張琳 郭志琴 袁琳娜 溫曉偉 王振 張怡 汪靜宇 鄔萬新

USP22、FoxM1在結直腸癌中的表達研究

張琳 郭志琴 袁琳娜 溫曉偉 王振 張怡 汪靜宇 鄔萬新

目的 探討去泛素酶基因（USP22）和叉頭框M1基因（FoxM1）表達在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以及與患者臨床病理特征的關系。方法 選取行手術切除的結直腸癌組織標本120例和正常結直腸黏膜組織標本32例；采用免疫組織化學EnVision二步法和Western blot檢測結直腸癌組織及相應癌旁正常組織中USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin通路相關蛋白（β-catenin、LEF/TCF、c-myc）的表達。 結果 結直腸癌組織中USP22、FoxM1的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織（均P＜0.05）。結直腸癌組織中USP22、FoxM1、β-catenin、LEF/TCF、c-myc蛋白的表達水平均明顯高于癌旁正常組織（均P＜0.05）。結直腸癌組織中USP22、FoxM1表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、肝臟轉移及Duke's分期均有關（均P＜0.05）；且USP22/FoxM1共表達與腫瘤淋巴結轉移、肝臟轉移及Duke's分期亦均有關（均P＜0.05）。結論 結直腸癌組織中USP22、FoxM1的異常高表達可能參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，且兩者具有協(xié)同作用。

結直腸癌 去泛素酶基因 叉頭框M1 臨床病理特征

結直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3位，嚴重危害人類健康。分子靶向治療憑借高效、低毒的優(yōu)勢已成為抗腫瘤治療的發(fā)展趨勢，尋找分子靶向治療的潛在靶點是目前研究的熱點。去泛素酶基因（USP22）是新發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶基因家族中一員，通過去泛素化修飾作用切斷泛素鏈與底物蛋白之間的連接，從而發(fā)揮生物學功能，包括調(diào)控細胞周期、調(diào)節(jié)端粒動態(tài)平衡等。叉頭框M1基因（FoxM1）通過與其下游靶基因的相互作用，在細胞增殖、分化、凋亡等信號通路的調(diào)控中發(fā)揮作用。本研究通過檢測結直腸癌組織中USP22、FoxM1的表達情況，探討兩者在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機制及兩者的相關性，以期為臨床尋找新的結直腸癌治療及判斷預后方法提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 組織標本 選取2012年1月至2013年12月在本院行手術切除并經(jīng)病理學檢查證實為結直腸癌的組織標本120例?；颊咝g前均未行放、化療，其中男76例，女44例；年齡27～88（53.6±9.4）歲。腫瘤分期（Duke’s分期）A期29例，B期39例，C期36例，D期16例；腫瘤高分化39例，中分化53例，低分化28例；有淋巴結轉移51例，無淋巴結轉移69例；有肝臟轉移49例，無肝臟轉移71例。同時選取32例患者對應正常結直腸黏膜組織標本（取自癌旁＞5cm處）作為對照。標本均經(jīng)4%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片和HE染色。

1.2 主要試劑 兔抗人USP22多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人FoxM1抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司；小鼠抗人β-catenin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；小鼠抗人β-actin、LEF/TCF、c-myc抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG均購自美國Sigma公司；ECL購自美國Pierce公司；免疫組織化學二抗顯示系統(tǒng)Real EnVision K5007購自杭州協(xié)博醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 免疫組織化學染色 組織切片置于68℃烘箱中烘片2h，依次將載玻片置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇，在各溶液中放置5min后進行脫蠟，緩速水流沖洗載玻片10min，浸入pH 7.4的PBS中5min×3次，加入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），微波爐中高火檔加熱5min，解凍檔解凍20min進行抗原修復，自然冷卻20min，浸入PBS中5min×3次，3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶6min，PBS浸泡5 min×3次，滴加一抗USP22（1∶200）、FoxM1（1∶50），用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜，次日PBS浸泡5min×3次，二抗顯示采用Real EnVision K5007（按試劑盒說明書）進行免疫組織化學染色，復染、脫水、透明、封片。

1.4 結果判定 根據(jù)切片中陽性細胞比例和細胞著色強度進行結果判定[1-2]，細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判定為陽性，由2位高級職稱病理科醫(yī)師在雙盲條件下讀片。400倍光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，每視野著色細胞比例0%計0分，≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～70%計3分，≥71%計4分。著色強度無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩項計分相乘得分＜5分為表達陰性，≥5分為表達陽性。

1.5 Western blot檢測蛋白表達 隨機選取3對結直腸癌組織及癌旁正常組織用蛋白裂解液提取蛋白，檢測USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白（βcatenin、LEF/TCF、c-myc）表達。蛋白定量后進行SDSPAGE凝膠電泳、轉膜及蛋白染色，用含10%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h，一抗（USP22 1∶1 000；FoxM1 1∶200；β-catenin 1∶250；β-actin 1∶1 000；LEF/TCF 1∶250； c-myc 1∶250）4℃孵育過夜，次日室溫恢復1h后TBST洗膜10min×3次，HRP偶聯(lián)的二抗（1∶1 000）室溫孵育45min，TBST洗膜10min×3次，ECL顯色并分析，以與β-actin的灰度比值為蛋白相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗；計數(shù)資料以構成比表示，兩組比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 結直腸癌、癌旁正常組織中USP22、FoxM1表達情況比較 見圖1、表1。

圖1 結直腸癌、癌旁正常組織中USP22、FoxM1表達情況比較（a：癌旁正常組織；b：結直腸癌組織；EnVision法，×100）

表1 結直腸癌、癌旁正常組織中USP22、FoxM1表達情況比較[例（%）]

由圖1可見，結直腸癌組織中USP22、FoxM1均主要表達于細胞核，而癌旁正常組織中均不表達或弱表達。由表1可見，結直腸癌組織中USP22、FoxM1陽性表達率均高于癌旁正常組織（均P＜0.05）。

2.2 結直腸癌、癌旁正常組織中USP22、FoxM1及Wnt/ β-catenin信號通路相關蛋白表達情況比較 見圖2、表2。

由圖2、表2可見，結直腸癌組織中USP22、FoxM1、β-catenin、LEF/TCF、c-myc蛋白表達水平均高于癌旁正常組織（均P＜0.05）。

2.3 結直腸癌組織中USP22、FoxM1表達與患者臨床病理特征的關系 見表3。

圖2 結直腸癌、癌旁正常組織中USP22、FoxM1及Wnt/βcatenin信號通路相關蛋白表達情況比較（C：結直腸癌組織；N：癌旁正常組織）

表2 結直腸癌、癌旁正常組織中USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平比較

表3 結直腸癌組織中USP22、FoxM1表達與患者臨床病理特征的關系[例（%）]

由表3可見，結直腸癌組織中USP22、FoxM1表達與患者性別、年齡均無關（均P＞0.05），而與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、肝臟轉移和Duke’s分期均有關（均P＜0.05）。同時，USP22/FoxM1共表達與腫瘤淋巴結轉移、肝臟轉移和Duke’s分期亦均有關（均P＜0.05）。

3 討論

USP22定位于人類17號染色體，由14個外顯子構成，其開放閱讀框由1 578個堿基組成，編碼著525個氨基酸。USP22通過調(diào)控多種基因的轉錄發(fā)揮生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，USP22在胃癌組織中高表達[3]；USP22在乳腺癌中的陽性表達率比在乳腺纖維腺瘤和正常乳房組織中高，且與是否發(fā)生淋巴結轉移、Her-2和Ki-67的表達、疾病復發(fā)率密切相關；USP22在結直腸癌中異常表達或可促進癌細胞肝臟轉移，且患者預后較差[4-5]。至今，USP22的異常表達和潛在機制已有初步研究。干擾腫瘤細胞中USP22的表達可以阻滯細胞周期于G1期，抑制細胞增殖，導致細胞凋亡[6-7]。另外，USP22利用去泛素化酶調(diào)節(jié)蛋白質的功能，促進細胞增殖[8]。USP22是致命腫瘤表型的1個關鍵啟動子，其作用是調(diào)節(jié)核受體和致癌信號[9]。

FoxM1基因位于染色體12p13.3末端著絲粒區(qū)域，包含10個外顯子，是1種增殖相關的轉錄因子，僅在具有分裂活性的細胞中表達，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等過程。FoxM1在增殖細胞中廣泛表達，并且在各種惡性腫瘤中顯著上調(diào)，包括胃癌、非小細胞型肺癌、腦膠質瘤、前列腺癌、宮頸癌和胰腺癌等。近來研究表明，在結直腸癌中FoxM1高表達的腫瘤細胞侵襲、轉移能力增強[10]。USP22已被證實在多種腫瘤中高表達，并與細胞周期調(diào)控有關。FoxM1作為1個典型的細胞增殖因子，其在細胞周期調(diào)控中的作用在最近幾年被確認[11]。但是，關于USP22與FoxM1在結直腸癌中表達相關性的研究，國內(nèi)外報道尚不多見。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌組織中USP22、FoxM1的表達異常上調(diào)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)53例（44.2%）結直腸癌組織中存在USP22/FoxM1共表達陽性；結直腸癌組織中USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、LEF/TCF、c-myc的表達水平明顯高于癌旁正常組織。這表明USP22、FoxM1可能參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，且兩者具有協(xié)同作用。然而，USP22、FoxM1在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的具體機制及兩者的相互作用尚不清楚。FoxM1是一種核定位的轉錄因子，在向核內(nèi)轉移的過程中需要Wnt信號通路中的β-catenin伴隨才能發(fā)揮作用，而USP22能去泛素化修飾β-catenin，使β-catenin不被降解。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1能與β-catenin結合并促進其核內(nèi)移位進而上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的活性。因此，筆者推測USP22通過去泛素化胞漿內(nèi)的β-catenin，促進FoxM1的核內(nèi)轉移；FoxM1可能參與USP22介導的細胞周期調(diào)控，最終影響結直腸癌細胞的增殖、侵襲、轉移等過程。綜上所述，USP22、FoxM1在結直腸癌組織中的表達均顯著上調(diào)，且與患者的臨床病理特征相關。兩者可能起協(xié)同作用參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

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Expression of USP22 and FoxM1 in colorectal cancer and its clinicopathological significance

ZHANG Lin,GUO Zhiqin,YUAN Linna,et al.Department of Pathology,Jiaxing First Hospital,Jiaxing 314000，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Ubiquitin-specific protease 22(USP22)and forkhead box M1 (FoxM1)proteins in colorectal cancer and its clinicopathological significance. Methods The expression of USP22 and FoxM1 was detected by immunohistochemical EnVision method and Western blot in 120 specimens of colorectal cancer tissue and 32 specimens of normal colorectal mucosa tissue. Results The positive expression rate of USP22 and FoxM1 in colorectal cancer tissues were significantly higher than that in adjacent normal tissues(both P＜0.05).The expression levels of USP22 and FoxM1 and Wnt/β-catenin proteins in colorectal carcinoma were significantly higher than those in adjacent normal tissue(all P＜0.05). USP22 and FoxM1 expressions were significantly correlated with histological grade,lymph node metastasis,liver metastasis and Duke's stage(all P＜0.05).The co-expression of USP22/FoxM1 was significantly correlated with lymph node metastasis,liver metastasis and Duke's stage in colorectal cancer patients (all P＜0.05). Conclusion Results indicate that USP22 and FoxM1 proteins may be involved in the occurrence and the development process of colorectal cancer.

ColorectalcancerUSP22 FoxM1 Clinicopathologicalfeatures

2016-05-03）

（本文編輯：李媚）

嘉興市第一醫(yī)院“啟明星”計劃（2014-YA-02）；嘉興市科技計劃項目（2013AY21042-3）；浙江省自然科學基金項目（LY15H160067）

314000 嘉興市第一醫(yī)院病理科

鄔萬新，E-mail：wanxinwu@outlook.com