范彩霞 范世平 陳志喜 賴淑貞 鄭錦坤 賴新華

鼻咽清顆粒對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞周期和凋亡的影響及可能機(jī)制*

范彩霞1范世平1陳志喜1賴淑貞1鄭錦坤1賴新華1

目的 探討鼻咽清顆粒對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞周期、凋亡影響及其可能作用機(jī)制。方法 CNE-2細(xì)胞Hoechst 33342-PI雙染后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)（flow cytometry FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡考察鼻咽清顆粒對(duì)CNE-2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，West-blot考察鼻咽清顆粒對(duì)CNE-2細(xì)胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比，隨著鼻咽清顆粒濃縮液濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，G1的比例增加，West-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中鼻咽清主藥濃度的增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Caspase-3蛋白表達(dá)增加，抑制細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 鼻咽清顆粒能誘導(dǎo)caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，將CNE-2細(xì)胞阻滯于G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

鼻咽清顆粒；鼻咽癌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)為我國(guó)一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，俗稱廣東瘤(Canton Cancer)，年發(fā)病率為10～25/l0萬(wàn)人，占全身惡性腫瘤的2.81%，居第8位[1，2]。目前鼻咽癌臨床治療手段主要有放療或以放療為主、化療、生物治療為輔的綜合治療?；熢诒茄拾┑闹委熤邪l(fā)揮重要作用，但是由于化療導(dǎo)致的骨髓抑制，惡心、嘔吐、食欲下降等消化道不良反應(yīng)以及肝、腎功能損害，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。而中成藥或中藥提取物在腫瘤治療方面通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療與化療的敏感性、減輕放療與化療的毒副作用、直接殺傷癌細(xì)胞、抑制癌癥組織的發(fā)展，防止癌癥轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，提高無(wú)病生存率與改善患者生活質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用[3-5]。鼻咽清顆粒主要由重樓、夏枯草、兩面針、蛇泡勒、野菊花、蒼耳子、龍膽草、太子參八味中藥組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，組方中重樓、夏枯草、兩面針、蛇泡勒、野菊花、龍膽草等都具有抗腫瘤活性[6-11]，具有清熱解毒，消炎散結(jié)功效的鼻咽清沖劑，在臨床上主要用于鼻咽腫痛，鼻咽慢性炎癥，鼻咽癌放射治療后分泌物增多等，可能有協(xié)同抗癌和放療增敏等潛能，相關(guān)研究尚不夠深入。

本研究以鼻咽癌細(xì)胞CNE-2細(xì)胞株為模型，體外考察鼻咽清顆粒對(duì)CNE-2細(xì)胞周期及凋亡的影響并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行研究。從而為鼻咽清顆粒對(duì)NPC輔助治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-8恒溫水浴鍋 (金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)，Bio-II-A/M生物安全柜（西班牙TELSTAR），奧林巴斯IX73倒置顯微鏡、Thermo Scientific Series 8000直熱式CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世科技有限公司），Elx酶標(biāo)儀（Bio-TEK-INSTUMENTS INC)，TE2000-E熒光倒置顯微鏡（Nikon），EPICS XL流式細(xì)胞儀(美國(guó)COULTER公司)，臺(tái)式低溫超速離心機(jī)(3K18,德國(guó)Sigma)、瓊脂糖水平電泳槽和電泳儀 (E-C APPARATUERS)、凝膠成像儀(Eppendorf)、超聲細(xì)胞粉碎儀（JY92-IIN浙江寧波新芝）；聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（Mini PROTEAN 3 Cell，美國(guó)Bio-Rad)；真空轉(zhuǎn)印儀（bio-rad785型美國(guó)）；小型臺(tái)式離心機(jī)(Sigma 1-15)；Chemi Imager 5500 V2.03掃描系統(tǒng)、Fluor Chen 2.0和JS-6800凝膠圖像分析（上海繼錦化學(xué)有限公司）。

1.2 試劑

胰蛋白酶（GIBCO）、甲基噻唑藍(lán) (MTT)(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO），Annexin V-FITC/ PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒 (貝博生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒 (碧云天)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，注射用順鉑（齊魯制藥，批號(hào)：20140724）。Trisbase(上海生工公司)，TRIZOL總RNA提取試劑 (Invitrogen公司)，DL-2000 DNA Marker(寶生物公司)，溴化乙錠(EB)（北京新經(jīng)科公司），焦碳酸二乙酯(DEPC)(北京新經(jīng)科公司)，小鼠抗Bcl-2和Caspase3(Santa Cruz公司)，山羊抗小鼠、兔抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(北京中山生物技術(shù)公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.3 細(xì)胞株

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)贈(zèng)送。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥材

重樓、夏枯草、兩面針、蛇泡勒、野菊花、蒼耳子、龍膽草、太子參八味中藥均購(gòu)自廣東省國(guó)藥控股韶關(guān)分公司，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的副主任中藥師鑒定驗(yàn)收。

2 方法

2.1 鼻咽清方濃縮液的制備

按照鼻咽清顆粒處方組成比例，根據(jù)本院醫(yī)院制劑生產(chǎn)規(guī)范，取地道藥材，置提取罐中,加水回流提取2次，每次沸后兩小時(shí),過(guò)濾棄渣,合并提取液,藥液濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.30(80℃)的稠膏，濃縮體積相當(dāng)于干藥材的質(zhì)量（1ml濃縮液相當(dāng)于1g干藥材質(zhì)量），充分?jǐn)嚢琛⒐嘌b、滅菌，配制鼻咽清方濃縮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)考察鼻咽清方濃縮液加入量對(duì)CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/ml，接種于24孔板中，每孔接種500 μL。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液和不同體積的鼻咽清顆粒濃縮液，使其終濃度為相當(dāng)于生藥量10、20、30、40、50mg/ml，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，陰性對(duì)照組只加培養(yǎng)基不加藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入50μm濃度為100μg/ml Hoechst 33342 37℃染色15min，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，再加入濃度為50μg/ml的PI染色液于冰上染色15min，PBS洗滌2次，于熒光倒置顯微鏡在藍(lán)色光源下觀察并拍照。

2.4 Annexin-V-FITC/PI雙染分析鼻咽清顆粒濃縮液對(duì)CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞培養(yǎng)、取生藥量為0、10、20、30mg/ml組和陽(yáng)性對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照組選用5μg·ml-1順鉑溶液，分別在給藥24h后，用不含EDTA的胰酶消化，1000r/min離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，每組3個(gè)樣本。按照試劑盒的說(shuō)明方法處理染色細(xì)胞：PBS洗滌1次后，用1ml PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)（細(xì)胞數(shù)量不少于105），然后1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，加入400μl 1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞。加入5μl AnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。加入10μl PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5分鐘。2次，加入5μl FITC Annexin-V避光染色5min，和5μl PI，輕微振蕩，室溫下（25°C）避光孵育15min流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 流式細(xì)胞儀分析鼻咽清顆粒對(duì)CNE-2人鼻咽癌細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，PBS洗2遍后，0.25%胰蛋白酶液消化，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制備DMEM全培配成濃度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于7.5cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5ml。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液及鼻咽清顆粒濃縮液，使其終濃相當(dāng)于生藥量為10mg/ml，20mg/ml和30mg/ ml,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照加相同體積的培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加入適量順鉑注射液并用培養(yǎng)基稀釋，使順鉑濃度為5μg/ml。分別在給藥后24h，0.25%胰酶+EDTA消化，離心收集，PBS洗2次，細(xì)胞沉淀用70%乙醇懸浮，在-20℃冰箱固定24h以上。PBS離心洗去乙醇后，取碧云天公司細(xì)胞周期和凋亡試劑盒，并按照試劑盒說(shuō)明染色30分鐘，400目篩網(wǎng)過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，分析細(xì)胞周期并測(cè)定凋亡率（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)630nm）。

2.6 Western blot法檢測(cè)檢測(cè)Bac-2和caspase-3的表達(dá)

按2.5方法培養(yǎng)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞、分組。加入鼻咽清方濃縮液及含有順鉑溶液后（陽(yáng)性對(duì)照），培養(yǎng)24h后，4℃預(yù)冷的PBS洗2次，按照west-blot總蛋白提取方法提取蛋白、測(cè)定蛋白含量，按照Western Blot說(shuō)明書(shū)提示檢測(cè)Bcl-2、Caspase3蛋白的表達(dá)。使用Chemi Imager 5500 V3.0軟件進(jìn)行圖像灰度掃描，F(xiàn)luor Chen 2.0分析軟件進(jìn)行分析，獲取目的條帶的整合光密度值(IDV)作為表達(dá)強(qiáng)度，以β-actin作為蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行比較。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)的處理

數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)性意義。

結(jié)果

1 熒光倒置顯微鏡觀察不同濃度鼻咽清方對(duì)CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)Hoechst-PI雙染的CNE-2細(xì)胞，陰性對(duì)照組細(xì)胞大小均一，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞著色少，大部分呈低藍(lán)色，只有極少量的呈高藍(lán)色。隨著培養(yǎng)基中鼻咽清方濃縮液濃度的增加，紫外燈激發(fā)下，呈亮藍(lán)色比例增加，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)致密濃染顆粒狀熒光當(dāng)鼻咽清方濃縮液濃度為40mg、50mg/ml，大部分細(xì)胞呈亮藍(lán)色，出現(xiàn)大量凋亡小體，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度鼻咽清顆粒濃縮液與CNE-2細(xì)胞孵化24h后、Hoechst 33342-PI雙染的熒光倒置顯微鏡圖

2 流式細(xì)胞儀分析鼻咽清顆粒對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

FCM分析顯示0、10、20、30mg(以生藥量計(jì)算)/ ml鼻咽清顆粒濃縮液作用24h后,隨著生藥量濃度增加，凋亡細(xì)胞的比例逐步增加，存在良好的線性關(guān)系，有很好的相關(guān)性，滿足凋亡率Y=0.811x(濃度) +1.56，R2=0.9996。見(jiàn)圖2。

圖2 鼻咽清方濃縮液的濃度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 流式細(xì)胞儀分析鼻咽清顆粒對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

FCM分析細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明，0、10、20、30mg/ ml鼻咽清方濃縮液和含有順鉑注射液的培養(yǎng)基與鼻咽癌CNE-2細(xì)胞孵化24h后，G1期細(xì)胞比例分別為（42.62±5.05%，47.91±6.97%,55.34±6.46%和68.71±7.89和76.68±6.46%），差異顯著（P<0.05），說(shuō)明鼻咽清方濃縮液可將CNE-2細(xì)胞阻滯于G1期，隨著鼻咽清方濃縮液濃度的增加，阻滯作用越明顯。

4 鼻咽清顆粒對(duì)CNE-2細(xì)胞Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)影響

不同劑量的鼻咽清方濃縮液與CNE-2細(xì)胞作用24h后，Western Blot法檢測(cè)Bcl-2和Caspase3蛋白的表達(dá)。如圖3所示，鼻咽清方濃縮液以劑量依賴方式抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Caspase3蛋白表達(dá)，與空白對(duì)照組，10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml和20μg/ml順鉑組分別顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平（P<0.01）,并促進(jìn)caspase-3蛋白的表達(dá)（P<0.01)。

圖3 鼻咽清方濃縮液對(duì)CNE-2細(xì)胞Bcl-2和Caspase3蛋白表達(dá)的影響（n=8）

討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與很多因素相關(guān)，而細(xì)胞凋亡的減少是其中一個(gè)關(guān)鍵因素。臨床實(shí)踐表明，單獨(dú)應(yīng)用中藥或中西醫(yī)結(jié)合治療某些腫瘤療效確切，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡就是它們治療惡性腫瘤的主要途徑之一[13]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，從受基因編程調(diào)控的意義上講，細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death）而細(xì)胞凋亡發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是多樣的，這些途徑之間相互促進(jìn)或制約，形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中P53蛋白、Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白等在凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[14，15]。

本研究通過(guò)Hoechst 33342-PI雙染的結(jié)果表明，不同濃度的鼻咽癌濃縮液與人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞孵化24h后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不同程度的皺縮，變形，胞漿濃縮、核染色質(zhì)聚集及核固縮現(xiàn)象，出現(xiàn)凋亡小體。尤其是高濃度組，出現(xiàn)大量凋亡小體。FCM細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明，隨著鼻咽清方濃縮液生藥濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例逐步增加，有良好的線性及正相關(guān)性，提示鼻咽清方濃縮液對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，west-blot結(jié)果提示隨著鼻咽清方濃縮液濃度的增加，抑制細(xì)胞凋亡的蛋白Bcl-2表達(dá)下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白caspase-3表達(dá)增加，各組差異顯著，可能鼻咽清方濃縮液相關(guān)有效成分作用于靶細(xì)胞與CNE-2細(xì)胞表面受體結(jié)合后，下調(diào)抗細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白和上調(diào)促細(xì)胞凋亡caspase-3蛋白的表達(dá),從而細(xì)胞凋亡凋亡有關(guān)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的鼻咽清方濃縮液作用于CNE-2細(xì)胞24h，結(jié)果表明細(xì)胞被阻滯在G1期。

通過(guò)本研究表明鼻咽清顆粒可以通過(guò)抑制抗凋亡細(xì)胞蛋白如Bcl-2及促凋亡蛋白如Caspase-3的表達(dá)，將鼻咽癌細(xì)胞CNE-2細(xì)胞阻滯于G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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（收稿:2016-04-06 修回：2016-06-06）

Bi-Yan-Qing Granula influence nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2 on cell cycle distribution and cell apoptosis

FAN Caixia,CHEN Zhixi,FAN Shiping,LAI Shuzhen,ZHENG Jinkun,Lai Xinhua
Affiliated YueBei People’s Hospital of Medical College of Shantou University,Guangdong,Shaoguan,512026

Objective To investigate the influence and p-otential machnism of Bi-Yan-Qing Granula on cell cycle distribution and apoptosis of nasopharyngeal cancinoma cell CNE-2.Methods CNE-2 cell apoptosis was observed by Hoechst-PI double staining;while cell cycle distribution and apoptosis was evaluated by flow cytometry(FCM),West-blot was uesed to determine the experess of Caspase-3 and Bcl-2.Results With the increase of the concentration of Bi-Yan-Qing solution,apopotosis and G1 phase increase compared with control group(P<0.05),West Blot showed after treatment with Bi-Yan-Qing Granula concentrated solution caspase-3 protein expression increased,while Bcl-2 protein expression decresed.Conclusions Bi-Yan-Qing Granula can promote apoptosis and G1 Cell cycle arrest of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2 by inducing expression of caspase-3 protein as well as inhibiting Bcl-2 protein expression.

Bi-Yan Qing Granula;nasopharyngeal carcinoma cell line;cell apoptosis;cell cycle

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.003

廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目（20122043）韶關(guān)市醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目Y12159

廣東省重大新藥創(chuàng)制重大科技專項(xiàng)資金項(xiàng)目2013A022100011

1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院（廣東韶關(guān)，512026）

范彩霞,副主任藥師.Email:mydream0509@qq.com