王慧 魏娟 劉烔 汪芳裕

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·論著·

FHL1在慢性胰腺炎胰腺組織中的表達及其臨床意義

王慧 魏娟 劉烔 汪芳裕

目的 探討細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FHL1在慢性胰腺炎(CP)胰腺組織中的表達及其臨床意義。方法 采集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科收治的20例CP患者和同期體檢合格的健康者血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清FHL1水平。取20只雄性Wistar大鼠，按體重隨機分成對照組和CP組。通過大鼠尾靜脈注射二丁基二氯化物建立CP模型。建模后28 d處死大鼠，分離大鼠胰腺，HE染色觀察胰腺組織的病理變化。采用免疫組織化學(xué)染色法和蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺組織FHL1的表達。結(jié)果 CP患者、健康對照者血清FHL1水平分別為(0.86±0.22)、(1.18±0.22)g/L，CP患者血清FHL1水平顯著低于健康者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.54，P=0.001)。CP組大鼠胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，腺泡萎縮變形，纖維組織增生明顯，其胰腺組織異常結(jié)構(gòu)、腺泡萎縮、纖維化、炎性細胞浸潤的病理評分分別為(2.2±0.4)、(2.0±0.7)、(2.4±0.3)、(2.8±0.6)分，對照組均為0分，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為17.24、9.01、25.22、14.75，P值均<0.001)。CP組大鼠胰腺組織FHL1蛋白表達量顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(免疫組織化學(xué)法：15 798±3 247比37 570±9 254，t=2.438,P=0.016；蛋白質(zhì)印跡法：0.44±0.11比0.89±0.03，t=4.289,P=0.002)。結(jié)論 FHL1蛋白在CP胰腺組織中低表達，可能參與胰腺纖維化的形成。

胰腺炎，慢性； 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)成分； 纖維化； FHL1

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81270453)

FHL1(four and a half LIM) 蛋白是一種細胞骨架相關(guān)蛋白，廣泛參與蛋白質(zhì)之間的相互作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)FHL1具有抑制腫瘤生長作用[1]。研究報道，F(xiàn)HL1蛋白在胰腺癌中低表達，參與胰腺癌的發(fā)生過程[2]。慢性胰腺炎(CP)與胰腺癌的發(fā)生關(guān)系密切[3-5]，其中，胰腺纖維化是CP與胰腺癌共同的病理標志。為探討FHL1蛋白與CP的關(guān)系，本研究采用成組設(shè)計、隨機對照的方法檢測CP胰腺組織FHL1蛋白的表達，探討其臨床意義。

材料與方法

一、臨床患者血清標本

選擇2014年8月至2015年10月間南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科確診、臨床資料完整的20例CP患者，其中男性12例，女性8例，年齡42～58歲，平均年齡48歲。選擇體檢合格的健康者20名作為對照，其中男性9例，女性11例，年齡38～65歲，平均年齡52歲。CP患者于入院后第1天空腹抽取外周靜脈血2 ml，離心收集血清，同法收集健康者的血清，血清分裝后凍存于深低溫冰箱。本研究符合南京總醫(yī)院倫理委員會制定的倫理標準，兩組成員均簽署知情同意書。

二、實驗動物及分組

20只清潔級雄性Wistar大鼠購于江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司，6～8周齡，體重(190±10)g，飼養(yǎng)1周后按體重隨機分為對照組和CP組，每組10只。CP組參考文獻[6]，采用尾靜脈注射二丁基二氯化物(dibutyltin dichloride, DBTC)8 mg/kg體重的方法誘導(dǎo)大鼠慢性胰腺纖維化。對照組尾靜脈注射等容積生理鹽水。28 d后處死動物，取胰腺組織，部分用10%多聚甲醛固定，部分置-80℃冰箱保存。

三、檢測指標

1．人血清FHL1水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測CP患者和健康對照者血清FHL1水平。ELISA檢測試劑盒購置于武漢華美生物公司，按說明書操作。根據(jù)標準品的A450值繪制標準曲線，獲取二元方程式，計算待測標本FHL1水平。

2．大鼠胰腺組織病理學(xué)檢查：取甲醛固定的大鼠胰腺組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察胰腺組織病理變化，并參照van Westerloo等[7]的方法，從異常結(jié)構(gòu)、腺泡萎縮、纖維化、炎性細胞浸潤4個方面進行病理評分。

3．大鼠胰腺組織FHL1蛋白表達檢測：取上述切片，采用免疫組織化學(xué)SP染色法檢測FHL1蛋白表達。兔抗鼠FHL1一抗購于美國Abcam抗體公司(ab49241)，工作濃度1∶200。以PBS代替一抗作為陰性對照。羊抗兔二抗、HRP工作液以及DAB顯色液均購于福州邁新生物有限公司。細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。高倍鏡下隨機選取3個視野進行觀察并拍照，通過圖像分析軟件Image-proplus-6根據(jù)染色范圍和染色強度測量出A50值。

同時，取-80℃冰箱保存的胰腺組織20 mg，加入100 μl組織裂解液提取組織蛋白，經(jīng)BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺組織FHL1蛋白表達。以β-Tbulin為內(nèi)參。兔抗鼠FHL1抗體工作濃度1∶2 000；羊抗兔二抗(D110063)購自上海生工生物工程有限公司，工作濃度1∶1 000。最后ETC發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影。采用Image J軟件掃描圖片，獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、人血清FHL1蛋白水平

CP患者血清FHL1蛋白水平為0.99～1.29g/L，平均(0.86±0.22)g/L，健康者血清FHL1蛋白水平為0.7～1.10g/L，平均(1.18±0.22)g/L。CP患者血清FHL1水平顯著低于健康者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.54，P=0.001)。

二、大鼠胰腺組織病理變化

造模28d后對照組大鼠胰腺組織質(zhì)地柔軟，色澤白亮；鏡下見胰腺小葉輪廓清晰，腺泡細胞形態(tài)飽滿呈錐體形，排列整齊有序，未見炎性細胞浸潤及纖維組織增生。CP組大鼠胰腺組織色澤黃白，質(zhì)地偏硬；鏡下見胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴重，輪廓不清，間質(zhì)內(nèi)大量纖維組織增生，腺泡細胞萎縮、壞死和空泡樣變性，小葉間和腺泡內(nèi)有大量炎性細胞浸潤(圖1)。CP組胰腺組織異常結(jié)構(gòu)、腺泡萎縮、纖維化、炎性細胞浸潤的病理評分分別為(2.2±0.4)、(2.0±0.7)、(2.4±0.3)、(2.8±0.6)分，對照組均為0分，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為17.24、9.01、25.22、14.75，P值均<0.001)，表明CP造模成功。

圖1 對照組(1A)、CP組(1B)大鼠胰腺組織病理變化 (HE ×200)

三、大鼠胰腺組織中FHL1蛋白表達量的變化

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示,對照組、CP組大鼠胰腺組織FHL1蛋白表達的A50值分別為37 570±9 254、15 798±3 247，CP組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.438，P=0.016，圖2)。

圖2 對照組(2A)、CP組(2B)大鼠胰腺組織FHL1蛋白表達 (免疫組化 ×200)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，對照組、CP組大鼠胰腺組織FHL1蛋白相對表達量分別為0.89±0.03、0.44±0.11。CP組大鼠胰腺組織FHL1蛋白表達量顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.289, P=0.002, 圖3)。

圖3 對照組(N1～N3)、CP組(C1～C3)大鼠胰腺組織FHL1蛋白表達 (蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

CP的年發(fā)病率為5～12/10萬，患病率約為50/10萬，男性占比較多[8]。CP發(fā)病的具體機制尚不完全清楚，其發(fā)生主要與酗酒、吸煙、肥胖、藥物暴露、血型及自身免疫等因素有關(guān)，其中酗酒是CP最常見的致病因素[9-10]。

FHL1蛋白是一種細胞骨架相關(guān)蛋白，隸屬于LIM蛋白超家族中的FHL蛋白家族。FHL蛋白家族的特點是擁有4.5個的LIM蛋白結(jié)構(gòu)域，為FHL1調(diào)節(jié)蛋白相互作用的功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。文獻報道，F(xiàn)HL1廣泛分布于心、腦、肺、肌肉等不同器官和組織中，尤其在心肌和骨骼肌高表達，它參與調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄因子和細胞骨架蛋白的表達和活性，在器官和組織分化及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。近年來，采用微陣列分析和免疫組織化學(xué)染色法對人類腫瘤的臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL1蛋白在胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、皮膚癌等腫瘤組織中表達降低[1-2,13]，而上調(diào)FHL1蛋白表達可顯著抑制腫瘤細胞的生長[14]。因此，F(xiàn)HL1作為抑癌基因而被深入研究。

目前，慢性炎癥與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系已經(jīng)得到公認，比如食管癌與Barretts化生、結(jié)直腸癌與炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病等[15]。CP患者罹患胰腺癌的相對危險度為13.3，其誘發(fā)胰腺癌的風(fēng)險是一般人群的15～16倍[3,5]。因此，對于CP發(fā)病機制的研究和易患人群的早期篩查與診斷，具有重要的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，CP大鼠胰腺組織FHL1蛋白低表達，CP患者血清FHL1水平較健康者低，提示FHL1蛋白可能參與CP的纖維化進程，可以作為CP診斷的一個輔助指標和診斷依據(jù)。但本研究只是對FHL1參與CP的纖維化過程進行了初步探討，而對于FHL1參與調(diào)控CP的胰腺纖維化的具體細胞和分子機制亟待更進一步深入研究。

[1]ShathasivamT,KislingerT,GramoliniAO.Genes,proteinsandcomplexes:themultifacetednatureofFHLfamilyproteinsindiversetissues[J].JCellMolMed, 2010, 14(12): 2702-2720.DOI: 10.1111/j.1582-4934.2010.01176.x.

[2] 劉哲, 許元鴻, 龍錦, 等.FHL1在人胰腺癌族中的表達及其與胰腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究 [J]. 臨床與病理雜志, 2015, 35(3): 423-427.DOI:10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.019.

[3]RaimondiS,LowenfelsAB,Morselli-labateAM,etal.Pancreaticcancerinchronicpancreatitis;aetiology,incidence,andearlydetection[J].BestPractClinGastroenterol, 2010, 24(3): 349-358.DOI: 10.1016/j.bpg.2010.02.007.

[4]JuraN,ArcherH,Bar-sagiD.Chronicpancreatitis,pancreaticadenocarcinomaandtheblackboxin-between[J].CellRes, 2005, 15(1): 72-77.DOI:10.1038/sj.cr.7290269.

[5]VakkilaJ,LotzeMT.Inflammationandnecrosispromotetumourgrowth[J].NatRevImmunol, 2004, 4(4): 641-648.DOI: 10.1038/nri1415.

[6] 陳浩宇, 王茜, 陳潔.IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化中的表達及其意義[J]. 中華胰腺病雜志, 2016, 16(2): 115-118.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.009.

[7]VanWesterlooDJ,FlorquinS,deBoerAM,etal.Therapeuticeffectsoftroglitazoneinexperimentalchronicpancreatitisinmice[J].AmJPathol, 2005, 166(3): 721-728.DOI: 10.1016/S0002-9440(10)62293-6.

[8]HirotaM,ShimosegawaT,MasamuneA,etal.ThesixthnationwideepidemiologicalsurveyofchronicpancreatitisinJapan[J].Pancreatology, 2012, 12(2): 79-84.DOI: 10.1016/j.pan.2012.09.001.

[9]CoteGA,YadavD,SlivkaA,etal.AlcoholandSmokingasRiskFactorsinanEpidemiologyStudyofPatientsWithChronicPancreatitis[J].ClinGastroenterolHepatol, 2011, 9(3): 266-273.DOI: 10.1016/j.cgh.2010.10.015.

[10]YadavD,LowenfelsAB.Theepidemiologyofpancreatitisandpancreaticcancer[J].Gastroenterology, 2013, 144(6): 1252-1261.DOI: 10.1053/j.gastro.2013.01.068.

[11]SchesslJ,FeldkirchnerS,KubnyC,etal.ReducingbodymyopathyandotherFHL1-relatedmusculardisorders[J].SeminPediatrNeurol, 2011, 18(4): 257-263.DOI: 10.1016/j.spen.2011.10.007.

[12]ShalabyS,HayashiYK,NonakaI,etal.NovelFHL1mutationsinfatalandbenignreducingbodymyopathy[J].Neurology, 2009, 72(4): 375-376.DOI: 10.1212/01.wnl.0000341311.84347.a0.

[13]SakashitaK,MimoriK,TanakaF,etal.ClinicalsignificanceoflossofFhl1expressioninhumangastriccancer[J].AnnSurgOncol, 2008, 15(8): 2293-300.DOI: 10.1245/s10434-008-9904-3.

[14]DingI,NiuC,ZhengY,etal.FHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowth[J].JCellMolMed, 2011, 15(1): 72-85.DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00938.x.

[15]OrlandoRC.Mechanismsofepithelialinjuryandinflammationingastrointestinaldiseases[J].RevGastroenterolDisord, 2002, 2Suppl2:S2-S8.

(本文編輯：屠振興)

Expression of FHL1 and the significance in pancreatic fibrosis of chronic pancreatitis

WangHui,WeiJuan,LiuTong,WangFangyu.

DepartmentofGastroenterology,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,PLA,Nanjing21002,China

WangFangyu,Email:wangfangyu2014@126.com

Objective To explore the expression of transcriptional regulation factor FHL1 in pancreatic fibrosis of chronic pancreatitis (CP) and clinical significance. Methods Serum samples from 20 CP patients treated in the Department of Gastroenterology, Nanjing General Hospital and 20 healthy controls in the corresponding period were collected. The level of FHL1 in the serum was detected by ELISA. Twenty male Wistar rats were randomly divided into control group and CP group according to the body weight. The CP rat model was established by injecting dibutyltin dichloride (DBTC) through tail vein. All the rats were killed at 28 days after injection and the pancreas was collected, which was observed using hematoxylin and eosin (HE) staining to investigate pathological changes. The expression of FHL1 in pancreas was measured by immunohistochemistry (IHC) and Western blotting (WB). Results The average of serum FHL1 level in two groups were (0.86±0.22)g/L and (1.18±0.22)g/L, respectively. The level of FHL1 in serum of CP patients was significantly lower than that of healthy cases, and the difference was statistically significant (t=10.54,P=0.001). Damaged pancreatic lobular structure, acinar atrophy and the obvious fibrous hyperplasia were observed in CP rats. The pathological score of abnormal structure, acinar atrophy, fibrosis,and inflammatory cell infiltration in the pancreas of the CP group was (2.2±0.4),(2.0±0.7),(2.4±0.3) and (2.8±0.6), respectively, but was all 0 in control group. The difference between two group was statistically significant (tvalue=17.24, 9.01, 25.22 and 14.75, respectively, allP<0.001). The expression of FHL1 in the pancreatic tissue of CP group were less than that of normal group, and the difference was statistically significant (IHC: 15 798±3 247vs37 570±9 254,t=2.438,P=0.016; WB: 0.44±0.11vs0.89±0.03,t=4.289,P=0.002). Conclusions The protein of FHL1 was in low expression in the pancreas of CPs, indicating that FHL1 may participate in the formation of pancreatic fibrosis.

Pancreatitis, chronic; Colon, descending; Fibrosis; FHL1

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.009

210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科

汪芳裕，Email: wangfangyu2014@126.com

國家自然科學(xué)基金面上項目(81270453)

2016-07-12)