李慢中 王雅麗 李朝霞 趙 暉 沈 素 王麗麗 李 任

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京,100050)

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蛭丹化瘀組方對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠炎性反應(yīng)的影響

李慢中1王雅麗1李朝霞1趙 暉1沈 素2王麗麗2李 任2

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京,100050)

目的:研究蛭丹化瘀組方對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的影響。方法:SD大鼠72只,隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、蛭丹化瘀組方33、16.5、8.25 g/kg組、地塞米松陽(yáng)性藥組。氣管滴注LPS制備急性肺損傷模型;HE染色,光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行肺病理?yè)p傷評(píng)分;酶聯(lián)免疫法檢測(cè)各組大鼠肺組織炎性因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果:模型組大鼠肺組織病理?yè)p傷評(píng)分增高,肺組織炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量較正常組明顯增加(P<0.01或P<0.05);蛭丹化瘀組方33 g/kg及地塞米松組大鼠肺組織病理?yè)p傷評(píng)分較模型組大鼠明顯降低(P<0.05),蛭丹化瘀組方(33、16.5、8.25 g/kg)及地塞米松可明顯降低肺組織TNF-α、IL-6含量,蛭丹化瘀組方16.5 g/kg還可明顯降低肺組織IL-1β含量,差異較模型組明顯(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論:蛭丹化瘀組方能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷,其機(jī)制可能與降低肺組織中炎性反應(yīng)因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量有關(guān)。

蛭丹化瘀組方;脂多糖;肺損傷;炎性反應(yīng)因子

急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭,其病理基礎(chǔ)主要表現(xiàn)為肺部炎性反應(yīng)和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞完整性破壞[1]。嚴(yán)重感染是引起急性肺損傷的重要因素,抑制炎性反應(yīng)是治療急性肺損傷的重要策略。目前尚缺乏特異有效治療藥物。因此,探討和尋找治療其有效藥物的研究尤為重要。蛭丹化瘀組方由黃芪、川芎、制水蛭、牡丹皮、當(dāng)歸、赤芍、雞血藤、組成,具有益氣活血的功效,臨床上多用于治療小兒支原體感染及病毒性肺炎[1-2]。體外研究顯示,蛭丹化瘀口服液體外有抗呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原體(MP)以及常見(jiàn)致病細(xì)菌如肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌的作用,整體實(shí)驗(yàn)顯示,蛭丹化瘀口服液可輔助羅紅霉素減輕支原體肺炎小鼠的病理?yè)p傷,減少血栓形成,改善微循環(huán)[3]。本研究通過(guò)建立ALI模型,評(píng)價(jià)蛭丹化瘀組方抗急性肺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 蛭丹化瘀組方由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、雞血藤、水蛭、牡丹皮組成,經(jīng)水提醇沉工藝制成組方顆粒劑的流浸膏,生藥含量為4.85 g/mL,由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥劑教研室制備。醋酸地塞米松片,規(guī)格:0.75 mg/片,由天津力生制藥股份有限公司提供,批號(hào):140511;脂多糖,由Sigma公司提供,貨號(hào)L2880;大鼠IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ檢測(cè)試劑盒,由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠72只,雌雄各半,體重80～100 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。

1.3 儀器 電子天平(型號(hào):PL4001-L);Biofuge15R低溫離心機(jī)(Heraeussepatech德國(guó));JA-1003電子分析天平(上海精科天平廠);超細(xì)勻漿器(上海季諾科貿(mào)有限公司),水浴鍋(型號(hào):02810202,天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司);Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Labsystem公司)。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 SD大鼠72只,雌雄各半,體重80～100 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。大鼠隨機(jī)分成6組,即對(duì)照組、模型組、蛭丹化瘀組方33、16.5、8.25 g/kg組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松0.5 mg/kg)。除對(duì)照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水外,其他各組均灌胃給與相應(yīng)藥物,1 mL/100 g體重。1次/d、連續(xù)給藥4 d。第5天給藥后1 h進(jìn)行模型制備。

1.5 LPS致肺損傷大鼠模型的制備 大鼠稱重,按35 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉,仰臥位固定,沿頸部正中線切開(kāi)皮膚,暴露氣管,脂多糖(LPS)按7.5 mg/kg劑量,0.2 mL/100 g給藥容積于氣管內(nèi)緩慢滴入(3 min),縫合創(chuàng)口。造模19 h后,灌胃給藥,給藥后1 h,取出肺組織,取右肺中葉稱重,在無(wú)菌生理鹽水中用玻璃勻漿器充分研磨,制成10%的組織勻漿,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ喾?、氣管?0%福爾馬林固定

1.6 肺組織病理學(xué)檢查 肺組織固定24 h后,常規(guī)脫水,石蠟包埋，制作切片,切片厚5 μm,蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色,在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。參照Mikawar[4]方法,進(jìn)行肺組織病理學(xué)評(píng)分。對(duì)肺泡腔內(nèi)出血、水腫;肺泡壁增寬;中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);支氣管積膿;肺出血分別依病變輕重評(píng)分0～4分。0分:極輕度損傷;1分:輕度損傷;2分:中度損傷;3分:重度損傷;4分:嚴(yán)重?fù)p傷。將項(xiàng)指標(biāo)得分相加作為總分。

表1 各組大鼠肺組織病理評(píng)分比較(±s)

表1 各組大鼠肺組織病理評(píng)分比較(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05。

組別只數(shù)劑量(g/kg)組織病理學(xué)評(píng)分模型組9-4.67±1.12地塞米松組120.00052.40±1.56*蛭丹化瘀組方組11332.69±1.81*蛭丹化瘀組方組1116.54.22±1.39蛭丹化瘀組方組128.254.56±1.05

1.7 大鼠肺組織炎性反應(yīng)因子測(cè)定 設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔,每孔中各加入樣品稀釋液100 μL,第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL,混勻后用加樣器吸出100 μL,移至第2孔。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第七孔,最后,從第七孔中吸出100 μL棄去,使之體積均為100 μL。第八孔為空白對(duì)照。將待測(cè)肺組織勻漿100 μL加入到預(yù)先已用抗大鼠IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ單克隆抗體包被的酶標(biāo)板上;將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃溫箱120 min,使標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品中的抗原與單抗充分結(jié)合;用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次,向?yàn)V紙上印干;每孔中加入生物素化的一抗(IL-1β/IL-4/IL-6/TNF-α/IFN-γ)工作液50 μL,置37 ℃溫箱60 min;洗板;每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin抗體工作液100 μL,將反應(yīng)板置37 ℃溫箱60 min,使酶標(biāo)抗體工作液與生物素化一抗結(jié)合成復(fù)合物;洗板;每孔加入OPD(鄰苯二胺)底物工作液100 μL,置37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min;每孔加入1滴終止液(2M硫酸)混勻;在酶標(biāo)儀上450 nm處測(cè)各孔吸光值。用curve expert1.3軟件,IFN-γ以標(biāo)準(zhǔn)品4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL之OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上求出每mL組織勻漿中相應(yīng)因子的含量。IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 pg/mL之OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上求出每毫升組織勻漿中相應(yīng)因子的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用(±s)描述,行單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD法進(jìn)行,以P<0.05表示為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素致肺損傷大鼠肺組織病理學(xué)影響 HE染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔清晰,肺泡壁未見(jiàn)異常充血,肺間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞。模型組大鼠病變主要表現(xiàn)為肺泡壁增厚伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),部分大鼠肺組織出現(xiàn)片狀實(shí)變炎性反應(yīng)灶,肺泡塌陷,肺泡出血。各治療組大鼠病變特征與模型組相似,但肺泡損傷的程度較模型組不同程度減輕(圖1)。肺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示,地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg)組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分較模型組明顯下降(P<0.05),蛭丹化瘀組方(16.5、8.25 g/kg)組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分雖較模型組有下降趨勢(shì),但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE×400)

2.2 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素致肺損傷大鼠炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的影響 模型組大鼠肺組織炎性反應(yīng)因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量較正常組大鼠明顯增高(P<0.01或P<0.05),陽(yáng)性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33、16.5、8.25 g/kg)可明顯降低大鼠肺組織TNF-α及IL-6含量,差異較模型組明顯(P<0.01);蛭丹化瘀組方16.5 g/kg組大鼠肺組織IL-1β含量較模型組顯著性降低(P<0.05)。

表2 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺組織炎性因子的影響(±s)

表2 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺組織炎性因子的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

組別只數(shù)劑量(g/kg)TNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)IL-6(pg/mL)正常組9-23.07±3.23**76.70±41.96*38.82±20.60**模型組9-32.39±10.57118.28±45.7783.28±46.19地塞米松組120.000518.41±6.38**124.11±32.8544.71±18.17**蛭丹化瘀組方113316.69±5.20**102.60±42.3140.41±11.90**蛭丹化瘀組方1116.517.54±4.80**83.42±31.69*33.27±40.45**蛭丹化瘀組方128.2518.64±8.75**100.18±36.7939.53±44.04**

3 討論

急性肺損傷是以肺泡-毛細(xì)血管膜的急性彌散性損傷為主要病理改變的危急重癥[5],其主要原因與炎性反應(yīng)細(xì)胞因子大量釋放導(dǎo)致炎性反應(yīng)瀑布樣反應(yīng)有關(guān)[6]。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組成部分,其誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥是急性肺損傷常見(jiàn)誘因。通過(guò)氣管內(nèi)滴入LPS,建立與呼吸道細(xì)菌感染的過(guò)程相似的急性肺損傷模型,是目前國(guó)內(nèi)外普遍使用的模擬人類因感染誘發(fā)急性肺損傷的造模方法[7]。在LPS刺激下,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)入肺組織,激活的中性粒細(xì)胞釋放炎性反應(yīng)因子,引起炎性反應(yīng)瀑布樣反應(yīng)[8]。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到大鼠氣管內(nèi)滴入LPS后可見(jiàn)肺間隔加寬,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變,說(shuō)明內(nèi)毒素致急性肺損傷模型成功。過(guò)度、失控的炎性反應(yīng)是各種病因所致ALI的根本原因,LPS作為肺部炎性反應(yīng)的重要促發(fā)因子,進(jìn)入肺內(nèi)與效應(yīng)細(xì)胞表面TLR4和CD14受體發(fā)生特異性結(jié)合,啟動(dòng)多形核白細(xì)胞,釋放各種炎性反應(yīng)遞質(zhì)[9]。

作為炎性反應(yīng)過(guò)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞,中性粒細(xì)胞激活后釋腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β)、和白介素-6(IL-6)等炎性反應(yīng)細(xì)胞因子,破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞緊密連接,參與肺泡毛細(xì)血管膜損傷[10],相關(guān)報(bào)道表明TNF-α和IL-6的含量在急性肺損傷后2 h開(kāi)始增加,并于6～24 h達(dá)到高峰[11]。TNF-α可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,增加其通透性,導(dǎo)致白細(xì)胞黏附、中性粒細(xì)胞脫顆粒并趨化到炎性反應(yīng)損傷部位[12],IL-6和IL-1β可活化巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞,增強(qiáng)其活性,通常與TNF-α起協(xié)同作用[13]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后,大鼠的肺組織呈現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的病理改變,肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β濃度明顯升高,說(shuō)明促炎因子釋放是ALI發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。蛭丹化瘀組方可明顯降低肺組織炎性反應(yīng)因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量,提示蛭丹化瘀組方可有效阻斷促炎因子的炎性反應(yīng)活化,對(duì)急性肺損傷具有良好的保護(hù)作用。

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(2016-02-29收稿 責(zé)任編輯：王明)

世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)絡(luò)病專業(yè)委員會(huì)中俄學(xué)術(shù)論壇在莫斯科召開(kāi)

世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)絡(luò)病專業(yè)委員會(huì)中俄絡(luò)病學(xué)術(shù)論壇于2016年4月20日在俄羅斯莫斯科勝利召開(kāi)，來(lái)自中國(guó)境內(nèi)及俄羅斯當(dāng)?shù)氐墓灿?jì)200余名專家學(xué)者參加了本次論壇。

首先以嶺藥業(yè)營(yíng)銷中心王衛(wèi)平總經(jīng)理代表以嶺集團(tuán)，向遠(yuǎn)道而來(lái)的參會(huì)專家表示熱烈的歡迎和衷心的感謝。

秦樹(shù)坤秘書(shū)長(zhǎng)助理出席開(kāi)幕式并講話，對(duì)各位專家的出席表示歡迎。他向與會(huì)專家介紹了世界中聯(lián)成立以來(lái)在學(xué)術(shù)發(fā)展、團(tuán)隊(duì)建設(shè)、中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化、國(guó)際化推廣等方面做出的積極貢獻(xiàn)。他指出絡(luò)病專業(yè)委員做為世界中聯(lián)的一個(gè)分支機(jī)構(gòu)應(yīng)繼續(xù)圍繞學(xué)會(huì)總體發(fā)展目標(biāo)，為中醫(yī)藥的國(guó)際發(fā)展作出更大貢獻(xiàn)。

絡(luò)病專業(yè)委員會(huì)尹宏軍副秘書(shū)長(zhǎng)代表絡(luò)病專業(yè)委員會(huì)，介紹了專業(yè)委員會(huì)成立以來(lái)的發(fā)展情況。并指出專委會(huì)將繼續(xù)遵循世界中聯(lián)分支機(jī)構(gòu)發(fā)展的宗旨和任務(wù)，做出更多努力。尤其是專委會(huì)在學(xué)術(shù)發(fā)展方面已經(jīng)做出了一定的成績(jī)，每年一屆的國(guó)際絡(luò)病學(xué)術(shù)大會(huì)以及區(qū)域?qū)W術(shù)論壇，為中醫(yī)絡(luò)病學(xué)的國(guó)際推廣做出了貢獻(xiàn)。

上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院傅曉東教授，在會(huì)上做了動(dòng)脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合治療的主題報(bào)告，他指出動(dòng)脈粥樣硬化是不可避免的，不穩(wěn)定斑塊是心腦血管病發(fā)生的根本，降低ASCVD風(fēng)險(xiǎn)和事件已被臨床診療指南推薦為治療的最終目標(biāo)。并通過(guò)循證醫(yī)學(xué)研究證明，通心絡(luò)膠囊與他汀類聯(lián)合治療動(dòng)脈粥樣硬化可進(jìn)一步降低心血管事件的發(fā)生率，降低用藥不良風(fēng)險(xiǎn)。

中日友好醫(yī)院專家侯丕華教授，就中藥整合調(diào)節(jié)-安全有效治療心律失常向與會(huì)專家做了報(bào)告，她指出現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)心律失常的治療采用單純的阻抑對(duì)抗治療方法，存在諸多不盡人意的問(wèn)題；調(diào)律是心律失常治療的新策略，如循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí)參松養(yǎng)心膠囊在心功能不全伴室性早搏、竇性心動(dòng)過(guò)緩伴室性早搏等西醫(yī)治療棘手的問(wèn)題上體現(xiàn)出非常好的療效，治療心律失常方面的安全性也要優(yōu)于西藥。

與會(huì)專家還前往北京中醫(yī)藥大學(xué)圣彼得堡醫(yī)院中醫(yī)中心進(jìn)行了考察，俄方專家尤里·阿納托利耶維奇就針灸治療神經(jīng)官能癥在俄羅斯的臨床應(yīng)用做了報(bào)告,并與大家就中醫(yī)藥在俄羅斯當(dāng)?shù)氐陌l(fā)展進(jìn)行座談。

本次論壇學(xué)術(shù)氛圍濃厚，得到了與會(huì)專家積極響應(yīng)。

Effects of Zhi Dan Hua Yu formula on inflammation of acute lung-injured rats induced by LPS

Li Manzhong1，Wang Yali1，Li Zhaoxia1，Zhao Hui1，Shen Su2，Wang Lili2，Li Ren2

(1SchooloftraditionalChinesemedicine，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China; 2BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050,China)

Objective:To observe the effect of Zhi Dan Hua Yu formula on acute-injured lung of rats induced by LPS.Methods:A total of 72 SD rats withhalf males and half females were divided into control group,model group,Zhi Dan Hua Yu group(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)and dexamethasone group by random.Acute lung injury induced by instillation of LPS; HE staining; to observe the pathological changes of lung tissue and give a pathological score of lung injury by light microscope; to detect the content of lung tissue inflammation factor interleukin-1 beta(IL-1)and interleukin 6(IL-6)，tumor necrosis factor alpha(TNF alpha).Results:Compared with normal group，the Model group rats lung tissue pathological score were increased，TNF-a，IL-1 and IL-6 were significantly increased(P<0.01).compared with the model group rats zhidanhuayu prescription 33 g/kg and dexamethasone group rat lung tissue pathological score were significantly decreased(P<0.05).dexamethasone and zhidanhuayu prescription(33，16.5，8.25 g/kg)can significantly reduce the lung tissue TNF alpha，IL-6.zhidanhuayu prescription 16.5 g/kg also can significantly reduce the content of IL-1，which is more obvious than that of model group(P<0.01).Conclusion:Zhidanhuayu formula could reduce the acute lung injury induced by LPS，the effect mechanism may be related to the decrease of TNF-a，IL-6 and IL-1 content.

Zhidanhuayu prescription; Lipopolysaccharide; Lung injury; Inflammatory factors

北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)“十病十藥”研發(fā)項(xiàng)目(編號(hào):Z141100002214019)——“蛭丹化瘀組方用于治療小兒病毒性肺炎的成藥性研究”

李朝霞(1977.09—),女,博士研究生,講師,研究方向:中藥新藥與新劑型的研究,E-mail:gmacli@139.com

R285.5

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.034