許曉東 李凱強 王震 張昱 陳波旭 陳秉宇 鄭宇 張威

●論 著

烏骨藤提取物對原代新生大鼠心肌細胞的毒性研究

許曉東 李凱強 王震 張昱 陳波旭 陳秉宇 鄭宇 張威

目的 探討烏骨藤提取物（MTE）對原代新生大鼠新生心肌細胞的毒性影響。方法 分離和培養(yǎng)SD大鼠心肌細胞，將MTE組分A溶于二甲基亞砜，分別使用20、40、80、160和320μg/ml的MTE和8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶作為陽性對照處理原代大鼠心肌細胞24 h，采用MTS法測定不同濃度MTE對體外培養(yǎng)原代大鼠心肌細胞增殖的影響；采用RTCA Cardio系統(tǒng)建立體外心臟毒性篩選模型，對大鼠心肌細胞增殖、搏動進行檢測。結(jié)果 原代心肌細胞加入不同濃度的MTE后，細胞存活受到顯著抑制，半數(shù)存活濃度（EC50）為207.3μg/ml，隨著MTE濃度的升高組分A抑制率增強（均P＜0.05）。原代心肌細胞接種到RTCA Cardio E-Plate96孔板上，24h后出現(xiàn)心肌細胞搏動。MTE處理后，細胞指數(shù)（CI）值顯著下降，240μg/ml MTE組分A處理后心肌細胞搏動迅速受到抑制，搏動頻率由126次/min下降至0次/min，且不可恢復(fù)；160μg/ml和80μg/ml處理后分別在12h和6h后抑制作用減弱，搏動頻率為40次/min和84次/min；40μg/ml基本無影響。結(jié)論 MTE組分A對原代新生大鼠心肌細胞具有細胞毒作用，能夠顯著影響其搏動功能。

心肌細胞 RTCA 細胞毒性 烏骨藤

心臟是循環(huán)系統(tǒng)中重要的功能性器官之一，臨床藥 物的細胞毒性可不同程度增加心臟的循環(huán)壓力，甚至會引起心肌細胞不可逆的損傷和缺失，導(dǎo)致患者心功能進行性惡化。建立心臟實時細胞分析系統(tǒng)（RTCA Cardio）技術(shù)能對臨床藥物心肌細胞毒進行有效篩選，降低心血管疾病導(dǎo)致的病死率[1]。烏骨藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，具有抗腫瘤、平喘、免疫調(diào)節(jié)和降血壓等藥理作用[2]。以烏骨藤的粗提物（MTE）為主要成分的藥物“消癌平”臨床上用于治療肝癌、膠質(zhì)瘤、胃癌等腫瘤[3]。但MTE對心肌細胞的細胞毒作用尚不清楚，進一步分離純化烏骨藤，利用RTCA Cardio技術(shù)評估MTE的心肌細胞毒作用，有助于以烏骨藤為主要成分藥物的減毒增效。本研究采用RTCA Cardio技術(shù)對原代大鼠心肌細胞的增殖、搏動頻率、幅度等進行實時動態(tài)檢測，探討MTE對原代大鼠心肌細胞的細胞毒作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和動物 MTE經(jīng)萃取和色譜分離，獲得主要組分A，由浙江工業(yè)大學藥學院純化和提供；出生后1～2d清潔級SD新生大鼠，雌雄不限，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞的分離和培養(yǎng) 取出生1～2d的SD大鼠，用75%乙醇消毒后，獲取大鼠心室組織，剪成1mm左右的組織塊，使用預(yù)冷的高糖培養(yǎng)基洗滌3次，用0.08%胰蛋白酶和0.04%膠原蛋白酶Ⅱ消化后將細胞懸液收集到培養(yǎng)瓶中進行差速貼壁2次，每次45min，以去除成纖維細胞和其它細胞。將差速貼壁后的心肌細胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中進行細胞計數(shù)。

1.2.2 新型四氮唑鹽（MTS）法檢測存活細胞抑制率 將MTE組分A溶于二甲基亞砜（DMSO）備用，實驗時分別使用20、40、80、160和320μg/ml濃度的MTE組分A和8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）作為陽性對照處理原代大鼠心肌細胞24h，采用MTS法測定吸光度（OD）值，計算存活細胞抑制率[2]。實驗重復(fù)3次，取平均值，并計算半數(shù)存活濃度（EC50）。

1.2.3 RTCA Cardio系統(tǒng)基線的測定及大鼠心肌細胞細胞指數(shù)（CI）值、搏動檢測 在E-Plate Cardio96x檢測板中分別加入50μl培養(yǎng)基，將其放在Cardio工作站上，測基線調(diào)零。取出E-Plate Cardio96x檢測板，分別加入100μl細胞懸液（17 000cells/孔）于E-Plate Cardio96x檢測板中，混勻，室溫放置30min后，放在Cardio工作站上對不同時間的細胞增殖進行實時動態(tài)檢測。24h后，取出E-Plate Cardio96x檢測板，分別加入不同濃度MTE組分A（40、80、160、240μg/m）l和DMSO對照（0.1%），放在Cardio工作站上對心肌細胞CI和心肌細胞搏動頻率進行實時檢測和信號收集，并通過RTCA Cardio software 1.0對以上指標進行分析。CI值用來反映細胞增殖情況，CI值越大，細胞增殖越多。每隔2min檢測1次，分別選取0、10、30min及2、6、12、18、24h時間點作圖。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Prizm 5軟件和RTCA Cardio software 1.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTE組分A對原代大鼠心肌存活細胞抑制率的影響 通過Prizm 5軟件計算得出MTE組分A對原代大鼠心肌細胞的EC50為207.30μg/ml。MTE組分A對原代大鼠心肌存活細胞抑制率的影響見表1。

表1 MTE組分A對原代大鼠心肌存活細胞抑制率的影響

由表1可見，與DMSO對照組比較，20、40、80、160和320 μg/ml組MTE組分A及5-FU（8 000μg/ml）對照組對原代大鼠心肌存活細胞抑制率的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且隨著MTE組分A濃度的升高存活細胞抑制率升高（均P＜0.05）。

2.2 RTCA Cardio檢測MTE組分A對原代大鼠心肌細胞增殖的影響 見表2。

表2 RTCA Cardio檢測MTE組分A對原代大鼠心肌細胞增殖的影響

由表2可見，隨著MTE組分A濃度的升高，CI 值下降，存在藥物濃度依賴性。160μg/ml組、240μg/ml組與DMSO對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 MTE組分A對原代大鼠心肌細胞搏動的影響 見圖1，表3、4。

圖1 MTE組分A對原代大鼠心肌細胞的瞬態(tài)脈沖圖

表3 MTE組分A對原代大鼠心肌細胞標準搏動頻率的影響

表4 MTE組分A對原代大鼠心肌細胞標準搏動幅度的影響

由圖1，表3、4可見，MTE組分A各濃度組對心肌細胞搏動均有一定的影響，且該影響作用呈濃度依賴性：240μg/ml組經(jīng)處理后，導(dǎo)致細胞迅速停止搏動，搏動頻率由126次/min降至0次/min，標準搏動幅度由100%降至0，且無法恢復(fù)；160μg/ml組經(jīng)處理后，12h內(nèi)顯著影響細胞搏動頻率和搏動幅度，搏動頻率和標準搏動幅度分別為40次/min和128%，18h后恢復(fù)正常；80μg/ml組經(jīng)處理后，2h內(nèi)對心肌細胞搏動頻率和搏動幅度還存在一定的影響，但6h恢復(fù)正常，搏動頻率和標準化搏動幅度分別為84次/min和109%；40μg/ml組經(jīng)處理后幾乎對細胞搏動無影響。

3 討論

藥物濃度的篩選是心功能不全患者治療效果不佳的重要原因之一[4]，尤其是在腫瘤患者中，化療藥物在為控制腫瘤患者病情，提高生存質(zhì)量的同時，往往直接或者間接地損傷心肌細胞，導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)和收縮功能障礙[5]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，MTE能夠顯著抑制大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞增殖，通過調(diào)控Bcl-2家族mRNA表達的變化，促進C6細胞發(fā)生凋亡[6]。但關(guān)于烏骨藤對心肌細胞的作用仍不明確，鮮有報道。本研究利用RTCA Cardio技術(shù)探究烏骨藤提取物對原代新生大鼠心肌細胞增殖和功能的變化。該技術(shù)模擬生理條件下，根據(jù)細胞與E-Plate Cardio96檢測板底部電極相互作用引起阻抗的變化換算成CI值，對心肌細胞進行實時、無標記、無侵入性的動態(tài)監(jiān)測[7]，從而獲得細胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等細胞生理功能相關(guān)的信息[8]。通過實時監(jiān)控細胞增殖、凋亡和毒性等事件，可以提供豐富的細胞生理信息[9]，并根據(jù)心肌細胞搏動頻率、幅度變化進行評估，綜合分析藥物對心肌細胞的生長、細胞形態(tài)特征和心肌細胞搏動的影響，可早期進行臨床藥物對心臟毒性的篩選，有效減少藥物的浪費[10]。我們通過RTCA Cardio系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，MTE組分A能夠抑制心肌細胞的CI值，抑制細胞的增殖，這與MTS實驗結(jié)果一致，進一步說明了烏骨藤提取物具有細胞毒作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，高濃度MTE組分A能夠?qū)е滦募〖毎珓酉?，且隨著時間的延長不能恢復(fù)，但是中、低濃度處理后，導(dǎo)致的初始階段心肌細胞搏動消失，隨著時間的延長，可有一定程度的恢復(fù)，且具有濃度依賴性。160μg/ml MTE組分A對原代大鼠心肌細胞具有細胞毒作用，并能顯著抑制其搏動頻率和幅度，該濃度遠超過其臨床應(yīng)用劑量，提示以烏骨藤提取物為主要成分的消癌平對心肌細胞較為安全。

綜上所述，烏骨藤制劑在抗腫瘤的同時存在心肌細胞毒作用，能夠顯著影響心肌細胞搏動頻率和搏動幅度，提示在臨床治療過程中，烏骨藤制劑抗腫瘤最佳劑量的篩選尤為重要。

[1]Yu Y,Sun S,Wang S,et al.Liensinine-and Neferine-Induced Cardiotoxicity in Primary Neonatal Rat Cardiomyocytesand Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes [J].Internationaljournalofmolecular sciences,2016,17(2):186.

[2]Huang T,Gong W H,Zou C P,et al.Marsdenia tenacissima extract sensitizes MG63 cells to doxorubicin-induced apoptosis [J].Genetics and Molecular Research,2014,13:354-362.

[3]Han S Y,Ding H R,Zhao W,et al.Enhancement of gefitinibinduced growth inhibition by Marsdenia tenacissima extract in non-small cell lung cancer cells expressing wild or mutant EGFR [J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2014,14(1): 165.

[5]Mordente A,Meucci E,Martorana G E,et al.Human heart cytosolic reductases and anthracycline cardiotoxicity[J].IUBMB life,2001,52(1):83-88.

[6]王震,李凱強,陳秉宇,等.烏骨藤粗提物對大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞的體外實驗研究[J].浙江醫(yī)學,2015,37(10):809-819.

[7]Xi B,Wang T,Li N,et al.Functional CardiotoxicityProfiling and ScreeningUsing the xCELLigence RTCA Cardio System[J].J Lab Autom,2011,16(6):415-421.

[8]Offer S M,Wegner N J,Fossum C,et al.Phenotypic profiling of DPYD variations relevantto 5-fluorouracil sensitivity using real-time cellular analysis and in vitro measurement of enzyme activity[J].Cancer Res,2013,73:1958-1968.

[9]Fu H,Fu W,Sun M,et al.Kinetic cellular phenotypic profiling: prediction,identification,and analysis ofbioactive natural products[J].Analyticalchemistry,2011,83(17):6518-6526.

[10]Wang T,Hu N,Cao J,et al.A cardiomyocyte-based biosensor for antiarrhythmic drug evaluation by simultaneously monitoring cellgrowth and beating[J].Biosensors and Bioelectronics,2013, 49:9-13.

Cytotoxic effect of Marsdeniae Tenacissimae Extracts on primary cultured myocardial cells of neonatal rat

XU Xiaodong, LI Kaiqiang,WANG Zhen,et al.Research Center of Blood Transfusion,Key laboratory of Ministry of Education,Zhejiang Provincial People's Hospital.Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the cytotoxic effect of Marsdeniae tenacissimae extracts(MTE)on primarily cultured myocardial cells of neonatal rats. Methods Primarily cultured myocardial cells of neonatal SD rats were treated with 20,40,80, 160 and 320μg/ml MTE,and 8 000μg/ml 5-FU(positive control),cell proliferation was assessed by MTS method.Cytotoxicity and rhythm changes of myocardial cells were determined by Real-time Cellular Analysis Cardio(RTCA Cardio)system. Results Proliferation of rat myocardial cells was inhibited after MTE treatment in a concentration-dependent manne(P＜0.05),and the half survival rate(EC50)was 207.3μg/ml.RTCA Cardio system showed that myocardial cells were beating normally 24h after testing started.And the cell index(CI)was down-regulation significantly with MTE.The cells beating rate decreased frequently from 126 to 0 beatings/min with the treatment of 240μg/ml MTE component A.When the cells were treated with 160μg/ml and 80μg/ml component A,the cell beating was resumed at 12h and 6h with a beating rate of 40 beatings/min and 84 beatings/min, respectively. Conclusion MTE component A has cytotoxic effect on primary cultured myocardial cells of neonatal rat,and significantly affects the beating function of myocardium.

Myocardial cellRTCA Cytotoxicity Marsdeniae tenacissimae extraction

2016-04-14）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學青年基金（81501824）;浙江省自然科學基金項目（LY15C090004,LY15H280003）；浙江省中醫(yī)藥重點項目（2015ZZ001）；浙江省中醫(yī)藥項目（2014ZQ005，2014ZB007）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2016DTB001,2015KYA028，2015ZDA002）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學教育部重點實驗室輸血醫(yī)學研究中心（許曉東、李凱強、陳秉宇、王震、張威）；溫州醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院（張昱、陳波旭、鄭宇）

張威，E-mail：mnfizjpph88@163.com