肖九長(zhǎng)，鄒淑慧，唐金鳳，劉 婷，范存琳，劉奕紅，劉 聰

(贛州市人民醫(yī)院，江西贛州341000)

贛州地區(qū)HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子的突變及對(duì)肝臟疾病進(jìn)程的影響

肖九長(zhǎng)，鄒淑慧，唐金鳳，劉 婷，范存琳，劉奕紅，劉 聰

(贛州市人民醫(yī)院，江西贛州341000)

目的通過(guò)對(duì)HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子序列的測(cè)定和比較，探討其突變與肝臟疾病進(jìn)展的關(guān)系。方法收集125份乙型肝炎感染者的血清標(biāo)本HBV-DNA，PCR擴(kuò)增HBV Enh-I/X基因并測(cè)序，比較不同患者之間的突變差異。結(jié)果獲得HBV Enh-I/X基因42份，其中慢性乙型肝炎(CHB)20例，肝硬化（LC）14例，肝細(xì)胞癌（HCC）8例。突變率較高的位點(diǎn)有A1077C，A1123T和G1218C/A在CHB、LC及HCC組中的突變率分別為：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42. 9%和50%。對(duì)CHB、LC和HCC三組患者間進(jìn)行比較，位點(diǎn)A1077C在LC組和HCC組的變異率為64.29%和50%，顯著高于CHB組（20%，χ2=7.076，P=0.029）；位點(diǎn)A1123T在LC組和HCC組的變異率為50%和37.5%，顯著高于CHB組（10%，χ2=7. 619，P=0.022）；位點(diǎn)A1317G在LC組和HCC組的變異率為35.71%和50%，顯著高于CHB組（5%，χ2=8.019，P=0.018）。結(jié)論HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子序列上存在多位點(diǎn)的突變，可能影響轉(zhuǎn)錄水平及復(fù)制水平，使病情進(jìn)展趨于復(fù)雜，了解其突變情況為乙型肝炎的治療和控制疾病發(fā)展提供病毒學(xué)分子信息。

乙型肝炎病毒；Enh-I；突變

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染后可表現(xiàn)為乙肝攜帶者（AsC）、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）甚至肝癌（HCC）[1，2]。HBV變異可影響慢性肝病的進(jìn)展。HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子位于nt955-1359，是HBV基因組的順式作用元件，包括調(diào)控區(qū)（nt955-1047），核心區(qū)（nt1048-1168）和X基因重疊區(qū)（nt1169-1359）[3]，可參與調(diào)控HBV基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，其序列上的突變與HBV慢性感染的關(guān)聯(lián)尚不明確。贛州地區(qū)作為乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，對(duì)乙肝病毒基因組的突變與疾病的關(guān)系研究較少，本研究對(duì)HBV Enh I/X基因啟動(dòng)子進(jìn)行序列分析，以探討變異對(duì)肝臟疾病進(jìn)程的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源研究對(duì)象：以2015年6月至2015年12月間在贛州市人民醫(yī)院住院的慢性乙型肝炎患者為研究人群。共收集125份血清標(biāo)本，男性82例，女性43例，年齡23~86歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的《病毒性肝炎防治方案》[4]，排除其他肝炎病毒（HAV、HCV、HDV、HEV）及CMV、HIV、EBV合并感染，無(wú)嗜酒史，無(wú)肝毒性藥物使用史，無(wú)脂肪肝及自身免疫性肝炎，入選對(duì)象均未使用核苷類似物和干擾素等藥物。所有患者HBV DNA均為陽(yáng)性

1.2 HBsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbcAb、PreS標(biāo)志物采用中山生物工程有限公司試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。1.3 HBV DNA的提取和定量提取液及Real time PCR試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。DNA的提取采用煮沸法（DNA提取液50μl加血清50μl，混勻后100℃水浴10min，12000r·min-1離心5min，上清備用)

1.4 HBV Enh I/X基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增和序列測(cè)定。PCR擴(kuò)增及測(cè)序引物：F1：5’-ttgtctttgggtatacatttgaa -3’；R1：5’-ggcagcacagcctagcagcc-3’，由上海invitrogen生物科技有限公司合成。TransTaq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)試劑盒及DNA Marker購(gòu)自北京Transgen生物科技有限公司。PCR反應(yīng)條件：95℃，5min+94℃，45s+55℃，45s+ 72℃，90s)×35循環(huán)→72℃，10min。PCR產(chǎn)物交上海Invitrogen生物科技有限公司測(cè)序。采用GenBank中Genotyping軟件對(duì)測(cè)序標(biāo)本進(jìn)行分型，所入選病例的基因分型已在前期工作完成。序列比對(duì)使用HBV B型(AF100309)為參照序列。利用ClustalX、Bioedit軟件對(duì)產(chǎn)物序列進(jìn)行基因的突變分析。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s）表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，使用SPSS 13．0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果將125份HBsAg、HBV DNA均為陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分標(biāo)本因病毒載量較低，PCR反應(yīng)產(chǎn)物太弱無(wú)法滿足要求而未送測(cè)序。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物及相應(yīng)的測(cè)序引物，委托Invitrogen生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。獲得42份靶序列。

2.2 測(cè)序標(biāo)本的一般情況42份測(cè)序成功的標(biāo)本包括20例CHB，14例LC和8例HCC?；颊吣挲g、性別及HBV DNA水平見(jiàn)表1。

表1 測(cè)序標(biāo)本的一般情況

2.3 HBVEnh I/X基因啟動(dòng)子的突變情況用GenBank中Genotyping對(duì)測(cè)序標(biāo)本分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)本均為B基因型。以標(biāo)準(zhǔn)株AF100309為參考序列，發(fā)現(xiàn)14個(gè)主要突變位點(diǎn)，其中調(diào)控區(qū)出現(xiàn)3個(gè)突變點(diǎn)：T960A、A987G、C1020T；核心區(qū)出現(xiàn)5個(gè)突變點(diǎn)：A1077C、A1080G、A1123T、C1135T和G1137A；X基因重疊區(qū)出現(xiàn)6個(gè)突變點(diǎn)：G1218C/A、A1221C、A1242C、A1317G、A1320C、G1347A。突變率較高的位點(diǎn)有A1077C，A1123T和G1218C/A在CHB、LC及HCC組中的突變率分別為：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42.9%和50%。對(duì)CHB、LC和HCC三組患者間進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)HBV EnhI/X基因啟動(dòng)子出現(xiàn)了不同程度的變異。位點(diǎn)A1077C在LC組和HCC組的變異率為64.29%和50%，顯著高于CHB組（20%，χ2=7.076，P=0.029）；位點(diǎn)A1123T在LC組和HCC組的變異率為50%和37.5%，顯著高于CHB組（10%，χ2=7.619，P=0.022）；位點(diǎn)A1317G在LC組和HCC組的變異率為35.71%和50%，顯著高于CHB組（5%，χ2=8.019，P=0.018），見(jiàn)表2。

3 討論

我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)。60%的人群被HBV感染過(guò)，10%的人群為HBsAg陽(yáng)性攜帶者[5]。HBV感染是導(dǎo)致慢性肝臟疾病發(fā)生甚至HCC的最主要因素。HBV基因組是雙鏈環(huán)狀DNA，分結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。目前已確定的開(kāi)放讀碼框有PreS/S、PreC/ C、Pol以及X[6，7]。HBV調(diào)節(jié)序列由四個(gè)啟動(dòng)子（C、X、SPI、SPII）和兩個(gè)增強(qiáng)子（EnhI、EnhII）組成。HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子位于955~1359之間，是HBV基因組中的順式作用元件，包括調(diào)控區(qū)、核心區(qū)以及X基因啟動(dòng)子區(qū)[8]。位于S-ORP下游的Enh I，可調(diào)控基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中起重要作用，可與某些特定的細(xì)胞因子相結(jié)合，增加HbsAg、HbcAg和HbxAg的表達(dá)。研究表明Enh I的缺失可引起轉(zhuǎn)錄水平的下降[9]。HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子定位于P基因中，末端于X基因啟動(dòng)子重疊，該段基因能與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，提高各啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平，上調(diào)前基因組RNA的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)病毒復(fù)制。HBV X蛋白可反式激活Enh I對(duì)全基因組或是亞基因組啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)錄，Enh I又增強(qiáng)了反式激活的易感性[10]。EnhI/X基因啟動(dòng)子在調(diào)節(jié)HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄上發(fā)揮重要作用，其序列上某些位點(diǎn)的突變可引起增強(qiáng)子活性的改變，導(dǎo)致各啟動(dòng)子活性的下調(diào)，病毒載量的降低，使病毒復(fù)制能力下降而發(fā)生免疫逃逸，導(dǎo)致病毒難以清除，引起HBV感染慢性化。X基因啟動(dòng)子突變可增加HBxAg的表達(dá)，增加肝癌發(fā)生的機(jī)會(huì)[11]。

表2 CHB、LC和HCC患者間HBV Enh I/X基因啟動(dòng)子變異發(fā)生頻數(shù)比較

本研究對(duì)125份標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，最終獲得HBV Enh-I/X基因42份。其中慢性乙型肝炎(CHB)20例，肝硬化（LC）14例，肝細(xì)胞癌（HCC）8例。以AF100309為參考序列，發(fā)現(xiàn)14個(gè)主要突變位點(diǎn)，突變率較高的位點(diǎn)有A1077C，A1123T和G1218C/ A在CHB、LC及HCC組中的突變率分別為：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42.9%和50%。然而某些位點(diǎn)（如G1218C/A）的突變率雖然很高，在CHB、LC和HCC三組間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)CHB、LC和HCC三組患者間進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)HBV Enh-I/X基因啟動(dòng)子出現(xiàn)了不同程度的變異。位點(diǎn)A1077C在LC組和HCC組的變異率為64.29%和50%，顯著高于CHB組（20%，χ2=7.076，P=0.029）。有報(bào)道稱肝細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白因子可與HBV EnhI核心區(qū)相互作用，調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平[12]。位于核心區(qū)的A1077C突變可能影響EnhI活性，降低病毒顆粒的分泌，造成病毒的免疫逃逸和持續(xù)性感染。位點(diǎn)A1123T在LC組和HCC組的變異率為50%和37.5%，顯著高于CHB組（10%，χ2=7.619，P=0.022）。nt1123位點(diǎn)的變異可能影響其與HNF3轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，降低Enh I活性，抑制HBV的基因表達(dá)與復(fù)制，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的清除，造成乙肝慢性化[13，14]。核心區(qū)其他突變A1080G、C1135T和G1137A在三組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。位點(diǎn)A1317G在LC組和HCC組的變異率為35.71%和50%，顯著高于CHB組（5%，χ2= 8.019，P=0.018）。A1317G位于X基因重疊區(qū)，可以影響X啟動(dòng)子的活性，引起肝內(nèi)炎癥活動(dòng)，加快疾病進(jìn)程[15，16]。本研究變異位點(diǎn)與既往報(bào)道并不完全一致，可能因?yàn)椴煌貐^(qū)所流行的基因型和亞型具有差異性，也可能與所選對(duì)象的肝炎癥狀、病毒載量等有關(guān)。有報(bào)道稱G1053A和G1229A的變異是肝硬化患者發(fā)生HCC的高危因素[3]，但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)的突變，而本文發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)A1077C在LC組和HCC組的變異率顯著高于CHB組，此前尚未有過(guò)報(bào)道，其與肝癌發(fā)生的相關(guān)性是否在本地普遍流行還需進(jìn)一步研究。

HBV的突變可影響轉(zhuǎn)錄水平及復(fù)制水平，往往使感染后的病情進(jìn)展趨于復(fù)雜。對(duì)HBV Enh I/X基因啟動(dòng)子的突變及其與疾病進(jìn)程的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)A1077C、A1123T和A1317G的位點(diǎn)突變或許可以作為CHB發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的預(yù)警信號(hào)，但仍需更大樣本和更深入的縱向研究來(lái)確定Enh I/X基因啟動(dòng)子的突變?cè)诟闻K疾病進(jìn)程中的作用。本研究的不足之處是未檢測(cè)出C基因型，不同基因型是否影響疾病發(fā)展尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

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R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2016)06-0728-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.06.010

2016-07-25；

2016-11-23)

贛州市科技局指導(dǎo)性計(jì)劃課題，編號(hào)：GZ2015ZSF109

肖九長(zhǎng)，1969年9月生，學(xué)士學(xué)位，副主任技師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)、腫瘤免疫及分子生物學(xué)。Email：18007079870@126. com

鄒淑慧，1988年11月生，碩士學(xué)位，檢驗(yàn)技師，研究方向?yàn)椴≡飳W(xué)。E-mail：364235529@qq.com