式細(xì)胞術(shù)(美國BD公司)檢測3組SGC-7901細(xì)胞ROS和凋亡的差異[3]。
1.4 Western blot檢測 分別使用0.10%DMSO、5μg/ ml和7.5μg/ml的GME處理SGC-7901細(xì)胞24h,抽提總蛋白(中國碧云天公司),定量后,10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,蛋白上樣量為30μg,半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜30min,含5%脫脂奶粉的TBST(tris-Buffered saline Tween-20)室溫封閉2h;用1%含脫脂奶粉的TBST稀釋PTEN(美國Cell Signaling Technology公司),Bax(美國invitrogen公司),Bcl-2(美國invitrogen公司),β-actin(中國中杉金橋公司),4℃過夜,1×TBST洗3遍,二抗(中國中杉金橋公司)孵育2h,1×TBST洗3遍,使用ECL工作液與膜充分接觸(約1min),使用Bio-rad化學(xué)成像系統(tǒng)顯影。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prizm 5統(tǒng)計軟件,并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。計量資料以表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。
2.1 GME抑制細(xì)胞增殖的MTS實驗 GME的SGC-7901的IC50值為為7.89μg/ml。與0μg/ml MTE組比較,1.25、2.5、5、10和20μg/ml MTE和陽性對照組(5-FU)對C6細(xì)胞增殖抑制率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),且隨MTE組分濃度的升高其抑制率增強(表1)。
表1 GME不同濃度對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響
2.2 GME對SGC-7901細(xì)胞ROS的影響 5μg/ml和7.5μg/ml GME處理SGC-7901細(xì)胞24h后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS水平發(fā)現(xiàn),GME能夠促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞ROS水平的累積(圖1)。
圖1 GME對SGC-7901細(xì)胞ROS水平的影響
2.3 GME對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 5μg/ml和7.5μg/ml GME處理24h后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明DMSO對照組、5μg/ml和7.5μg/ml GME組的凋亡率分別為(1.08±0.17)%,(2.47±0.52)%,(11.11± 3.35)%;與DMSO對照組比較,7.5 μg/ml GME組凋亡差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2),GME組的凋亡率隨著GME濃度提高而提高(P<0.05)。
2.4 GME影響PTEN、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá) 經(jīng)5、7.5μg/ml GME處理后,SGC-7901細(xì)胞的PTEN和Bax蛋白表達(dá)量提高;Bcl-2蛋白的表達(dá)量減低(均P<0.05)(圖3)。
山竹是一類藤黃屬植物,具有清熱、解毒之效,既往常用于泌尿系統(tǒng)疾病的應(yīng)用。近年來,有學(xué)者提出,藤黃酸在免疫調(diào)節(jié)、敗毒抗癌中的功效有望應(yīng)用于各類惡性腫瘤的治療,已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱa期研究階段,是藤黃的抗腫瘤活性成分之一[4]。然而,目前關(guān)于山竹對于癌細(xì)胞的作用機制研究尚不深入。故本研究中,采用GME在體外實驗中研究它們對胃癌SGC-7901凋亡有無促進(jìn)作用,期望為今后開發(fā)治療腫瘤藥物奠定實驗基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用自己提純的GME對SGC-7901研究發(fā)現(xiàn),GME對SGC-7901細(xì)胞的IC50顯著低于陽性對照,且隨著時間、濃度的提高,對SGC-7901細(xì)胞抑制增殖能力越強。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),GME處理后,SGC-7901細(xì)胞ROS水平顯著提高,且隨著濃度的提高凋亡加劇。在Western實驗中,發(fā)現(xiàn)經(jīng)GME處理后SGC-7901細(xì)胞的PTEN和Bax蛋白表達(dá)量顯著上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。眾所周知,PTEN同時具有脂質(zhì)和蛋白雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑癌基因,該基因的編碼蛋白脂質(zhì)磷酸酶的活性對細(xì)胞周期阻滯和調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的作用,其突變的高表達(dá)可以抑制細(xì)胞的遷移和黏附功能[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),癌基因Bcl-2的過表達(dá)會抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤的增殖[7],其家族的Bax與其相對立,Bax的表達(dá)量提高,阻礙腫瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化[8]。此外,Park等[9]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的ROS水平提高會導(dǎo)致Bax異位到線粒體,從而影響線粒體膜電位,激活Caspase3,Caspase9和PARP,隨后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過促進(jìn)PTEN和Bax蛋白表達(dá),抑制Bcl-2蛋白,促進(jìn)ROS的發(fā)生這一結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測凋亡現(xiàn)象一致,進(jìn)一步明確了GME對胃癌SGC-7901抑制增殖的作用機制。因此,尋找有效的治療藥物在抑制腫瘤形成,降低其生長速度從而改善患者預(yù)后具有重要的意義。
圖2 GME對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響(a:DMSO對照組,b:5μg/ml GME組,c:7.5μg/ml GME組)
圖3 GME對SGC-7901細(xì)胞PTEN、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響
綜上所述,山竹制劑能夠明顯影響SGC-7901細(xì)胞PTEN、Bax和Bcl-2的表達(dá),提示山竹制劑將有可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的目的。該研究對于篩選有益的傳統(tǒng)中藥抗癌成分,豐富中藥的藥理理論具有重要的意義,對今后科學(xué)提取和使用藤黃屬類抗腫瘤活性成分具有指導(dǎo)價值,有待更深入的研究。
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Effect of Garcinia mangostana extract on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells in vitro
WANG Rongguo,LI Kaiqiang, ZHANG Zhijian,et al.Department of Gastrointestinal Surgery Surgery,Taizhou First People's Hospital,Taizhou 318020,China
【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Garcinia mangostana Extract(GME)on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells. Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells were treated with 5μg/ml and 7.5μg/ml GME for 24h. SGC-7901 cell proliferation was determined by tetrazolium salt reduction method (MTS),cell apoptosis and reactive oxygen species(ROS)were measured by flow cytometry,PTEN,Bax and Bcl-2 protein expressions in SGC-7901 cells were detected by Western blot.Results GME significantly inhibited the proliferation ofSGC-7901 cells(P<0.05)with a 50%inhibitory concentrations of 7.89μg/ml,the inhibition rate was higher than that of 5-fluorouracil(5-FU)(P<0.05).After treated with 5 μg/ml and 7.5μg/ml of GME for24h,apoptosis ofSGC-7901 cells was increased(P<0.05),and the cellROS levels was also increased;the expressions of PTEN and Bax proteins in SGC-7901 cells were increased,while Bcl-2 expression levels were reduced(P<0.05). Conclusion This study suggests that GME can significantly inhibit proliferation ofSGC-7901 cells,enhance ROS levels,and promote apoptosis ofSGC-7901 cells,which is associated with up-regulation ofPTEN,Bax and down-regulation ofBcl-2 expression.
Garcinia mangostana extractProliferation Gastric cancer SGC-7901 cellline
2015-12-25)
(本文編輯:田云鵬)
浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金(2014ZQ005)
318020 臺州市第一人民醫(yī)院胃腸外科(王榮國、章志堅、王強);浙江省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心(李凱強)
王榮國,E-mail:s753456@163.com