蔣慧，李恒，張瀾，李妍，李悅明，徐建春，辛躍強(qiáng)

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250000；2.日照市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東日照276800；3.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島266400；4.青島科海生物有限公司，山東青島266400）

高效液相色譜法測定殼寡糖的含量

蔣慧1，李恒1，張瀾2，李妍3，李悅明4，徐建春4，辛躍強(qiáng)4

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250000；2.日照市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東日照276800；3.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島266400；4.青島科海生物有限公司，山東青島266400）

探討高效液相色譜（HPLC）法在殼寡糖含量測定中的應(yīng)用。選用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）測定殼寡糖樣品中2～6個(gè)聚合度殼寡糖的含量。檢測器為示差折光檢測器，流動(dòng)相V（乙腈）∶V（水）=75∶25，流速1.2 mL/min，柱溫30℃。液相檢測殼寡糖的回收率為96.9%～98.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～1.0%。結(jié)果表明：該定量分析方法可快速、高效地測定殼寡糖樣品中2～6個(gè)聚合度殼寡糖的含量。

殼寡糖；高效液相色譜法；含量；測定

隨著生活水平的提高，肥胖、高血壓、膽固醇等疾病的發(fā)病率也隨之升高，食品安全和健康問題日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。殼寡糖（Chitosan oligosaccharide，簡稱COS）是以殼聚糖為原料經(jīng)酶解反應(yīng)得到的，它是以2～10個(gè)乙酰氨基葡萄糖經(jīng)β-1,4糖苷鍵連接而成的水溶性好、易被人體吸收且生物活性高的低分子量寡聚糖[1-6]。殼寡糖是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中唯一帶正電荷、呈堿性的水溶性多糖，具有優(yōu)越的生物活性[7-9]。殼寡糖不僅保留了殼聚糖大分子所具有的功能性質(zhì)，如降血壓、降低膽固醇、防治糖尿病、治療燒燙傷、排除體內(nèi)有毒有害物質(zhì)、強(qiáng)化肝臟機(jī)能等[10-13]，同時(shí)不同分子量的殼寡糖還具有殼聚糖所不具備的獨(dú)特的生理功能[14]，特別是6個(gè)聚合度的殼寡糖[15]，如調(diào)節(jié)腸道菌群，在人體腸道內(nèi)增殖雙歧桿菌，抑制大腸桿菌的生長[16]；抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)脾臟抗體生成[17-19]；強(qiáng)化肝臟功能，防止胃潰瘍[20]；在微酸性環(huán)境中具有較強(qiáng)的抗菌作用和顯著的保溫吸濕能力[21-22]；作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑的載體等作用[23]。因此，殼寡糖在保健品、生物醫(yī)藥等方面具有極為廣泛的應(yīng)用范圍和發(fā)展前途。

目前，殼寡糖含量的檢測方法一般采用化學(xué)試劑法[24-26]，化學(xué)試劑法的原理是將高分子聚糖在強(qiáng)酸的條件下分解成單糖N-乙酰氨基葡萄糖，然后通過3,5-二硝基水楊酸（DNS）測定還原糖的方法測定單糖含量，從而計(jì)算出高分子聚糖的含量[27-28]。該方法檢測成本低、易操作，但檢測結(jié)果無法確定聚合度在2～10個(gè)之間的殼寡糖的含量。筆者探討了高效液相色譜法在殼寡糖含量測定中的應(yīng)用，期望通過運(yùn)用高相液相色譜法尋找快速、精密度高和重現(xiàn)性好的殼寡糖含量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

LC-1200高效液相色譜儀，含RID-20A示差折光檢測器、LC-20AT二元泵、控制器、CTO-20A柱溫箱，日本島津公司；AS 20600B超聲清洗儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.1.2 試劑與藥品

殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)殼二糖（≥97%）、殼三糖（≥98%）、殼四糖（≥98%）、殼五糖（≥97%）、殼六糖（≥96%），購自青島博智匯力生物科技有限公司；殼寡糖樣品，青島科海生物科技有限公司提供；HPLC級乙腈，美國天地試劑（TEDIA，USA）；超純水，娃哈哈集團(tuán)瓶裝用水。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，2.5%，5.0%，7.5%，10%的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，4℃冷藏備用。

1.1.4 殼寡糖樣品溶液的配制

將殼寡糖樣品配制成適宜濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，4℃冷藏備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件：

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（水）=75∶25；流動(dòng)相流速：0.6～1.2 mL/min；柱溫：26～34℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.2 試驗(yàn)過程

配制流動(dòng)相乙腈-水的混合溶液，分別設(shè)置0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL/min五個(gè)流動(dòng)相流速以及分別選取26，28，30，32，34℃五個(gè)柱溫進(jìn)行殼寡糖高效液相色譜分析。

將1.1.3和1.1.4步驟中配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液和殼寡糖樣品溶液分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行色譜分離，記錄不同條件下殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的出峰保留時(shí)間和峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的確定

由于乙腈的洗脫能力強(qiáng)，基線噪音低和分離度高，在多種糖的分離中應(yīng)用廣泛，選擇乙腈-水作為流動(dòng)相并使用氨基柱進(jìn)行殼寡糖的分離[29-32]。經(jīng)過比較不同柱溫分析殼寡糖樣品的結(jié)果，最終確定柱溫為30℃，此溫度下各聚合度殼寡糖的出峰時(shí)間相隔適宜，有效將2～6個(gè)聚合度殼寡糖分離開的同時(shí)，所用時(shí)間最短。經(jīng)過比較不同流動(dòng)相流速分析殼寡糖樣品的結(jié)果，最終確定流速為1.2 mL/min，此流速下色譜圖顯示各峰無拖尾現(xiàn)象，各峰分離效果最好，同時(shí)縮短了檢測時(shí)間。因此，確定的分析條件為：V（乙腈）∶V（水）=75∶25；柱溫30℃；流動(dòng)相流速1.2 mL/min。

2.2 精密度試驗(yàn)

對殼寡糖樣品溶液進(jìn)行定性定量分析。取殼寡糖樣品溶液重復(fù)測定7次，結(jié)果見表1。由表1看出：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.1%～1.0%，都小于2%，精密度高，說明這種分析方法是可靠的。

2.3 方法回收率

取同一殼寡糖樣品溶液四份，其中一份作本底，另三份添加一定量的不同聚合度、不同濃度的殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)溶液后測定各聚合度殼寡糖的峰面積，每份樣品進(jìn)行平行測定3次，考察方法的回收率，結(jié)果見表2。從表2看出：殼寡糖的回收率在96.9%～98.2%之間，說明該方法準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

表2 殼寡糖的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品中殼寡糖的檢測

圖1～5為殼二糖至殼六糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的液相色譜圖，其中殼二糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰保留時(shí)間在8.78 min，峰面積為5 618 366；殼三糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰保留時(shí)間在12.77 min，峰面積為1 774 508；殼四糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰保留時(shí)間在18.72 min，峰面積為8 856 095；殼五糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰保留時(shí)間在27.52 min，峰面積為10 096 350；殼六糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰保留時(shí)間在39.39 min，峰面積為6 698 981。

殼寡糖樣品液相色譜圖如圖6所示，對應(yīng)各聚合度殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰保留時(shí)間，對樣品出峰進(jìn)行歸屬，并記錄各聚合度殼寡糖的峰面積，結(jié)果如表3所示。

根據(jù)殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度和峰面積的比值與樣品中相應(yīng)聚合度殼寡糖的濃度和峰面積的比值相等的關(guān)系，便可求得樣品中各聚合度殼寡糖的濃度，各聚合度殼寡糖濃度之和與樣品的配制濃度的比值，即為2～6個(gè)聚合度殼寡糖的含量。如表3所示的殼寡糖樣品中殼二糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，殼三糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%，殼四糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%，殼五糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.6%，殼六糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%，因此樣品中2～6個(gè)聚合度殼寡糖的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.1%，殼寡糖樣品配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%，由此算得2～6個(gè)聚合度殼寡糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.6%，符合國家2014年頒布的《關(guān)于批準(zhǔn)殼寡糖等6種新食品原料的公告》中殼寡糖含量≥80%的要求。

表3 殼寡糖樣品中各聚合度殼寡糖的峰面積

3 結(jié)論

采用高相液相色譜中示差折光檢測器，使用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），V（乙腈）∶V（水）=75∶25作為流動(dòng)相，流速為1.2 mL/min，柱溫30℃，可較好地完成對殼寡糖含量的檢測。經(jīng)過多次試驗(yàn)證明，該方法具有處理簡單、靈敏度高、分析速度快和結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，對測定殼寡糖樣品中2～6個(gè)聚合度殼寡糖的含量具有重要意義。

[1]譚佩毅,黃秀錦.纖維素酶法制備殼寡糖工藝的研究[J].中國調(diào)味品,2012,12(37):79-83.

[2]王魯霞,吳延立,馬文平.殼寡糖的制備方法及其在視頻中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(32):11485-11487.

[3]MUANPRASAT C,WONGKRASANT P,SATITSRI S,et al. Activation of AMPK by chitosan oligosaccharide in intestinal epithelial cells:Mechanism of action and potential applications in intestinal disorders[J].Biochemical pharmacology,2015,96 (3):225-236.

[4]嚴(yán)欽,沈月新.殼寡糖制備研究進(jìn)展[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,11(4):383-387.

[5]HUANG L,CHEN J,CAO P,et al.Anti-obese effect of glucosamine and chitosan oligosaccharide in high-fat diet-induced obese rats[J].Marine drugs,2015,13(5):2732-2756.

[6]PARK J K,KIM T H,NAM J P,et al.Bile acid conjugated chitosan oligosaccharide nanoparticles for paclitaxel carrier[J]. Macromolecular research,2014,22(3):310-317.

[7]TERMSARASAB U,CHO H J,DONG H K,et al.Chitosan oligosaccharide-arachidic acid-based nanoparticles for anticancer drug delivery[J].International journal of pharmaceutics, 2012,441(1/2):373-380.

[8]KIM S K,PARK P J,YANG H P,et al.Subacute toxicity of chitosan oligosaccharide in Sprague-Dawley rats[J].Arzneimittel-Forschung,2001,51(9):769-774.

[9]胡健,姜涌明.殼寡糖抑制植物病原菌生長的研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,3(2):42-44.

[10]REIGHARD K P,HILL D B,DIXON G A,et al.Disruption and eradication of biofilms using nitric oxide-releasing chitosan oligosaccharides[J].Biofouling,2015,31(9/10):775-787.

[11]曹維強(qiáng),王靜,佘永新,等.殼寡糖對腸道致病菌抑制作用的研究[J].食品科學(xué),2008,29(4):114-116.

[12]KHUTORYANSKIY V V.Advances in mucoadhesion and mucoadhesive polymers[J].Macromolecular bioscience,2011, 11(6):748-764.

[13]祝君梅,關(guān)景芳,聶衛(wèi),等.殼寡糖降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津醫(yī)藥,2007,35(7):520-522.

[14]劉晶瑩,劉洋,譚子強(qiáng).殼寡糖對S180肉瘤小鼠抗腫瘤作用的研究[J].國外醫(yī)藥:抗生素分冊,2015,36(1):23-24.

[15]杜昱光,張銘俊,張虎,等.海洋寡糖工程藥物——?dú)す烟侵苽浞蛛x新工藝及其抗癌活性研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2001,13(1):5-7.

[16]夏文水,吳焱楠.甲殼低聚糖的功能性質(zhì)[J].無錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,15(4):297-302.

[17]許翔,李呂木,張民揚(yáng).殼寡糖的生物學(xué)功能及其在畜禽營養(yǎng)中的應(yīng)用[J].飼料博覽,2015(6):31-36.

[18]沈獻(xiàn)周,沈月新.不同平均分子量的殼聚糖的抑菌作用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,9(2):138-141.

[19]周天,劉晶.殼聚糖對作物的生理效應(yīng)及其增產(chǎn)作用[J].吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003(5):18-20.

[20]杜昱光,白雪芳,金宗潦.殼寡糖抑制腫瘤作用的研究[J].中國海洋藥物,2002,21(2):18-21.

[21]高先池,陳國華,應(yīng)駿.兩種不同凝膠柱測定殼聚糖分子量結(jié)果的比較[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2002,32(3):463-468.

[22]LIUJ,XIAW.Purificationandcharacterizationofa bifunctional enzyme with chitosanase and cellulase activity from commercial cellulase[J].Biochemical engineering journal, 2006,30(1):82-87.

[23]KIM Y H,ROH Y B.Ultrastructural study of the liver by chitosanoligosaccharide administrated in rat[J].Journal of histochemistry&cytochemistry,2001,31(4):591-600.

[24]CHOIY,KIME,PIAOZ,etal.Purificationand characterization of chitosanase from Bacillus sp.strain KCTC 0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharides[J].Applied and environmental microbiology, 2004,70(8):4522-4531

[25]CENTI S,TATINI F,RATTO F,et al.In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections[J]. Journal of nanobiotechnology,2014,12(1):1-10.

[26]SU E P,KIM O H,KWAK J H,et al.Antihyperglycemic effect of short-term arginyl-fructose supplementation in subjects with prediabetes and newly diagnosed type 2 diabetes:randomized, double-blinded,placebo-controlled trial[J].Trials,2014,16 (1):1-8.

[27]LEE H W,KARIM M R,PARK J H,et al.Poly(vinyl alcohol)/chitosan oligosaccharide blend submicrometer fibers preparedfromaqueoussolutionsbytheelectrospinning method[J].Journal of applied polymer science,2009,111(1): 132-140.

[28]PARK J H,LEE H W,DONG K C,et al.Electrospinning and characterization of poly(vinyl alcohol)/chitosan oligosaccharide/ clay nanocomposite nanofibers in aqueous solutions[J].Colloid &polymer science,2009,287(8):943-950.

[29]梁榮榮,李丕武,辛躍強(qiáng).從異麥芽酮糖母液中分離異麥芽酮糖和海藻酮糖方法的研究[J].食品工業(yè),2016,37(4): 74-78.

[30]辛躍強(qiáng).低聚半乳糖對腸道益生菌作用機(jī)理的研究[D]:濟(jì)南:齊魯工業(yè)大學(xué),2015.

[31]曾榮香,張清華,管詠梅,等.柱前衍生化高效液相色譜法測定地稔多糖中單糖組成[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015(10): 73-76.

[32]胡志鵬.殼寡糖的研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2003, 24(4):210-212.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Determination of chitosan oligosaccharide by high performance liquid chromatography

JIANG Hui1,LI Heng1,ZHANG Lan2,LI Yan3,LI Yueming4,XU Jianchun4,XIN Yueqiang4
(1.Shandong Provincial Food and Drug Inspection and Research Institute,Jinan 250000,China;2.Rizhao Center for Food and Drug Control,Rizhao 276800,China;3.Huangdao Drug Supervision and Administration Bureau, Qingdao 266400,China;4.Qingdao Kehai Biochemistry Co.,Ltd.,Qingdao 266400,China)

Chitosan oligosaccharides containing 2-6 degree of polymerization were analyzed by high performance liquid chromatography with a refraction index detector.Samples(20 μL)were separated in a Shodex Asahipak NH2P-50 4E column(4.6 mm×250 mm,5 μm).Eluent V (acetonitrile)∶V(water）=75∶25 was used as mobile phase and the flow rate was set at 1.2 mL/min at 30℃.The recovery of chitosan oligosaccharides were 96.9%-98.2%and the relative standard deviation were 0.1%-1.0%.The results indicated that it was a rapid and effective method to determine the content of chitosan oligosaccharides.

chitosan oligosaccharide;high performance liquid chromatography;content;detection

O657

A

1674-2214（2016）04-0232-05

2016-07-02

蔣慧（1964—），女，山東濱州人，副主任藥師，主要從事食品、藥品檢驗(yàn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制工作，E-mail：xubz19@163.com.