劉龍斌 孟立平 季政 許富康 池菊芳 郭航遠(yuǎn)
黃酒多酚對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞MMP-2/9表達(dá)與活性的影響
劉龍斌 孟立平 季政 許富康 池菊芳 郭航遠(yuǎn)
目的 探討黃酒多酚(YWPC)對(duì)同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)和活性的影響及其信號(hào)通路。方法 SD大鼠主動(dòng)脈VSMCs原代細(xì)胞培養(yǎng)鑒定,取4~7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。YWPC組VSMCs分別用1、10、100mg/L的YWPC干預(yù),采用Western blot法檢測(cè)VSMCs中MMP-2、MMP-9、AKT、pAKT的表達(dá)情況;明膠酶譜檢測(cè)VSMCs中MMP-2和MMP-9的活性。用IGF-1(3ng/ml)干預(yù)VSMCs 8 h激活PI3K/AKT通路后,用YWPC干預(yù)VSMCs,檢測(cè)MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示,與Hcy組比較,YWPC組VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)減少,pAKT表達(dá)減少(均P<0.01);明膠酶譜結(jié)果顯示,與Hcy組比較,YWPC組VSMCs中MMP-2/9的活性降低。在加入IGF-1后,與對(duì)照組比較,IGF-1組VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表達(dá)和活性增加(P<0.01);與YWPC組比較,YWPC+IGF-1組VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表達(dá)和活性增加(P<0.01)。結(jié)論 YWPC通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性。
血管平滑肌細(xì)胞 黃酒多酚 PI3K/AKT 基質(zhì)金屬蛋白酶
黃酒采用紅粬、糯米和水為原料,人工自然發(fā)酵釀制而成?,F(xiàn)已證實(shí)黃酒中含有豐富的多酚、氨基酸、多肽、維生素、低聚糖、有機(jī)酸以及礦物質(zhì)等有益于心腦血管健康的成分[1]。我們過(guò)去的研究已經(jīng)證實(shí)黃酒不但可以抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和遷移,而且可以抑制LDLR-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成[2-4]。大量的研究證實(shí)規(guī)律適量的飲用紅酒具有心血管保護(hù)作用[5-6],并且已經(jīng)闡明紅酒的心血管保護(hù)作用主要緣于其中的多酚類(lèi)成分[7]。我們推測(cè),黃酒主要也是通過(guò)多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮其心腦血管保護(hù)作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)的平衡,在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[8-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究黃酒多酚(YWPC)抑制同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)以及是否通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)這一作用,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雌雄不限,60d左右,體重150~180g;遺傳背景為C57BL/6J 10代后雄性LDLR-/-小鼠(購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。YWPC由上海中藥制藥技術(shù)有限公司分離提取,純度約60%;乙醚、甲醇、75%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、甲醇購(gòu)自杭州化學(xué)試劑有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉素購(gòu)自杭州吉諾公司;Hcy、雷帕霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMSO購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司,F(xiàn)BS購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司,MTT購(gòu)自美國(guó)Emresco公司;DAPI購(gòu)自瑞士Rcohe公司;兔抗akt、p-pakt多克隆抗體、兔抗大鼠SM-actin單克隆抗體、兔抗MMP-2/ 9、明膠購(gòu)自美國(guó)ABCOM公司;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IGg購(gòu)自美國(guó)Jackson公司;蛋白免疫印跡以及明膠酶譜相關(guān)試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。
1.2 方法
1.2.1 VSMCs原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定采用組織貼塊法培育大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)平滑肌肌動(dòng)蛋白(SM-actin)鑒定VSMCs,通過(guò)SM-actin與DAPI核染之間的關(guān)系鑒定VSMCs的純度[11]。取第4~7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),細(xì)胞加干預(yù)因素時(shí)用含2.5%FBS的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為2部分,第1部分用以驗(yàn)證YWPC對(duì)VSMCs中MMP-2/9表達(dá)和活性的影響,將細(xì)胞分為對(duì)照組、Hcy組、YWPC1mg/L組、YWPC 10mg/L組及YWPC 100mg/L組,除對(duì)照組外所有細(xì)胞先用500 μmol/L Hcy干預(yù)12h,再用不同濃度的YWPC干預(yù)VSMCs。第2部分實(shí)驗(yàn)用以驗(yàn)證YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9表達(dá)和活性的機(jī)制,VSMCs分為對(duì)照組、IGF-1(3ng/ml)組、YWPC(10mg/L)組和YWPC+IGF-1組。
1.2.2 Western blot測(cè)定 VSMCs中 MMP-2/9、AKT/ pAKT的表達(dá) 在用不同濃度的YWPC干預(yù)48h之后,裂解VSMCs提取蛋白,BCA法蛋白定量,SDS-PAGE膠每孔加入20μl樣品,80V 30min進(jìn)行蛋白濃聚,120V 2h進(jìn)行凝膠電泳,并用孔徑0.45μm硝酸纖維素膜250mA 90min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢經(jīng)常溫下TBST洗膜×3、脫脂奶粉封閉2h后,以1∶1 000濃度加入兔抗鼠MMP-2一抗(或抗MMP-9、AKT/pAKT一抗),4℃孵育過(guò)夜,常溫下TBST洗膜×3,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白。暗室柯達(dá)膠片顯影,Quantity one軟件定量分析。
1.2.3 明膠酶譜法測(cè)定VSMCs中MMP-2/9的活性取20μl各組蛋白樣品在含1μg/ml明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠片上電泳,待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部,在室溫下用含2.5%Triton X-100洗滌緩沖液平搖洗滌30min× 2;37℃搖床平搖孵育緩沖液(pH8.8,50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L CaCl2)。然后凝膠染色2 h(含0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液,10%冰乙酸,45%甲醇溶液,45%去離子水),脫色(10%冰乙酸,45%甲醇溶液,去離子水45%)直到藍(lán)色背景下出現(xiàn)白色條帶,即為MMP-2/9,用雙蒸水沖洗終止脫色,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,用Quantity One軟件定量分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t法。
2.1 VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,8d左右組織塊周?chē)屑?xì)胞爬出,2周后細(xì)胞融合可以傳代。傳代后細(xì)胞呈典型“峰谷”狀排列生長(zhǎng),用SM-actin細(xì)胞免疫熒光鑒定VSMCs,DAPI核染之后確定細(xì)胞純度在99%以上,見(jiàn)圖1。
圖1 大鼠主動(dòng)脈VSMCs形態(tài)學(xué)及細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果(A:VSMCs呈典型的“峰谷”樣生長(zhǎng),×100;B:免疫熒光結(jié)果顯示SM-actin在細(xì)胞中高表達(dá),×400)。
2.2 兩種方法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá) 見(jiàn)圖2、3,表1、2。
由圖2、3,表1、2可見(jiàn),與對(duì)照組比較,Hcy組VSMCs中 MMP-2/9的表達(dá)均升高(均 P<0.05)。Western blot法中,與Hcy組比較,YWPC不同濃度組VSMCs中MMP-2的表達(dá)均減少(P<0.05或0.01),YWPC 10mg/L組、YWPC 100mg/L組VSMCs中MMP-9的表達(dá)均減少(P<0.05或0.01);明膠酶譜法中,與Hcy組比較,YWPC不同濃度組VSMCs中MMP-9的表達(dá)均減少(P<0.05或0.01),YWPC 10mg/L組、YWPC 100mg/L組VSMCs中MMP-2的表達(dá)均減少(P<0.05或0.01)。各組VSMCs中AKT的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與對(duì)照組比較,Hcy組VSMCs中pAKT的表達(dá)升高(P<0.05);與Hcy比較,YWPC各濃度組VSMCs中pAKT的表達(dá)均減少(P<0.05或0.01)。
圖2 Western blot法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表達(dá)電泳圖
表1 Western blot法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表達(dá)
圖3 明膠酶譜法檢測(cè)各組MMP-2/9的表達(dá)電泳圖
表2 明膠酶譜法檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)
2.3 兩種方法檢測(cè)IGF-1預(yù)處理后各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá) 見(jiàn)圖4、5,表3、4。
圖4 Western blot檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá)電泳圖
表3 Western blot檢測(cè)各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá)
圖5 明膠酶譜法檢測(cè)各組MMP-2/9及AKT、pAKT的表達(dá)電泳圖
表4 明膠酶譜法檢測(cè)各組MMP-2/9的表達(dá)
由圖4、5,表3、4可見(jiàn),與對(duì)照組比較,YWPC組VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)均降低(均P<0.05);與YWPC組比較,YWPC+IGF-1組中MMP-2/9的表達(dá)均增加(均P<0.05)。各組VSMCs中AKT的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對(duì)照組相比,YWPC組VSMCs中pAKT的表達(dá)降低(P<0.05);與YWPC組比較,YWPC+ IGF-1組VSMCs中pAKT的表達(dá)增加(P<0.05)。
紅酒多酚由白藜蘆醇、兒茶素、花青素等組成,通過(guò)調(diào)節(jié)血脂、改善血管功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等作用而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。我們過(guò)去的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明YWPC具有抑制LDL受體基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用,然而其抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制尚未闡明[12]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們證實(shí)了YWPC可以通過(guò)抑制PIK/AKT通路來(lái)抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性,這可能是其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制之一。
MMPs的過(guò)度分泌和激活可以導(dǎo)致粥樣斑塊的纖維帽降解破裂、增加局部的炎癥反應(yīng)[13]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)MMPs除了降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用之外,還可以通過(guò)降解細(xì)胞間黏附分子、誘導(dǎo)細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子、激活其他的MMPs等路徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào),從而在血管重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[13]。自從Oak等[14]發(fā)現(xiàn)紅酒多酚主要通過(guò)降低MMP-2的表達(dá)和活性從而發(fā)揮抑制VSMCs增殖和遷移的作用,后續(xù)研究基本證實(shí)抑制MMP-2/9的表達(dá)和活性是紅酒多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制之一[15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明YWPC不僅可以抑制VSMCs中MMP-2/9的表達(dá),還可以抑制MMP-2/9的活性。這可能是黃酒發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制之一。
PIk/AKT通路在VSMCs增殖和遷移以及表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用[16],pAKT可以進(jìn)一步激活mTOR/ P70S6K通路,增加p-P70S6K1的表達(dá),最終增加VSMCs的增殖和遷移[17]。本研究表明YWPC可以抑制PI3K/ AKT通路,減少pAKT的表達(dá)。以上結(jié)果提示YWPC可能是經(jīng)PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2的表達(dá)和活性。IGF-1是PI3K的激動(dòng)劑,可以激活PI3K,增加pAKT的表達(dá),在本實(shí)驗(yàn)中,在加入IGF-1(3ng/ml)之后,YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性的作用被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí)YWPC是經(jīng)PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2/9的表達(dá)和活性。
本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性,黃酒中的多酚類(lèi)物質(zhì)是由不同的單體成分組成的混合物,究竟是其中的何種確切成分在發(fā)揮作用我們尚不清楚。
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Yellow wine polyphenol compounds inhibit homocysteine-induced expression of MMP-2/9 in vascular smooth muscle cells through inhibiting PI3K/AKT pathway
LIU Longbin,MENG Liping,JI Zheng,et al.Department of Cardiology,Shaoxing People's Hospital, Shaoxing 312000,China
Objective To investigate the effect ofyellow wine polyphenolcompounds(YWPC)on expression ofMMP-2/9 in rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMCs)induced by homocysteine(Hcy)and its mechanism. Methods The primarily cultured VSMCs were incubated with 500μmol/L Hcy for 12h;then VSMCs were treated with YWPCs in concentration of 1mg/L, 10mg/L or 100mg/L,respectively.IGF-1(3ng/ml)was used to activate PI3K/AKT pathway.The expressions of MMP-2,MMP-9, AKT,pAKT in VSMCs were detected with Western blotting;the activity of MMP-2/9 was examined with gelatin zymography. Results Western blotting showed that compared with Hcy group,the expressions of MMP-2/9,pAKT in YWPC groups were decreased.Gelatin zymography demonstrated that compared with Hcy group,the activity of MMP-2/9 was decreased in the YWPC groups.Compared with control group,the expressions of pAKT,MMP-2/9 was increased in the IGF-1 group(P<0.01). Compared with YWPC groups the expression of pAKT,MMP-2/9 was increased in YWPC+IGF-1 group(P<0.01). Conclusion YWPC inhibits Hcy-induced expression ofMMP-2/9 in VSMCs by suppressing PI3K/AKTsignaling pathway.
Vascular smooth muscle cells Yellow wne polyphenolPI3K/AKT Matrix Metalloproteinase
2012-12-17)
(本文編輯:馬雯娜)
浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY14H020002)
312000 紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科
郭航遠(yuǎn),E-mail:ghangyuan@hotmail.com