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        子宮內(nèi)膜異位癥中miR-143、miR-145和miR-126的差異表達(dá)

        2016-12-24 06:14:28鄭冰冰徐超逸趙益萍韓靈芝虞樓超段萍
        浙江醫(yī)學(xué) 2016年3期
        關(guān)鍵詞:月經(jīng)周期異位癥標(biāo)本

        鄭冰冰 徐超逸 趙益萍 韓靈芝 虞樓超 段萍

        子宮內(nèi)膜異位癥中miR-143、miR-145和miR-126的差異表達(dá)

        鄭冰冰 徐超逸 趙益萍 韓靈芝 虞樓超 段萍

        目的 探索子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)中miR-143、miR-145和miR-126的差異表達(dá),以及不同月經(jīng)周期的影響。方法利用real time RT-PCR技術(shù),比較miR-143、miR-145和miR-126在EMs患者在位內(nèi)膜(EU,2例)、異位內(nèi)膜(EC,14例)、配對EU+EC(14例),與非EMs患者內(nèi)膜(EN,28例)中的表達(dá)差異;并分析EN和EC組不同月經(jīng)周期對miR-143、miR-145和miR-126表達(dá)的影響。結(jié)果 不同月經(jīng)周期的影響分析,發(fā)現(xiàn)僅EN標(biāo)本中miR-143增生期表達(dá)量高于分泌期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與EN相比,miR-143和miR-145在EU中均表達(dá)上調(diào)(P<0.05),miR-143、miR-145和miR-126在EC中均表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。配對EU-EC中,miR-143、miR-145和miR-126在EC中均表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 miR-143、miR-145和miR-126在EMs中表達(dá)高于非EMs,在EC中表達(dá)高于EU。

        子宮內(nèi)膜異位癥 miR-143 miR-145 miR-126

        子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指子宮內(nèi)膜組織生長在子宮腔被覆內(nèi)膜和宮體肌層以外部位,是育齡婦女常見疾病之一。EMs的發(fā)病機(jī)制尚未明確,越來越多研究將在位內(nèi)膜(EU)和異位內(nèi)膜(EC)的差異作為重點(diǎn),包括基因的表達(dá)。近年來發(fā)現(xiàn)MicroRNA在腫瘤和其他疾病中存在異常表達(dá),其中miR-143、miR-145和miR-126可能在抑癌基因、癌轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲和血管形成中起重要作用。本研究旨在探索miR-143、miR-145和miR-126在EMs與非EMs內(nèi)膜(EN)中的表達(dá)差異,以及不同月經(jīng)周期對表達(dá)量的影響。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 標(biāo)本 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(育英兒童醫(yī)院)2010年12月至2011年6月EMs患者(均經(jīng)病理證實(shí))成對的EU和EC標(biāo)本14例(增生期9例,分泌期4例,增生期-分泌期1例);EC標(biāo)本(無配對EU)14例(增生期4例,分泌期10例);EU標(biāo)本(無配對EC)2例,均為增生期;非EMs患者(均為子宮肌壁間肌瘤)EN標(biāo)本28例(增生期13例,分泌期14例,增生期-分泌期1例)。EMs患者均為育齡婦女,EN組、EU組和EC組患者年齡[采用M(P25,P75)表示]為46(43,47)、46(40,48)和39(29,46)歲,均行子宮切除術(shù)和(或)卵巢囊腫剝除術(shù),術(shù)中或術(shù)前3個月均未接受過激素治療,EC標(biāo)本取自卵巢巧克力囊腫囊壁。

        1.1.2 試劑 Trizol(美國Invitrogen公司);MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、SYBR Green I Mastermix等(日本Toyobo公司);引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 總RNA提取 用Trizol法提取組織總RNA,采用異丙醇沉淀法濃縮RNA,DEPC處理水溶解RNA。紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度,OD260/OD280在1.8~2.2即為合格標(biāo)本。1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA完整性。

        1.2.2 莖環(huán)real time RT-PCR驗(yàn)證 根據(jù)前期基因芯片結(jié)果,挑選表達(dá)差異的miR-143、miR-145和miR-126進(jìn)一步驗(yàn)證。根據(jù)已報道的莖環(huán)qPCR方法,以內(nèi)源性對照基因(U6)作為內(nèi)參,分析MicroRNA表達(dá)。miR-143、miR-145、miR-126和U6的相關(guān)引物序列見表1。

        表1 microRNA莖環(huán)real time RT-PCR檢測相關(guān)引物序列

        用日本Toyobo公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑,結(jié)合MicroRNA莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,每個逆轉(zhuǎn)錄體系中含有1μg的總RNA模板。反應(yīng)條件:16℃30min,42℃30 min,75℃15min,cDNA稀釋1倍后-20℃保存。使用SYBR Green I Mastermix配制PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)體積為20μl,平行做3個孔。PCR反應(yīng)條件:95°C 10 min,95°C 15s,60°C 1min,40個循環(huán)。使用Roche 480定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

        1.2.3 計(jì)算公式 目的基因表達(dá)量用2-ΔCT表示,每個組織標(biāo)本miR-143、miR-145和miR-126的PCR擴(kuò)增平均CT值減去U6平均CT值,求出ΔCT值,即目的miRNA的表達(dá)相對于內(nèi)參的變化倍數(shù)。EMs中EC標(biāo)本miR-143、miR-145和miR-126表達(dá)的2-ΔC(TREC)除以同一患者EU標(biāo)本miR-143、miR-145和miR-126表達(dá)的2-ΔC(TREU),即2-△△c(tR值),是EC相對于EU中miR-143、miR-145和miR-126的表達(dá)倍數(shù)變化。R值>1表示,與配對的EU比較,miR-143、miR-145和miR-126在EC中表達(dá)上調(diào);R值<1表示下調(diào)。具體公式如下:△CT=CTMicroRNA-CTU6

        △△CT=(CTMicroRNA-CTU6)ectopic-(CTMicroRNA-CTU6)eutopic

        REC=2-△CT

        REU=2-△CT

        R=REC/REU=2-△△CT

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布,以M(P25,P75)表示。配對EU-EC差異分析采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn),EN與EC、EU的比較采用兩個獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 EN和EC標(biāo)本中miR-143、miR-145和miR-126在不同月經(jīng)周期的表達(dá)差異 EN標(biāo)本中僅miR-143增生期表達(dá)量高于分泌期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.041,P<0.05)。EC標(biāo)本中,miR-143、miR-145和miR-126在增生期與分泌期的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.826、-0.097和-1.361,均P>0.05),見表2。

        2.2 EN、EU和EC組中miR-143、miR-145和miR-126的表達(dá)差異 miR-143:與EN相比,在EU和EC中表達(dá)上調(diào)(Z=-1.990和-5.573,均P<0.05);與EU相比,在EC中表達(dá)上調(diào)(Z=-3.515,P<0.01)。miR-145:與EN相比,在EU和EC中表達(dá)上調(diào)(Z=-3.027和-5.459,均P<0.05);與EU相比,在EC中表達(dá)上調(diào)(Z=-2.978,P<0.01)。miR-126:與EN相比,在EC中表達(dá)上調(diào)(Z=-4.196,P<0.01);與EU相比,在EC中表達(dá)上調(diào)(Z= -3.369,P<0.01),見表3。

        表2 EN和EC標(biāo)本中miR-143、miR-145和miR-126在增生期和分泌期的表達(dá)量

        表3 EN、EU和EC組中miR-143、miR-145和miR-126的表達(dá)量

        2.3 配對EU-EC中miR-143、miR-145和miR-126的表達(dá)差異 EC相對于EU的R值>1,表明與EU相比,miR-143、miR-145和miR-126在EC中表達(dá)均上調(diào);經(jīng)配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn),結(jié)果一致(Z=-2.924、-3.113和-2.798,均P<0.05),見表4。

        表4 配對EU-EC中miR-143、miR-145和miR-126的表達(dá)量

        3 討論

        前期工作將EN、EU和EC標(biāo)本進(jìn)行Agilent human MicroRNA寡核苷酸基因芯片分析,篩選出差異表達(dá)的MicroRNA(數(shù)據(jù)未顯示)。本研究選擇miR-143、miR-145和miR-126進(jìn)行驗(yàn)證分析。國外研究發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-145和miR-126在EMs與非EMs中表達(dá)量存在差異[1-3],與本研究結(jié)果不完全符合。

        相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-143與miR-145表達(dá)相似,兩者在染色體5q33的定位位置接近,約1.8 kb[4]。Ohlsson等[1]和Filigheddu等[2]研究發(fā)現(xiàn),與配對EU相比,miR-143和miR-145在EC中表達(dá)上調(diào)。Zhang等[5]在轉(zhuǎn)基因老鼠和肝細(xì)胞癌(HCC)患者中,證實(shí)轉(zhuǎn)移性HBV-HCC中miR-143表達(dá)上調(diào),阻斷miR-143表達(dá)后,肝臟轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移被明顯抑制。

        本研究顯示,與EN相比,miR-143和miR-145均在EU和EC中表達(dá)上調(diào);與EU相比,miR-143和miR-145均在EC中表達(dá)上調(diào)。盡管EMs在病理上呈良性表現(xiàn),但有類似轉(zhuǎn)移性HBV-HCC等惡性腫瘤種植、侵蝕和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力[6-7],與上述結(jié)果相符。越來越多研究認(rèn)為“黏附-侵襲-血管形成”是EMs病灶形成過程,血管內(nèi)皮生長因子與其他促血管生成因子相互作用,促進(jìn)EMs發(fā)生、發(fā)展[8]。而miR-126是與血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管功能密切相關(guān)的MicroRNA。本研究結(jié)果顯示,與EN相比,miR-126在EC中表達(dá)上調(diào);與EU相比,在EC中表達(dá)上調(diào);考慮與異位病灶“血管形成”可能存在關(guān)聯(lián)。

        近年來,國外對EMs中EU與EC的基因表達(dá)差異進(jìn)行研究,解釋了病因假說中異位內(nèi)膜種植的過程發(fā)展[9]。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)miR-143抑制FNDC3B的表達(dá),以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移;且發(fā)現(xiàn)FNDC3B是miR-143直接功能性靶基因。Fan等[10]在高轉(zhuǎn)移潛能的鼠乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),miR-143表達(dá)上調(diào)后,可抑制FNDC3B表達(dá),從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前尚缺少對miR-143、miR-145和miR-126靶基因的了解。此外,研究發(fā)現(xiàn)編碼VEGF的非編碼區(qū)有miR-126的結(jié)合位點(diǎn)。Ge等[11]發(fā)現(xiàn)miR-126對VEGF表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用,部分通過抑制VEGF通路的負(fù)調(diào)控因子起作用。

        miR-143、miR-145和miR-126在EMs中表達(dá)高于非EMs,在EC中表達(dá)高于EU;miR-143、miR-145和miR-126在EMs的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

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        Differential expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in endometriosis


        ZHENG Bingbing,XU Chaoyi,ZHAO Yiping,et al. Department of Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

        Objective To investigate the differential expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in endometriosis(EMs). Methods The expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 were detected with real-time RT-PCR in eutopic endometrium (EU,n=2),ectopic endometrium(EC,n=14),paired EU+EC(n=14)from women with EMs and normal endometrium(EN,n=28)from women without EMs.The expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 were also detected in different menstrual cycle of EN and/or EC.Results Compared to EN,the expression ofmiR-143,miR-145 in EU was up-regulated(P<0.05).Compared to EN, the expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in EC was up-regulated(P<0.01).Compared to corresponding EU samples, the expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in EC was up-regulated (P<0.01).The miR-143 in proliferative endometrium was up-regulated,compared to secretory endometrium in EN group(P<0.05). Conclusion In endometriosis the expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 in ectopic endometrium are up-regulated.

        Endometriosis MiR-143 MiR-145 MiR-126

        2015-04-13)

        (本文編輯:陳丹)

        浙江省衛(wèi)生廳平臺重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2013RCA035);溫州市科技局課題(Y20100175)

        325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科(鄭冰冰);溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科(徐超逸、韓靈芝、虞樓超、段萍);諸暨市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(趙益萍)

        段萍,E-mail:dppddpp@126.com

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