鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

補陽還五湯聯(lián)合依達拉奉對腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡的影響

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

目的 研究補陽還五湯聯(lián)合依達拉奉對小鼠腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的影響。方法 將50只小鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組、依達拉奉組和兩藥聯(lián)用組，每組10只，其中缺血再灌注后1d和7d各5只。首先制備小鼠大腦中動脈缺血模型，TUNEL法觀察神經細胞凋亡指數(shù)（AI），免疫組化法觀察小鼠大腦皮質神經元Bcl、Bax-2和Caspase-3表達陽性細胞數(shù)。結果 與模型組比較，補陽還五湯組、依達拉奉組、兩藥聯(lián)用組小鼠腦神經細胞AI值均明顯降低（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值明顯升高（P＜0.05），Caspase-3表達陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），其中又以兩藥聯(lián)用組更為明顯（P＜0.05）。結論 兩藥聯(lián)用能降低腦缺血再灌注損傷后神經細胞的凋亡，降低促凋亡基因Caspase-3的表達，協(xié)同發(fā)揮腦保護作用。

補陽還五湯 依達拉奉 腦缺血再灌注 細胞凋亡 Caspase-3 Bcl-2/Bax

【 Key words】 Buyang Huanwu decoction Edaravone Cerebral ischemia reperfusion Cellular apoptosis Caspase-3 Bcl-2/Bax

缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高病死率和高致殘率等特點，其發(fā)病機制是一個多環(huán)節(jié)、多系統(tǒng)反應的結果，而減輕腦缺血半暗帶區(qū)的神經元凋亡是治療關鍵[1]。本研究采用補陽還五湯聯(lián)合依達拉奉作用于小鼠腦缺血模型，觀察兩藥聯(lián)用對腦缺血再灌注損傷后神經元細胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達的影響，以進一步探討其神經保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8月齡C57BL/6型雄性小鼠，體重25～30g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：scxk（滬）2008-0016。實驗前飼養(yǎng)觀察3 d，將造模成功的50只小鼠以隨機數(shù)字法分成假手術組、模型組、補陽還五湯組、依達拉奉組和兩藥聯(lián)用組，每組10只，其中缺血再灌注后1d和7d各5只。

1.2 藥品和試劑 依達拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司）；補陽還五湯（紹興市人民醫(yī)院制劑室提供，由黃芪120g、當歸6g、川芎3g、地龍3g、赤芍5g、紅花3g和桃仁3g組成，水煎、濃縮后生藥含量為2.0g/ ml）。氯化三苯基四氮唑（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；TUNEL凋亡試劑盒（美國Boehringer Manmbeim公司生產，購自福州邁新生物公司）；免疫組化染色試劑盒：Bcl-2（批號20070223），Bax（批號20070223），Caspase-3（批號20070227），均購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒（購自北京中山試劑公司）。

1.3 小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型的建立 參照改良的Longa-Zea線栓法[2]制作小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。缺血90min后，拔出線栓再灌注。假手術組僅分離右側頸總動脈并離斷右頸外動脈，不予栓塞。術后2 h采用神經功能評分驗證造模是否成功，即造模動物出現(xiàn)右側Horner征和左側以上肢為重的偏癱作為動物模型成功的判定標準，剔除不符合標準或死亡的動物，并隨機補充。造模成功率為90%。

1.4 給藥方式 補陽還五湯組于術后2h灌服補陽還五湯，按10ml/kg給藥；依達拉奉組于術后2h尾靜脈注射依達拉奉，按3mg/kg給藥；兩藥聯(lián)用組于術后2h分別給予等劑量補陽還五湯灌胃和依達拉奉尾靜脈注射；模型組和假手術組均給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃和尾靜脈注射；首次給藥后，每天1次，連續(xù)7d。

1.5 標本制作 小鼠在腦缺血再灌注1d和7d后，經10%水合氯醛深度麻醉（600mg/kg），迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動脈，快速注入150ml甲醛灌注固定，斷頭取腦，沿視交叉后緣做冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋，做5μm連續(xù)切片用于凋亡與免疫組化檢測。

1.6 凋亡細胞檢測 采用TUNEL法檢測凋亡神經細胞。（1）切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K室溫消化20min；（2）微波修復抗原5min后自然冷卻；（3）滴加TUNEL反應液，37℃孵育1h；（4）滴加辣根過氧化物酶標抗熒光素抗體工作液，37℃孵育30min；（5）用DAB顯色劑呈色；（6）常規(guī)脫水、透明、封片。在光鏡下觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。計算凋亡指數(shù)（AI），AI＝凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7 免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3% H2O2孵育10min；微波修復抗原10min自然冷卻至室溫；滴加10%正常山羊血清，室溫封閉30min；分別滴加兔抗Bcl-2、兔抗Bax和兔抗Caspase-3抗血清，4℃孵育24h；滴加二抗工作液（山羊抗兔）室溫反應15min；滴加辣根酶標記卵白素工作液，室溫反應15min；DAB顯色劑呈色；梯度脫水、中型樹脂封片。在光鏡下觀察，細胞質有棕黃色顆粒者為陽性細胞；并計算陽性染色神經細胞的數(shù)目。

1.8 圖像處理 取每只小鼠2張切片，置于光鏡下，隨機選擇梗死灶周邊區(qū)5個視野，分別分析神經細胞AI、Bcl-2/Bax和Caspase-3陽性細胞百分數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠腦缺血再灌注1d和7d后神經細胞AI值 腦缺血再灌注1d和7d后，模型組和各用藥組神經細胞AI值均高于假手術組（P＜0.01）。同一時間點，各用藥組神經細胞AI值均明顯低于模型組（P＜0.05），兩藥聯(lián)用組均低于其他用藥組（P＜0.05），依達拉奉組與補陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠腦缺血再灌注1d和7d后的神經細胞AI值

2.2 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2/Bax 各組小鼠腦缺血再灌注損傷1d和7d后的Bcl-2/Bax比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=19.90、5.34，均P＜0.01），2個時間點均為兩藥聯(lián)用組高于其他各組（P＜0.05），見表2。

2.3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后神經元Caspase-3的表達 腦缺血再灌注1d和7d后，模型組和各用藥組神經元Casepase-3表達均高于假手術組（P＜0.01）。同一時間點，各用藥組神經元Casepase-3表達均低于模型組（P＜0.01），兩藥聯(lián)用組低于其他用藥組（P＜0.05），但依達拉奉組與補陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

腦缺血再灌注后神經細胞損傷主要包括壞死和凋亡。缺血中心區(qū)細胞迅速壞死，而周邊缺血半暗帶區(qū)發(fā)生以凋亡為主的遲發(fā)性死亡[3]。因此，搶救半暗帶區(qū)神經細胞，減少細胞凋亡，能減輕腦缺血再灌注損傷的程度和范圍[4]。細胞凋亡受到多基因、多系統(tǒng)調控，Bcl-2、Bax是與神經元凋亡關系密切的調控基因。前者抑制細胞凋亡，后者促進細胞凋亡，Bcl-2與Bax蛋白可形成結合體，過度表達Bax蛋白能促進細胞凋亡，抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Bcl-2/Bax比值越低，細胞凋亡率越高[5-7]。此外，Caspase-3是細胞凋亡的敏感指標，被認為是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應最關鍵的執(zhí)行者，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用[8]，阻抑Caspase-3表達，對防止腦損傷惡化和改善神經功能具有重要意義。

表2 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2/Bax

表3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后神經元Caspase-3的表達

補陽還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，是補氣、活血、通絡的方藥，能多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮神經保護作用[9-10]，減少腦缺血再灌注損傷細胞凋亡[11]。腦缺血再灌注時體內氧自由基大量產生，可引發(fā)脂質過氧化反應[12]。ED具有清除自由基和抑制脂質過氧化的作用，可抑制神經、血管內皮細胞的過氧化和遲發(fā)性死亡，減輕腦水腫及組織損傷，且促進神經營養(yǎng)因子產生[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型組腦組織凋亡細胞明顯增多，藥物治療后凋亡細胞明顯減少，尤以兩藥聯(lián)用組減少最顯著，這提示腦缺血再灌注損傷可引起神經細胞凋亡發(fā)生，補陽還五湯和依達拉奉對神經細胞凋亡均有抑制作用，兩藥聯(lián)用效果尤為顯著。

同時，小鼠腦缺血再灌注后缺血區(qū)細胞的Bcl-2、Bax和Caspase-3表達明顯增多，說明Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達參與腦缺血區(qū)神經細胞的損傷過程，小鼠腦缺血再灌注后啟動了凋亡機制。腦缺血再灌注1d和7d后，各用藥組小鼠腦組織細胞內Bcl-2/Bax比值均高于模型組，Caspase-3陽性細胞數(shù)少于模型組，尤以兩藥聯(lián)用最顯著。這表明補陽還五湯與依達拉奉均可增高Bcl-2/Bax比值，抑制凋亡誘導基因Caspase-3的表達，從而抑制神經細胞凋亡，兩藥聯(lián)用可協(xié)同發(fā)揮腦保護作用，效果更佳。

本文從分子水平闡明了兩藥聯(lián)用治療急性缺血性腦血管病的優(yōu)勢，為臨床推廣應用提供了實驗依據(jù)，開辟了缺血性腦血管病治療的新途徑。

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（本文編輯：陳丹）

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本刊編輯部

Neuroprotective effect of Chinese medicine Buyang Huanwu Decoction combined with edaravone on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice

ZHONG Fangfang，WU Chenglong，SUN Xinfang，et al.Department of Neurology,Shaoxing People's Hospital，Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effects of Chinese medicine Buyang Huanwu Decoction(BYHWD)combined with edaravone（ED）on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Methods Fifty mice were randomly divided into sham operation group，model group，BYHWD group,ED group and BYHWD+ED group.Each group were further randomly divided into 1d and 7d group.The middle cerebral artery occlusion/reperfusion model was established by the improved intraluminal filament technique in mice.The animals were sacrificed on d1 (n=5)and d7 (n=5)after ischemic/reperfusion was induced in each group. Immunohistochemistry method was used to analyze the expression of Bcl,Bax-2 and Caspase-3 protein in neurons,and TUNEL method was used to evaluate the apoptosis of neuron. Results Compared with model group,the apoptosis index was reduced (P＜0.05),ratio of Bcl-2/Bax was increased (P＜0.05),and Caspase-3-postive cells were decreased (P＜0.01)in BYHWD,ED and BYHWD+ED groups,and those in BYHWD+ED group were changed most significantly. Conclusion Chinese medicine Buyang Huanwu decoction has a synergistic effect with edaravone in protection ofthe brain from ischemic/reperfusion injury.

2015-10-14）

浙江省紹興市公益性技術應用研究計劃項目（2013B70076）

312000 紹興市人民醫(yī)院神經內科

鐘芳芳，E-mail：yangmum@126.com