鄭冰冰 徐超逸 趙益萍 韓靈芝 虞樓超 段萍

子宮內(nèi)膜異位癥中miR-143、miR-145和miR-126的差異表達

鄭冰冰 徐超逸 趙益萍 韓靈芝 虞樓超 段萍

目的 探索子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）中miR-143、miR-145和miR-126的差異表達，以及不同月經(jīng)周期的影響。方法利用real time RT-PCR技術(shù)，比較miR-143、miR-145和miR-126在EMs患者在位內(nèi)膜（EU，2例）、異位內(nèi)膜（EC，14例）、配對EU+EC（14例），與非EMs患者內(nèi)膜（EN，28例）中的表達差異；并分析EN和EC組不同月經(jīng)周期對miR-143、miR-145和miR-126表達的影響。結(jié)果 不同月經(jīng)周期的影響分析，發(fā)現(xiàn)僅EN標(biāo)本中miR-143增生期表達量高于分泌期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與EN相比，miR-143和miR-145在EU中均表達上調(diào)（P＜0.05），miR-143、miR-145和miR-126在EC中均表達上調(diào)（P＜0.01）。配對EU-EC中，miR-143、miR-145和miR-126在EC中均表達上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論 miR-143、miR-145和miR-126在EMs中表達高于非EMs，在EC中表達高于EU。

子宮內(nèi)膜異位癥 miR-143 miR-145 miR-126

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是指子宮內(nèi)膜組織生長在子宮腔被覆內(nèi)膜和宮體肌層以外部位，是育齡婦女常見疾病之一。EMs的發(fā)病機制尚未明確，越來越多研究將在位內(nèi)膜（EU）和異位內(nèi)膜（EC）的差異作為重點，包括基因的表達。近年來發(fā)現(xiàn)MicroRNA在腫瘤和其他疾病中存在異常表達，其中miR-143、miR-145和miR-126可能在抑癌基因、癌轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲和血管形成中起重要作用。本研究旨在探索miR-143、miR-145和miR-126在EMs與非EMs內(nèi)膜（EN）中的表達差異，以及不同月經(jīng)周期對表達量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（育英兒童醫(yī)院）2010年12月至2011年6月EMs患者（均經(jīng)病理證實）成對的EU和EC標(biāo)本14例（增生期9例，分泌期4例，增生期－分泌期1例）；EC標(biāo)本（無配對EU）14例（增生期4例，分泌期10例）；EU標(biāo)本（無配對EC）2例，均為增生期；非EMs患者（均為子宮肌壁間肌瘤）EN標(biāo)本28例（增生期13例，分泌期14例，增生期－分泌期1例）。EMs患者均為育齡婦女，EN組、EU組和EC組患者年齡[采用M（P25，P75）表示]為46（43，47）、46（40，48）和39（29，46）歲，均行子宮切除術(shù)和（或）卵巢囊腫剝除術(shù)，術(shù)中或術(shù)前3個月均未接受過激素治療，EC標(biāo)本取自卵巢巧克力囊腫囊壁。

1.1.2 試劑 Trizol（美國Invitrogen公司）；MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、SYBR Green I Mastermix等（日本Toyobo公司）；引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 用Trizol法提取組織總RNA，采用異丙醇沉淀法濃縮RNA，DEPC處理水溶解RNA。紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度，OD260/OD280在1.8～2.2即為合格標(biāo)本。1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 莖環(huán)real time RT-PCR驗證 根據(jù)前期基因芯片結(jié)果，挑選表達差異的miR-143、miR-145和miR-126進一步驗證。根據(jù)已報道的莖環(huán)qPCR方法，以內(nèi)源性對照基因（U6）作為內(nèi)參，分析MicroRNA表達。miR-143、miR-145、miR-126和U6的相關(guān)引物序列見表1。

表1 microRNA莖環(huán)real time RT-PCR檢測相關(guān)引物序列

用日本Toyobo公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑，結(jié)合MicroRNA莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個逆轉(zhuǎn)錄體系中含有1μg的總RNA模板。反應(yīng)條件：16℃30min，42℃30 min，75℃15min，cDNA稀釋1倍后-20℃保存。使用SYBR Green I Mastermix配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體積為20μl，平行做3個孔。PCR反應(yīng)條件：95°C 10 min，95°C 15s，60°C 1min，40個循環(huán)。使用Roche 480定量PCR儀進行PCR擴增。

1.2.3 計算公式 目的基因表達量用2-ΔCT表示，每個組織標(biāo)本miR-143、miR-145和miR-126的PCR擴增平均CT值減去U6平均CT值，求出ΔCT值，即目的miRNA的表達相對于內(nèi)參的變化倍數(shù)。EMs中EC標(biāo)本miR-143、miR-145和miR-126表達的2-ΔC（TREC）除以同一患者EU標(biāo)本miR-143、miR-145和miR-126表達的2-ΔC（TREU），即2-△△c（tR值），是EC相對于EU中miR-143、miR-145和miR-126的表達倍數(shù)變化。R值＞1表示，與配對的EU比較，miR-143、miR-145和miR-126在EC中表達上調(diào)；R值＜1表示下調(diào)。具體公式如下：△CT=CTMicroRNA-CTU6

△△CT=（CTMicroRNA-CTU6）ectopic-（CTMicroRNA-CTU6）eutopic

REC=2-△CT

REU=2-△CT

R=REC/REU=2-△△CT

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 16.0軟件，計量數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，以M（P25，P75）表示。配對EU-EC差異分析采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗，EN與EC、EU的比較采用兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EN和EC標(biāo)本中miR-143、miR-145和miR-126在不同月經(jīng)周期的表達差異 EN標(biāo)本中僅miR-143增生期表達量高于分泌期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.041，P＜0.05）。EC標(biāo)本中，miR-143、miR-145和miR-126在增生期與分泌期的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-0.826、-0.097和-1.361，均P＞0.05），見表2。

2.2 EN、EU和EC組中miR-143、miR-145和miR-126的表達差異 miR-143：與EN相比，在EU和EC中表達上調(diào)（Z=-1.990和-5.573，均P＜0.05）；與EU相比，在EC中表達上調(diào)（Z=-3.515，P＜0.01）。miR-145：與EN相比，在EU和EC中表達上調(diào)（Z=-3.027和-5.459，均P＜0.05）；與EU相比，在EC中表達上調(diào)（Z=-2.978，P＜0.01）。miR-126：與EN相比，在EC中表達上調(diào)（Z=-4.196，P＜0.01）；與EU相比，在EC中表達上調(diào)（Z= -3.369，P＜0.01），見表3。

表2 EN和EC標(biāo)本中miR-143、miR-145和miR-126在增生期和分泌期的表達量

表3 EN、EU和EC組中miR-143、miR-145和miR-126的表達量

2.3 配對EU-EC中miR-143、miR-145和miR-126的表達差異 EC相對于EU的R值＞1，表明與EU相比，miR-143、miR-145和miR-126在EC中表達均上調(diào)；經(jīng)配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗，結(jié)果一致（Z=-2.924、-3.113和-2.798，均P＜0.05），見表4。

表4 配對EU-EC中miR-143、miR-145和miR-126的表達量

3 討論

前期工作將EN、EU和EC標(biāo)本進行Agilent human MicroRNA寡核苷酸基因芯片分析，篩選出差異表達的MicroRNA（數(shù)據(jù)未顯示）。本研究選擇miR-143、miR-145和miR-126進行驗證分析。國外研究發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-145和miR-126在EMs與非EMs中表達量存在差異[1-3]，與本研究結(jié)果不完全符合。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-143與miR-145表達相似，兩者在染色體5q33的定位位置接近，約1.8 kb[4]。Ohlsson等[1]和Filigheddu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，與配對EU相比，miR-143和miR-145在EC中表達上調(diào)。Zhang等[5]在轉(zhuǎn)基因老鼠和肝細胞癌（HCC）患者中，證實轉(zhuǎn)移性HBV-HCC中miR-143表達上調(diào)，阻斷miR-143表達后，肝臟轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移被明顯抑制。

本研究顯示，與EN相比，miR-143和miR-145均在EU和EC中表達上調(diào)；與EU相比，miR-143和miR-145均在EC中表達上調(diào)。盡管EMs在病理上呈良性表現(xiàn)，但有類似轉(zhuǎn)移性HBV-HCC等惡性腫瘤種植、侵蝕和遠處轉(zhuǎn)移能力[6-7]，與上述結(jié)果相符。越來越多研究認為“黏附-侵襲-血管形成”是EMs病灶形成過程，血管內(nèi)皮生長因子與其他促血管生成因子相互作用，促進EMs發(fā)生、發(fā)展[8]。而miR-126是與血管內(nèi)皮細胞和血管功能密切相關(guān)的MicroRNA。本研究結(jié)果顯示，與EN相比，miR-126在EC中表達上調(diào)；與EU相比，在EC中表達上調(diào)；考慮與異位病灶“血管形成”可能存在關(guān)聯(lián)。

近年來，國外對EMs中EU與EC的基因表達差異進行研究，解釋了病因假說中異位內(nèi)膜種植的過程發(fā)展[9]。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)miR-143抑制FNDC3B的表達，以促進腫瘤細胞擴散和轉(zhuǎn)移；且發(fā)現(xiàn)FNDC3B是miR-143直接功能性靶基因。Fan等[10]在高轉(zhuǎn)移潛能的鼠乳腺癌細胞和前列腺癌干細胞中發(fā)現(xiàn)，miR-143表達上調(diào)后，可抑制FNDC3B表達，從而使腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前尚缺少對miR-143、miR-145和miR-126靶基因的了解。此外，研究發(fā)現(xiàn)編碼VEGF的非編碼區(qū)有miR-126的結(jié)合位點。Ge等[11]發(fā)現(xiàn)miR-126對VEGF表達起負調(diào)節(jié)作用，部分通過抑制VEGF通路的負調(diào)控因子起作用。

miR-143、miR-145和miR-126在EMs中表達高于非EMs，在EC中表達高于EU；miR-143、miR-145和miR-126在EMs的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

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Differential expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in endometriosis

ZHENG Bingbing，XU Chaoyi，ZHAO Yiping，et al. Department of Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the differential expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in endometriosis(EMs). Methods The expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 were detected with real-time RT-PCR in eutopic endometrium (EU,n=2),ectopic endometrium(EC,n=14),paired EU+EC(n=14)from women with EMs and normal endometrium(EN,n=28)from women without EMs.The expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 were also detected in different menstrual cycle of EN and/or EC.Results Compared to EN,the expression ofmiR-143,miR-145 in EU was up-regulated(P＜0.05).Compared to EN, the expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in EC was up-regulated(P＜0.01).Compared to corresponding EU samples, the expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in EC was up-regulated (P＜0.01).The miR-143 in proliferative endometrium was up-regulated,compared to secretory endometrium in EN group(P＜0.05). Conclusion In endometriosis the expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 in ectopic endometrium are up-regulated.

Endometriosis MiR-143 MiR-145 MiR-126

2015-04-13）

（本文編輯：陳丹）

浙江省衛(wèi)生廳平臺重點資助項目（2013RCA035）；溫州市科技局課題（Y20100175）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科（鄭冰冰）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科（徐超逸、韓靈芝、虞樓超、段萍）；諸暨市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（趙益萍）

段萍，E-mail：dppddpp@126.com