崔夢麗 劉雅敏 胡春月 崔 浩 陳 慶 蘇 夢 朱寶玉

(1 河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州，450046； 2 輔仁藥業(yè)集團有限公司，鄭州，450008)

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高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定小兒清熱寧顆粒中膽酸的含量

崔夢麗1劉雅敏1胡春月1崔 浩2陳 慶1蘇 夢1朱寶玉1

(1 河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州，450046； 2 輔仁藥業(yè)集團有限公司，鄭州，450008)

目的：建立小兒清熱寧顆粒中膽酸的含量測定方法；方法：樣品制備采用甲醇超聲30 min提取，色譜條件為色譜柱Venusil XBP C18(L)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相甲醇-1%冰醋酸溶液(75∶25，v/v)，流速1.0 mL/min，柱溫為25 ℃；檢測器漂移管溫度控制為40 ℃，載氣氣體流速為2.0 L/min，增益為4。結(jié)果：膽酸的工作曲線為lg A=1.582 lg C+2.972 9(r=0.999 4)，進樣量在0.502～2.51 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率的RSD為1.969 6%。陰性對照無干擾。結(jié)論：所建立的含量測定方法專屬性強，可用于小兒清熱寧顆粒的質(zhì)量控制。

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法；小兒清熱寧顆粒；膽酸

小兒清熱寧顆粒是治療小兒病毒性感冒的常用中成藥，具有解熱鎮(zhèn)痛、提高免疫力等作用，收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準《中藥成方制劑》第十二冊。由黃芩、板藍根、金銀花、柴胡、羚羊角粉、水牛角濃縮粉、人工牛黃、冰片8味藥組成[1]。目前該藥尚無人工牛黃的質(zhì)量控制標準，僅見于對其中膽紅素進行含量測定的研究報道[2]，但是膽紅素不是解熱鎮(zhèn)痛抗病毒的有效成分[3-4]。人工牛黃的主要成分是膽酸(含量不小于13%)，具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎的作用，是小兒清熱寧顆粒的有效成分[5-7]，因此，應(yīng)對膽酸含量建立質(zhì)控標準。膽酸在小兒清熱寧顆粒處方中含量極低，約占0.06%，而且膽酸結(jié)構(gòu)中不含生色團，紫外吸收波長在192 nm左右，用HPLC紫外檢測進行定量分析時，會出現(xiàn)流動相干擾性大、檢測靈敏度低等缺陷。蒸發(fā)光檢測器其響應(yīng)值不依賴于樣品的光學(xué)特性，而取決于被測物質(zhì)顆粒的數(shù)量和大小，對無紫外吸收或紫外末端吸收的物質(zhì)具有較高的檢測靈敏度[8]。因此，本實驗研究建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定方中膽酸含量的方法，為小兒清熱寧顆粒中人工牛黃的質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 METTLER AE240十萬分之一天平(德國梅特勒公司)；高效液相色譜系統(tǒng)：Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)；BSA 124S萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；UPD-II-107型優(yōu)普系列超純水機(成都超純科技有限公司)；DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(鄭州生元儀器有限公司)；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品 膽酸對照品(購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：100078-200414)；小兒清熱寧顆粒(河南輔仁堂制藥有限公司，批號：201406041、201406012、201405081、201406021、201403122、201404082)；無膽酸的陰性樣品(自制)。

1.3 試劑 甲醇(DIKMA TECHNOLOGIES IN，批號：50102)，冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20140122)，均為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的膽酸對照品25.10 mg，置25 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作為儲備液；精密吸取儲備液1 mL置10 mL棕色量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，對照品溶液濃度為0.100 4 mg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備[9]取小兒清熱寧顆粒2袋，研細，精密稱取4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱重，30 ℃超聲(功率150 W，40 kHz)提取30 min，放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液于蒸發(fā)皿中，70 ℃水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，搖勻，制成供試品溶液。

2.1.3 陰性對照品溶液的制備 按小兒清熱寧顆粒制備工藝，制備不含人工牛黃的陰性顆粒。精密稱取陰性樣品，照“2.1.2”項下方法制成陰性對照品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 ELSD參數(shù)：漂移管溫度：40 ℃，載氣氣流流速：2.0 L/min，增益=4。色譜柱：Venusil XBP18(L)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-1%冰醋酸溶液(75：25，v/v)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL。理論塔板數(shù)按照膽酸計算≥5 000，分離度>1.5。

2.3 專屬性 分別取“2.1.1”項下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，注入液相色譜儀，照“2.2”項下色譜條件操作進樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1，顯示膽酸峰分離度良好，陰性樣品無干擾。

圖1 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取膽酸對照品溶液5，8，10，12，15，20，25 μL，依次注入液相色譜儀，照“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以膽酸進樣量的對數(shù)值(lgC)與峰面積的對數(shù)值(lgA)進行線性回歸，得膽酸的工作曲線：lg A=1.582 lg C+2.972 9(r=0.999 4)。

2.4.2 精密度 精密“2.1.1”項下吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，照“2.2”項下色譜條件進行測定，計算峰面積，RSD值為0.87%。表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性 分別精密吸取膽酸對照品溶液10 μL、供試品溶液20 μL，室溫放置0，2，5，8，12，24 h，照“2.2”項下色譜條件進樣測定，對照品溶液和供試品溶液峰面積的RSD值分別為2.06%，1.69%。表明對照品溶液和供試品溶液在室溫情況24 h內(nèi)，溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性 精密稱取同一批號(201406021)的小兒清熱寧顆粒6份，按照“2.1.2”項下的方法平行制備供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中膽酸含量。小兒清熱寧顆粒中膽酸的平均含量為0.046 02 mg/g，RSD值為0.88%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率 精密稱取同一批已知含量的樣品(批號：201406021)9份，每份4 g，分成3組。分別精密加入膽酸對照品溶液1、1.5、2.5 mL，依法制備供試品溶液并測定膽酸含量。計算加樣回收率。結(jié)果見表1。檢測結(jié)果表明，回收率的RSD為1.97%，本方法準確度高。

表1 膽酸加樣回收率試驗

2.5 樣品含量測定 取6個批次的小兒清熱寧顆粒，按照“2.1.2”項下方法制備樣品，并按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算膽酸含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

1)關(guān)于從牛黃或復(fù)方中提取膽酸制備供試品的方法，文獻報道主要有乙酸乙酯超聲[10]，氯仿超聲[5]，石油醚超聲[4]。本實驗采用甲醇超聲提取與之對照，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取率較高。推測原因應(yīng)當是膽酸在人工牛黃中以膽酸鹽形式存在的比例高，甲醇極性大于上述溶劑，因此甲醇的提取率高。實驗還比較了超聲提取和加熱回流2種提取方式，結(jié)果證明兩者的提取率無明顯差異，因此選擇操作簡便的超聲提取。

2)膽酸分子結(jié)構(gòu)狀態(tài)受pH的影響。當pH值為4～6時，游離膽酸以離子型和非離子型2種形式存在[11]，蒸發(fā)光檢測器對分子型膽酸有很好的檢測靈敏度。有研究者對其研究的復(fù)方采用甲醇提取，過中性氧化鋁柱[4]、水液稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至酸性-乙酸乙酯萃取[12-13]膽酸等分子態(tài)膽酸的富集純化方法，再用酸性流動相分離檢測。本實驗采用甲醇超聲提取液直接進樣，以甲醇-0.1%冰醋酸的酸性系統(tǒng)為流動相，抑制膽酸電離，其檢測效果與上述提取純化供試品無明顯差異。本實驗采用的這種測定方法可以簡化樣品制備過程，便于在生產(chǎn)實際中應(yīng)用。

3)ELSD對檢測性能的主要影響在于載氣氣流流速、漂移管溫度和增益[14-15]。載氣氣流流速與基線的穩(wěn)定性有關(guān)，漂移管溫度直接決定檢測中流動相的揮發(fā)性，增益影響檢測器對散射光的靈敏程度。實驗過程中，分別考察了不同載氣氣流流速(1.5、2、2.5 L/min)，不同漂移管溫度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)，不同增益(1、2、4、8、16)對響應(yīng)值及信噪比的影響。綜合分析色譜圖發(fā)現(xiàn)：增益=4，載氣氣流流速=2.0 L/min，漂移管溫度=40 ℃條件時，噪聲最小，進樣分析的峰形良好，基線穩(wěn)定。

本實驗建立的高效液相-蒸發(fā)光法測定小兒清熱寧顆粒中膽酸含量方法，具有操作方法簡捷，分析條件易于精確控制，待測成分易于分離等優(yōu)點，且通過上述方法學(xué)考察，證明此方法具有較好的重現(xiàn)性和較高的精密度。

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(2015-08-05收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Determination of Cholic Acid in Xiaoer Qingrening Granule by HPLC-ELSD

Cui Mengli1, Liu Yamin1, Hu Chunyue1, Cui Hao2, Chen Qing1,Su Meng1, Zhu Baoyu1

(1HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China;2FurenPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.,Zhengzhou450000,China)

Objective:To establish an HPLC-ELSD method for determination of cholic acid in Xiaoer Qingrening Granule. Methods:Samples were prepared by ultrasonic extraction of methanol for 30 min. Venusil XBP C18(L) (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column was used with methanol-0.1% phosphoric acid solution (75∶25, v/v) with the mobile phase at 1.0 mL/min. The temperature of column was set at 25 ℃ and drift tube was 40 ℃. The flow rate of gas was maintained at 2.0 L/min. Results:The linearity was obtainedfrom 0.502～2.51 μg (r=0.999 4). The average recovery was 100.532 1% withRSD=1.969 6%. Conclusion:The method is specific, and can be used for quality control of Xiaoer Qingrening Granule.

HPLC-ELSD; Xiaoer Qingrening Granule; Cholic acid

國家科技重大專項(編號：2013ZX09201023)

崔夢麗(1990.03—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：中藥制劑技術(shù)與質(zhì)量控制研究

劉雅敏(1960.06—)，教授，研究方向：主要從事中藥制劑技術(shù)與質(zhì)量控制研究，E-mail：l_yamin@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.041