劉龍斌 孟立平 季政 許富康 池菊芳 郭航遠(yuǎn)

黃酒多酚對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞MMP-2/9表達(dá)與活性的影響

劉龍斌 孟立平 季政 許富康 池菊芳 郭航遠(yuǎn)

目的 探討黃酒多酚（YWPC）對(duì)同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)和活性的影響及其信號(hào)通路。方法 SD大鼠主動(dòng)脈VSMCs原代細(xì)胞培養(yǎng)鑒定，取4～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。YWPC組VSMCs分別用1、10、100mg/L的YWPC干預(yù)，采用Western blot法檢測(cè)VSMCs中MMP-2、MMP-9、AKT、pAKT的表達(dá)情況；明膠酶譜檢測(cè)VSMCs中MMP-2和MMP-9的活性。用IGF-1（3ng/ml）干預(yù)VSMCs 8 h激活PI3K/AKT通路后，用YWPC干預(yù)VSMCs，檢測(cè)MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，與Hcy組比較，YWPC組VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)減少，pAKT表達(dá)減少（均P＜0.01）；明膠酶譜結(jié)果顯示，與Hcy組比較，YWPC組VSMCs中MMP-2/9的活性降低。在加入IGF-1后,與對(duì)照組比較，IGF-1組VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表達(dá)和活性增加（P＜0.01）；與YWPC組比較，YWPC+IGF-1組VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表達(dá)和活性增加（P＜0.01）。結(jié)論 YWPC通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性。

血管平滑肌細(xì)胞 黃酒多酚 PI3K/AKT 基質(zhì)金屬蛋白酶

黃酒采用紅粬、糯米和水為原料，人工自然發(fā)酵釀制而成?，F(xiàn)已證實(shí)黃酒中含有豐富的多酚、氨基酸、多肽、維生素、低聚糖、有機(jī)酸以及礦物質(zhì)等有益于心腦血管健康的成分[1]。我們過(guò)去的研究已經(jīng)證實(shí)黃酒不但可以抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖和遷移，而且可以抑制LDLR-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成[2-4]。大量的研究證實(shí)規(guī)律適量的飲用紅酒具有心血管保護(hù)作用[5-6]，并且已經(jīng)闡明紅酒的心血管保護(hù)作用主要緣于其中的多酚類成分[7]。我們推測(cè)，黃酒主要也是通過(guò)多酚類物質(zhì)發(fā)揮其心腦血管保護(hù)作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)的平衡，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[8-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究黃酒多酚（YWPC）抑制同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)的VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)以及是否通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)這一作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，60d左右，體重150～180g；遺傳背景為C57BL/6J 10代后雄性LDLR-/-小鼠（購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。YWPC由上海中藥制藥技術(shù)有限公司分離提取，純度約60%；乙醚、甲醇、75%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、甲醇購(gòu)自杭州化學(xué)試劑有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉素購(gòu)自杭州吉諾公司；Hcy、雷帕霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司，F(xiàn)BS購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Emresco公司；DAPI購(gòu)自瑞士Rcohe公司；兔抗akt、p-pakt多克隆抗體、兔抗大鼠SM-actin單克隆抗體、兔抗MMP-2/ 9、明膠購(gòu)自美國(guó)ABCOM公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IGg購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；蛋白免疫印跡以及明膠酶譜相關(guān)試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定采用組織貼塊法培育大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)平滑肌肌動(dòng)蛋白（SM-actin）鑒定VSMCs，通過(guò)SM-actin與DAPI核染之間的關(guān)系鑒定VSMCs的純度[11]。取第4～7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞加干預(yù)因素時(shí)用含2.5%FBS的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為2部分，第1部分用以驗(yàn)證YWPC對(duì)VSMCs中MMP-2/9表達(dá)和活性的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、Hcy組、YWPC1mg/L組、YWPC 10mg/L組及YWPC 100mg/L組，除對(duì)照組外所有細(xì)胞先用500 μmol/L Hcy干預(yù)12h，再用不同濃度的YWPC干預(yù)VSMCs。第2部分實(shí)驗(yàn)用以驗(yàn)證YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9表達(dá)和活性的機(jī)制，VSMCs分為對(duì)照組、IGF-1（3ng/ml）組、YWPC（10mg/L）組和YWPC+IGF-1組。

1.2.2 Western blot測(cè)定 VSMCs中 MMP-2/9、AKT/ pAKT的表達(dá) 在用不同濃度的YWPC干預(yù)48h之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE膠每孔加入20μl樣品，80V 30min進(jìn)行蛋白濃聚，120V 2h進(jìn)行凝膠電泳，并用孔徑0.45μm硝酸纖維素膜250mA 90min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢經(jīng)常溫下TBST洗膜×3、脫脂奶粉封閉2h后，以1∶1 000濃度加入兔抗鼠MMP-2一抗（或抗MMP-9、AKT/pAKT一抗），4℃孵育過(guò)夜，常溫下TBST洗膜×3，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白。暗室柯達(dá)膠片顯影，Quantity one軟件定量分析。

1.2.3 明膠酶譜法測(cè)定VSMCs中MMP-2/9的活性取20μl各組蛋白樣品在含1μg/ml明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠片上電泳,待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，在室溫下用含2.5%Triton X-100洗滌緩沖液平搖洗滌30min× 2；37℃搖床平搖孵育緩沖液（pH8.8，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2）。然后凝膠染色2 h（含0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液，10%冰乙酸，45%甲醇溶液，45%去離子水），脫色（10%冰乙酸，45%甲醇溶液，去離子水45%）直到藍(lán)色背景下出現(xiàn)白色條帶，即為MMP-2/9，用雙蒸水沖洗終止脫色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，用Quantity One軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，8d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，2周后細(xì)胞融合可以傳代。傳代后細(xì)胞呈典型“峰谷”狀排列生長(zhǎng)，用SM-actin細(xì)胞免疫熒光鑒定VSMCs，DAPI核染之后確定細(xì)胞純度在99%以上，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈VSMCs形態(tài)學(xué)及細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果（A：VSMCs呈典型的“峰谷”樣生長(zhǎng)，×100；B：免疫熒光結(jié)果顯示SM-actin在細(xì)胞中高表達(dá)，×400）。

2.2 兩種方法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá) 見(jiàn)圖2、3，表1、2。

由圖2、3，表1、2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，Hcy組VSMCs中 MMP-2/9的表達(dá)均升高（均 P＜0.05）。Western blot法中，與Hcy組比較，YWPC不同濃度組VSMCs中MMP-2的表達(dá)均減少（P＜0.05或0.01），YWPC 10mg/L組、YWPC 100mg/L組VSMCs中MMP-9的表達(dá)均減少（P＜0.05或0.01）；明膠酶譜法中，與Hcy組比較，YWPC不同濃度組VSMCs中MMP-9的表達(dá)均減少（P＜0.05或0.01），YWPC 10mg/L組、YWPC 100mg/L組VSMCs中MMP-2的表達(dá)均減少（P＜0.05或0.01）。各組VSMCs中AKT的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與對(duì)照組比較，Hcy組VSMCs中pAKT的表達(dá)升高（P＜0.05）；與Hcy比較，YWPC各濃度組VSMCs中pAKT的表達(dá)均減少（P＜0.05或0.01）。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表達(dá)電泳圖

表1 Western blot法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表達(dá)

圖3 明膠酶譜法檢測(cè)各組MMP-2/9的表達(dá)電泳圖

表2 明膠酶譜法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)

2.3 兩種方法檢測(cè)IGF-1預(yù)處理后各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá) 見(jiàn)圖4、5，表3、4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá)電泳圖

表3 Western blot檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá)

圖5 明膠酶譜法檢測(cè)各組MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá)電泳圖

表4 明膠酶譜法檢測(cè)各組MMP-2/9的表達(dá)

由圖4、5，表3、4可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，YWPC組VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)均降低（均P＜0.05）；與YWPC組比較，YWPC+IGF-1組中MMP-2/9的表達(dá)均增加（均P＜0.05）。各組VSMCs中AKT的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，YWPC組VSMCs中pAKT的表達(dá)降低（P＜0.05）；與YWPC組比較，YWPC+ IGF-1組VSMCs中pAKT的表達(dá)增加（P＜0.05）。

3 討論

紅酒多酚由白藜蘆醇、兒茶素、花青素等組成，通過(guò)調(diào)節(jié)血脂、改善血管功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等作用而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。我們過(guò)去的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明YWPC具有抑制LDL受體基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用，然而其抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制尚未闡明[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)了YWPC可以通過(guò)抑制PIK/AKT通路來(lái)抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性，這可能是其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制之一。

MMPs的過(guò)度分泌和激活可以導(dǎo)致粥樣斑塊的纖維帽降解破裂、增加局部的炎癥反應(yīng)[13]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)MMPs除了降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用之外，還可以通過(guò)降解細(xì)胞間黏附分子、誘導(dǎo)細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子、激活其他的MMPs等路徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，從而在血管重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[13]。自從Oak等[14]發(fā)現(xiàn)紅酒多酚主要通過(guò)降低MMP-2的表達(dá)和活性從而發(fā)揮抑制VSMCs增殖和遷移的作用，后續(xù)研究基本證實(shí)抑制MMP-2/9的表達(dá)和活性是紅酒多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制之一[15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明YWPC不僅可以抑制VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)，還可以抑制MMP-2/9的活性。這可能是黃酒發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制之一。

PIk/AKT通路在VSMCs增殖和遷移以及表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用[16]，pAKT可以進(jìn)一步激活mTOR/ P70S6K通路，增加p-P70S6K1的表達(dá)，最終增加VSMCs的增殖和遷移[17]。本研究表明YWPC可以抑制PI3K/ AKT通路，減少pAKT的表達(dá)。以上結(jié)果提示YWPC可能是經(jīng)PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2的表達(dá)和活性。IGF-1是PI3K的激動(dòng)劑，可以激活PI3K，增加pAKT的表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)中，在加入IGF-1（3ng/ml）之后，YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性的作用被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí)YWPC是經(jīng)PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性。

本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性，黃酒中的多酚類物質(zhì)是由不同的單體成分組成的混合物，究竟是其中的何種確切成分在發(fā)揮作用我們尚不清楚。

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Yellow wine polyphenol compounds inhibit homocysteine-induced expression of MMP-2/9 in vascular smooth muscle cells through inhibiting PI3K/AKT pathway

LIU Longbin,MENG Liping,JI Zheng,et al.Department of Cardiology,Shaoxing People's Hospital, Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect ofyellow wine polyphenolcompounds(YWPC)on expression ofMMP-2/9 in rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMCs)induced by homocysteine(Hcy)and its mechanism. Methods The primarily cultured VSMCs were incubated with 500μmol/L Hcy for 12h;then VSMCs were treated with YWPCs in concentration of 1mg/L, 10mg/L or 100mg/L,respectively.IGF-1(3ng/ml)was used to activate PI3K/AKT pathway.The expressions of MMP-2,MMP-9, AKT,pAKT in VSMCs were detected with Western blotting;the activity of MMP-2/9 was examined with gelatin zymography. Results Western blotting showed that compared with Hcy group,the expressions of MMP-2/9,pAKT in YWPC groups were decreased.Gelatin zymography demonstrated that compared with Hcy group,the activity of MMP-2/9 was decreased in the YWPC groups.Compared with control group,the expressions of pAKT,MMP-2/9 was increased in the IGF-1 group(P＜0.01). Compared with YWPC groups the expression of pAKT,MMP-2/9 was increased in YWPC+IGF-1 group(P＜0.01). Conclusion YWPC inhibits Hcy-induced expression ofMMP-2/9 in VSMCs by suppressing PI3K/AKTsignaling pathway.

Vascular smooth muscle cells Yellow wne polyphenolPI3K/AKT Matrix Metalloproteinase

2012-12-17）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY14H020002）

312000 紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科

郭航遠(yuǎn)，E-mail：ghangyuan@hotmail.com