郭豪杰 丁 鈺 陳維武 劉海濤 邊巴次仁 李西文

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700； 2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193；3 西藏奇正藏藥股份有限公司，林芝，860000)

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藏藥材榜嘎及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究

郭豪杰1,2丁 鈺1陳維武3劉海濤2邊巴次仁3李西文1

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700； 2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193；3 西藏奇正藏藥股份有限公司，林芝，860000)

目的：利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)榜嘎及其混偽品進(jìn)行鑒別，為藏藥榜嘎的鑒定提供準(zhǔn)確可靠的依據(jù)。方法：通過(guò)分析榜嘎及其混偽品ITS和ITS2序列的遺傳距離、種內(nèi)種間變異并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以評(píng)價(jià)ITS2和ITS序列的鑒定效率。結(jié)果：本研究中ITS2和ITS序列擴(kuò)增效率相同，在blast比對(duì)和遺傳距離距離分析上，ITS序列表現(xiàn)出更強(qiáng)的鑒定能力；通過(guò)K2P距離構(gòu)建NJ樹(shù)，ITS2和ITS序列在榜嘎與混偽品間的種間變異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但I(xiàn)TS序列對(duì)易混物種的鑒定效率較高。結(jié)論：ITS序列可作為鑒定榜嘎及其混偽品的有效條形碼。

藏藥榜嘎烏頭屬;ITS

藏醫(yī)藥是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，具有悠久的歷史、獨(dú)特的醫(yī)療和研究?jī)r(jià)值及市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力[1]。榜嘎是藏醫(yī)習(xí)用藏藥材，為毛茛科烏頭屬植物船盔烏頭(Aconitumnaviculare)或甘青烏頭(A.tanguticum)的干燥全草，味苦，性涼，具有清熱解毒與燥濕之功效，主要用于治療熱病等[2]。船盔烏頭在我國(guó)主要分布于西藏南部3200～5000 m的山坡草地或灌木叢中，甘青烏頭分布于西藏東部、云南西北部、四川西部等地3200～4800 m的山地草坡或沼澤草地[3]?！毒е楸静荨穼躅^屬分為“白、黃、紅、黑”四種，其中榜嘎屬于白烏頭。

烏頭屬藥材形態(tài)相似，榜嘎有較多混用和代用品，西藏地區(qū)用叉苞烏頭，青海用祁連烏頭，川西用刷經(jīng)寺烏頭作為榜嘎使用。同時(shí)，由于地域上的差異，同名異物或同物異名的現(xiàn)象也是造成榜嘎混用亂用原因之一[1]。榜嘎在不同著作中曾出現(xiàn)多個(gè)藏語(yǔ)名，《蒙藥正典·美麗日飾》中記載用百合科麥冬(Ophiopogonjaponicus)作為榜嘎的來(lái)源植物[4]。傳統(tǒng)鑒別方法受地域差異、活性成分和親緣關(guān)系等因素影響，存在鑒定局限性。烏頭屬植物大多具有毒性，為保障臨床用藥安全，尋求一種榜嘎藥材快速準(zhǔn)確的鑒定方法則顯得尤為迫切。

DNA條形碼技術(shù)具有通用性強(qiáng)、鑒定結(jié)果可靠、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥材鑒定中[5]。ITS2是中國(guó)學(xué)者通過(guò)大量樣本的系統(tǒng)研究，提出的可以作為鑒定藥用植物和近緣種的通用條形碼[6]。ITS/ITS2是中國(guó)植物DNA條形碼研究組提出可作為種子植物核心條形碼的序列[7]。目前榜嘎的鑒別主要是傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒別，我們?cè)诒疚耐ㄟ^(guò)多種數(shù)據(jù)分析方法分析ITS和ITS2對(duì)榜嘎及其混為品的鑒別能力，為建立合適的榜嘎DNA條形碼技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 實(shí)驗(yàn)物種包括工布烏頭(Aconitumkongboense)、鐵棒錘(A.pendulum)和甘青烏頭(A.tanguticum)、麥冬(Ophiopogonjaponicus)等。植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，中國(guó))，2×Tag PCR Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司，中國(guó))，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。scientz-48高通量組織研磨儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó))，2720PCR儀(Applied Biosystems?，USA)，1-14K高速離心機(jī)(SIGMA，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取藥材樣品約50 mg，用高通量組織研磨儀研磨2 min(50Hz)后，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 反應(yīng)體系為2×Tag PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物(2.5 μM)各1.0 μL、模板DNA2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。各條形碼的引物序列和PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表1。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況，由測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 引物序列和PCR反應(yīng)程序

表2 Genbank數(shù)據(jù)

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 將測(cè)序峰圖用Codon Code Aligner軟件進(jìn)行拼接，將每個(gè)片段兩端引物及低質(zhì)量序列切除，得到所需片段并對(duì)ITS2進(jìn)行注釋剪切。同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集并下載榜嘎及其混偽品ITS序列(表2)，注釋剪切后得到ITS2，結(jié)合實(shí)驗(yàn)樣品序列，運(yùn)用MEGA 6.0建立NJ樹(shù)，計(jì)算遺傳距離，分析榜嘎及其混偽品親緣關(guān)系；采用Perl語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)不同序列種內(nèi)種間遺傳差異；運(yùn)用最近距離法(K2P nearest distance)和相似性搜索法(BLAST1)考察序列的鑒定效率[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列信息和鑒定效率 各序列數(shù)量、長(zhǎng)度范圍、GC含量、遺傳距離、鑒定效率等信息見(jiàn)表3。ITS2由ITS注釋而來(lái)，所以ITS2與ITS數(shù)量相等，都為148條。ITS2的長(zhǎng)度范圍為194～227bp，ITS的長(zhǎng)度在605～777bp之間。平均GC含量，ITS2為62.15%，ITS為59.26%。ITS2和ITS的最小遺傳距離相同，都為0.0000；平均遺傳距離ITS較小，為0.1702，ITS2為0.2815；最大遺傳距離ITS2較大，為0.8423，ITS為0.5351。從鑒定效率看，ITS表現(xiàn)較好，BLAST1和Nearest distance鑒定效率都為100%，ITS2的BLAST1和Nearest distance鑒定效率都為98.04%。綜上所述，雖然ITS2最大遺傳距離比ITS大，但是ITS最小遺傳距離要小于ITS2，并且ITS的鑒定效率高于ITS2，所以從序列信息和鑒定效率方面考慮，ITS更適合作為榜嘎及其混偽品的DNA條形碼。

2.2 不同序列種內(nèi)種間差異 利用perl語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)ITS2和ITS序列的6個(gè)值：種內(nèi)變異(Theta)、種內(nèi)最大變異(Coalescent depth)、平均種內(nèi)變異(All intra-specific distance)、種間變異(Theta prime)、種間最小變異(Minimum inter-specific distance)、平均種間變異(All inter-specific distance)(表4)。ITS2和ITS序列的種間最小變異均大于種內(nèi)最大變異，ITS2的種內(nèi)變異、平均種內(nèi)變異、種間變異和平均種間變異與ITS相似。綜上所述，在種內(nèi)種間差異方面，ITS2和ITS序列對(duì)榜嘎及其混偽品鑒定方面都有很好表現(xiàn)，無(wú)明顯差別。

表3 序列信息和鑒定成功率

表4 種內(nèi)種間差異分析

2.3 NJ樹(shù)鑒別分析 基于K2P遺傳距離建立NJ樹(shù)，可以用來(lái)分析不同物種間的親緣關(guān)系，以達(dá)到鑒別物種的目的。如圖1所示，ITS2和ITS序列都可以將榜嘎及其混偽品分開(kāi)，但I(xiàn)TS2序列對(duì)烏頭屬其他物種的鑒定效率相對(duì)較差。ITS序列表現(xiàn)出良好的鑒別能力，能夠?qū)⒉煌奈锓N分到不同的分支上，更適合作為鑒定榜嘎及其混偽品的條形碼序列。

圖1 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

烏頭屬植物作為有毒植物及藥用植物一直倍受廣泛的關(guān)注，全屬約有350種植物，我國(guó)約有167種，其中53種可作藥用[2-3，9]。烏頭屬植物種間系統(tǒng)發(fā)育復(fù)雜，該屬的分子生物學(xué)研究報(bào)道較少，多集中于生物多樣性的研究，如ISSR分析、RAPD分析[10-12]，鮮有生藥學(xué)的分子鑒定研究。He等利用條形碼技術(shù)對(duì)烏頭屬的19個(gè)物種134份樣品進(jìn)行鑒定研究，但其研究?jī)H用到psbA-trnH序列，沒(méi)有對(duì)ITS/ITS2序列進(jìn)行分析[13]。榜嘎，藏名榜阿嘎保，全草均可入藥，有小毒，歷代藏醫(yī)藥書(shū)均有記載，具有清熱解毒之功效，多用于各種熱病的治療，屬于多基原藏藥材，同時(shí)同屬混偽品較多，多有毒性，傳統(tǒng)方法鑒定困難，給臨床用藥帶來(lái)諸多隱患。

傳統(tǒng)藏藥植物藥缺乏系統(tǒng)分類基礎(chǔ)研究，多采用手摸、眼看、奔聞、嘴嘗、水試、火試等表觀鑒定方法。藏藥的使用也多依賴經(jīng)驗(yàn)和古書(shū)記載，地區(qū)差異大，如《晶珠本草》中榜嘎為烏頭屬植物，《蒙藥正典·美麗日飾》記載以百合科麥冬作為榜嘎的基原植物[3]，因此建立一種科學(xué)快速的藏藥基原物種鑒定方法迫在眉睫。DNA條形碼在物種鑒定上具有快速、有效、操作簡(jiǎn)便、通用性強(qiáng)以及易于形成標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，已有廣泛的研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。本研究針對(duì)榜嘎及烏頭屬常見(jiàn)混偽品的ITS2和ITS序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，ITS2和ITS擴(kuò)增效率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Blast1和Nearest distance 2種分析方法上，ITS序列鑒定效率優(yōu)于ITS2；通過(guò)K2P遺傳距離構(gòu)建NJ樹(shù)，ITS序列表現(xiàn)出更好的鑒定能力。綜合分析，ITS序列可以作為榜嘎及其混偽品鑒定的候選條形碼序列。本研究為藏藥材榜嘎的鑒定提供了新的分子生物學(xué)方法，可保障其臨床用藥安全。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of Herba Aconiti Bonga and Its Adulterants Using DNA Barcode

Guo Haojie1,2，Ding Yu1，Chen Weiwu3，Liu Haitao2，Bianba Ciren3，Li Xiwen1

(1InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China;2InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China; 3TibetCheezhengTibetanMedicineCo.,ltd.，Linzhi860000，China)

Objective:To select an effective barcode for identifying Herba Aconiti Bonga and its adulterants using DNA barcoding technology.Methods:This study compared ITS and ITS2 sequences and analyzed genetic distances，the variations of inter-and intra-species.Neighbor-joining tree was also constructed for evaluate their identification efficiencies based on the sequences from experimentaland GenBank database.Results:The results showed that ITS and ITS2 sequences had the same amplication efficiency.ITS sequence had a better performance than ITS2 on species identification efficiency using blast and nearest distance methods.The two barcodes showed no significant difference on the identification uing NJ tree to distinguish Herba Aconiti Bonga and its adultrants.However results demonstrated that ITS can also identify all species among adultrants of Herba Aconiti Bonga.Conclusion:ITS sequence can be used as the effective barcode to identifyHerba Aconiti Bonga and its adulterants.

Tibetan medicine；Herba Aconiti Bonga；Aconitum；ITS

重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2014ZX09304307001-014；2014ZX09301308-007)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：2015BAI05B02)；國(guó)家科技計(jì)劃港澳臺(tái)合作專項(xiàng)(編號(hào)：2015DFM30030)

李西文，副研究員，研究方向：中藥栽培與鑒定，Tel:(010)84084107，E-mail：xwli@icmm.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.003