張姝江 李 穎 白 波 陳 藝

(1 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣東省矯形技術(shù)與植入材料重點實驗室，廣州，510120；2 廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，佛山，528200)

?

中藥骨康方對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞骨架保護作用的初步實驗研究

張姝江1李 穎2白 波1陳 藝1

(1 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣東省矯形技術(shù)與植入材料重點實驗室，廣州，510120；2 廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，佛山，528200)

目的：探討在離心力作用下中藥骨康方對大鼠成骨細胞微絲結(jié)構(gòu)的保護與修復作用。方法：選用成年新西蘭白兔，分2組分別灌服中藥骨康方及戊酸雌二醇，制備中藥骨康方和雌激素的含藥血清。原代培養(yǎng)大鼠成骨細胞，制備細胞爬片，分為中藥骨康方血清培養(yǎng)組(中藥組)，雌激素血清培養(yǎng)組(西藥組)、不含藥血清組(對照組)以及空白組。中藥組、西藥組及對照組3組細胞分別在240 g、200 g離心力下離心4 min，空白組不離心，離心后培養(yǎng)24 h以多聚甲醛固定各組細胞，鬼筆環(huán)肽熒光染色后，于共聚焦顯微鏡下觀察。每張細胞爬片隨機取5個視野，每個視野5～7個細胞，計算平均熒光值，并作統(tǒng)計學計算，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：不同離心力作用下，中藥組、西藥組細胞與對照組細胞比較熒光強度明顯較強，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。中藥組與西藥組中，240 g離心力與200 g離心力相比，前者細胞微絲熒光強度顯著減弱(P<0.001)；中藥組與西藥組相比，200 g時，中藥組細胞微絲熒光強度強于西藥組細胞，有統(tǒng)計學意義(P<0.001);240 g時，西藥組細胞微絲熒光強度強于中藥組細胞，且有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。結(jié)論：離心力作用下，中藥骨康方含藥血清對大鼠成骨細胞的微絲結(jié)構(gòu)由保護和修復作用，但隨著離心力的加大，該作用有限。

中藥；成骨細胞；肌動蛋白；機械應力

成骨細胞在繼續(xù)分化為骨細胞并修復重建骨結(jié)構(gòu)的過程會收到環(huán)境中力學刺激的影響，而成骨細胞如何感應到力學作用并轉(zhuǎn)化為信號影響其自身的增殖和相關(guān)蛋白表達是如今的一個研究點。目前有研究對機械應力作用于成骨細胞后，細胞骨架的變化進行了觀察，發(fā)現(xiàn)靜壓力使細胞間隙發(fā)生改變，而流體剪切力則直接影響胞質(zhì)微絲排列，從而使細胞骨架異常，發(fā)生細胞皺縮和形態(tài)改變[1-2]。周期性應力對骨質(zhì)疏松的成骨細胞有增粗微絲改善細胞骨架的作用。但是離心力對細胞骨架主要是破壞作用，而中藥骨康方能否對這種破壞作用起到保護效果，以及其機制為何是本研究探討的內(nèi)容。

1 資料與方法

1.1 一般資料 戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，中國)，中藥骨康方提取液(含生藥量1.43 g/mL，廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院制劑室)，藥物組成為：補骨脂，制淫羊藿，熟地黃，肉蓯蓉，當歸，大棗，黃芪，白芍，菟絲子；小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclon公司，美國)，鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin，Sigma)，共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國)，低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將4只健康新西蘭兔隨機分為2組，每組2只，分為中藥觀察組和西藥對照組。觀察組灌服中藥骨康方，對照組灌服戊酸雌二醇，灌胃給藥容積為10 mL/kg。用藥量以成人的用量推算動物用量，根據(jù)人與動物及各類動物間藥物劑量換算方法計算[6]。成人按60 kg計算，每天口服28.6 g中藥復方，以此推算：兔中藥復方用量=2.30×28.6×60-1g×kg-1=1.096 g×kg-1；成人按60 kg計算，每天口服1 mg戊酸雌二醇，以此推算：兔戊酸雌二醇用量=2.30×1×60-1mg×kg-1=0.038 mg×kg-1。所用藥物以蒸餾水定容至所需濃度，灌胃1次/d，連續(xù)灌胃7 d。2組大白免連續(xù)灌胃1周，最后一次灌胃后2 h，分別行心臟采血，將獲得的全血置于含抗凝劑的試管中，5～10 min后，于3 000 r/min離心15 min，吸取上清，即獲取含藥血清，再滅活，抽濾除菌，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SD大鼠成骨細胞培養(yǎng) 1周齡SD大鼠的乳鼠20只，雌雄不限，處死后常規(guī)消毒。無菌條件下取乳鼠頭蓋骨，去掉肌肉及結(jié)締組織，用含雙抗的磷酸緩沖液(Phosphate Buffer Solution，PBS)漂洗后剪碎，加入0.1% EDTA與0.25%胰蛋白酶(Typsin，TNE)，于37 ℃下消化30 min。加入含血清的培養(yǎng)基DMEM中止消化，棄去上清液，加入0.1%的I型膠原酶，繼續(xù)于37 ℃下消化1 h。取消化后的混懸液離心，棄上清，加入20%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，反復吹打使細胞分散均勻。以105個/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃，飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液。選擇3代成骨細胞，分別以不同含藥血清做預處理培養(yǎng)，分為中藥骨康方血清培養(yǎng)組(中藥組)、雌激素血清培養(yǎng)組(西藥組)以及空白組：分別加入10%中藥組兔血清的高糖DMEM、10%西藥組兔血清的高糖DMEM以及10%小牛血清高糖DMEM，培養(yǎng)3～5 d，待細胞達到80%融合后，用0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA混合液消化傳代，接種于蓋玻片上制成細胞爬片。

1.2.3 不同離心力對細胞骨架作用觀察 中藥組、西藥組以及對照組的細胞爬片培養(yǎng)2 d后，分別于240 g和200 g離心力下離心，離心時間4 min；空白組細胞爬片不加藥物亦不離心處理。離心后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組細胞爬片以多聚甲醛固定細胞。

1.2.4 成骨細胞牽引后激光共聚焦顯微鏡下肌動蛋白細胞骨架的原位表達 固定后的細胞爬片經(jīng)PBS漂洗后，加入鬼筆環(huán)肽,5 μg/mL，避光，于37 ℃下孵育30 min；PBS洗片兩次，避光，以PI20 μg/mL復染30 min,50%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡(LSM70，德國Zeiss)下觀察,選擇波長為488 nm。隨機取5個視野，每個視野讀取熒光強度并計算平均值。

2 結(jié)果

共聚焦熒光顯微鏡下觀察，熒光染色后的細胞骨架。240 g離心力作用后，對照組與含藥血清培養(yǎng)的中藥組及西藥組比較，前者微絲松散、紊亂，細胞出現(xiàn)皺縮、翻卷，熒光強度明顯較弱(圖1)；而240 g離心力作用后，中藥組與西藥組成骨細胞的微絲松散程度相似，形態(tài)略皺縮，熒光強度差異不大。200 g受力細胞中，中藥組與西藥組成骨細胞的微絲保持較完整，形態(tài)正常，2組在熒光顯微鏡下細胞形態(tài)差別不大；未用藥的對照組細胞在受離心力作用后，細胞皺縮翻卷明顯，細胞骨架熒光暗淡、紊亂(圖2)。與不受力的空白對照組相比，中藥組200 g和西藥組200 g的細胞形態(tài)與正常貼壁細胞相同。

圖1

圖2

每組熒光染色細胞爬片在鏡下隨機取5個視野，每個視野讀取5～7個細胞的熒光強度平均值，結(jié)果計算s，具體結(jié)果見表1。中藥組與西藥組之間進行比較，并與未用藥的對照組比較發(fā)現(xiàn)：不同離心力作用下，含藥血清培養(yǎng)的2組細胞與未用藥對照組細胞，其熒光強度明顯較強，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。含藥血清培養(yǎng)的2組細胞中，240 g受力與200 g受力相比，前者細胞微絲熒光強度顯著減弱(P<0.001)；中藥組與西藥組相比，在200 g時，中藥組細胞微絲的熒光強度強于西藥組細胞，有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，但240 g時，西藥組細胞微絲熒光強度強于中藥組細胞，且有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表1 中西藥物組在不同轉(zhuǎn)速離心后的細胞骨架熒光值讀數(shù)比較(s)

3 討論

力學刺激在骨的發(fā)生以及成骨細胞修復骨組織損傷都有重要的作用。在周期性的機械應變力、太空微重力等環(huán)境下，骨細胞骨架可以發(fā)生重排，機械力對細胞的成長分化有重要作用[3-5]。靜壓力和剪切力對成骨細胞骨架的調(diào)節(jié)作用不同，靜壓力作用下的細胞形態(tài)變化微弱，但剪切力可以使細胞內(nèi)微絲成束重排，細胞變形脫落[2]，陳偉輝等[1]發(fā)現(xiàn)在流體剪切力作用后，受力的大鼠成骨細胞株出現(xiàn)皺縮、脫落和微絲解聚消散。而離心力對細胞內(nèi)微絲系統(tǒng)有類似剪切力的效果。陳國平等[6]觀察到在離心力作用下，成骨細胞的微絲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)解聚，去除刺激后可以緩慢恢復。關(guān)鍵等發(fā)現(xiàn)[7]，離心力對MC3T3成骨細胞株的刺激可導致Runx2的mRNA表達增加；Li等[8]對成骨樣細胞施加離心力10 min后檢測到Runx2/Cbfal mRNA表達水平有短暫地增加改變，認為成骨細胞通過多種復雜途徑響應機械力學刺激。Fitzgerald等[9]認為對MC3T3-E1細胞加載3×g到287×g離心力都會引起特定基因的mRNA表達增加。機械力學刺激對細胞的多種影響最終體現(xiàn)在細胞骨架的改變上，機械應力作用下，在細胞表面的信號通路相關(guān)蛋白覺察到應力刺激信號后，通過細胞骨架介導下游(Down Stream)反應[10-11]，從而調(diào)節(jié)成骨細胞增殖和分化，影響骨改建。

中藥對于治療骨病及關(guān)節(jié)炎性反應已有悠久歷史，目前也有許多研究者針對中藥治療骨病的藥物作用機制進行研究。有研究報道，骨康方可以調(diào)高成骨細胞保護素和核內(nèi)因子a1mRNA的表達水平，從而促進骨保護蛋白的表達分泌[12]，而該方在大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究中也表現(xiàn)出可以調(diào)高骨密度的作用[13]。成骨細胞在未受力時，纖維束粗大而分布均勻，應力纖維清晰可見，受力后,大多數(shù)細胞的纖維束變得纖細而稀疏，分布不均勻，方向性變差，并且隨加力時間延長而更加明顯[14]。通過共聚焦熒光顯微鏡對細胞骨架進行觀察，可以了解在機械力作用后細胞骨架的變化?？偀晒鈴姸?、綠色熒光強度隨加力時間延長均顯著降低，這說明微絲結(jié)構(gòu)在機械牽張下發(fā)生了解聚和重排。肌動蛋白F-actin是微絲的主要成分,其重排和解聚的動態(tài)變化，可以反映部分細胞的功能狀況，尤其是細胞結(jié)構(gòu)的狀況。以含藥血清體外培養(yǎng)細胞并觀察藥物對細胞的影響是常用的實驗研究手段[12,15-16]。本研究采用中藥骨康方湯劑喂食大鼠后制備同種動物系的含藥血清，并通過熒光染色觀察F-actin的變化，從而研究含藥血清對大鼠MSC細胞骨架的保護和修復作用。經(jīng)骨康方含藥血清培養(yǎng)的大鼠MSC細胞在經(jīng)過離心力作用后，細胞骨架微絲系統(tǒng)能獲得一定程度的保護和修復，其效果與雌激素含藥血清培養(yǎng)的細胞類似，在200 g離心力時，甚至優(yōu)于雌激素含藥血清的保護作用。但隨著離心力的加大，該保護作用有限，到240 g時，該保護作用弱與雌激素含藥血清的效果，細胞還是會出現(xiàn)骨架微絲系統(tǒng)紊亂的現(xiàn)象。但與完全無含藥血清的對照組細胞相比，實驗組細胞骨架被破壞程度小，且在停止離心力作用并培養(yǎng)1 d后，可以得到恢復。

目前已知常用的治療骨質(zhì)疏松的藥物包括雌激素，阿侖膦酸鈉等，此類藥物對成骨細胞骨架有修復和保護的作用[17]。中藥骨康方也是用于骨質(zhì)疏松防治的中藥方劑，有實驗研究[18-20]證明中藥骨康方對骨代謝既可抑制骨吸收，又可促進骨形成，從而改善骨的質(zhì)量。臨床研究發(fā)現(xiàn)對于骨質(zhì)疏松的患者采用該方治療后，骨密度有明顯增加[20]。根據(jù)本研究的結(jié)果，中藥骨康方在成骨細胞受到外力刺激，對細胞微絲等結(jié)構(gòu)系統(tǒng)產(chǎn)生破壞作用后，該方也顯示出了保護和修復的作用。此修復與保護效果為骨質(zhì)疏松的防治也提示了一條新的路徑。

[1]陳偉輝,喬鞠,田衛(wèi)東,等.不同流動剪切力對原代大鼠成骨細胞細胞骨架的調(diào)節(jié)作用[J].廣東牙病防治,2003，11(2):83-85.

[2]毛勇,段小紅,王忠義,等.不同應力對成骨細胞和細胞骨架影響的實驗研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2001，11(2):98-100.

[3]Lozupone E，F(xiàn)avia A，Grimaldi A.Effects of intermittent mechanical force on bone tissue in vitro：preliminary results[J].J Bone Miner Res，1992(Suppl 2)：S407-409.

[4]Buckley MJ，Banes AJ，Jordan RD.The effects of mechanical strain on osteoblasts in vitro[J].J Oral Maxillofac Surg，1990，48(4)：276-282.

[5]Vico L，Lafage-Proust MH，Alexandre C.Effects of gravitational change on bone system in vitro and in vivo[J].Bone，1998，22(5Suppl)：95S-100S.

[6]陳國平,周征,鄭翼,等.成骨樣細胞受力后細胞骨架中微絲形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的初步研究[J].華西口腔醫(yī)學雜志,2002，2(3)：213-215.

[7]關(guān)鍵,程宗生,王健平,等.成骨細胞Runx2對機械離心力刺激的響應[J].華西口腔醫(yī)學雜志，2010，28(l):38-40.

[8]Li J,Jiallg L，Liao G,et a1.Centrifugal forces within usually—used magnitude elicited a transitory and reversible change in proliferation and gene expression of osteoblastie cells UMR-106[J].Mol Biol Rep,2009，36(2)：299-305.

[9]Fitzgerald J，Hughes-Fulford M.Mechanically induced c-fos expression is mediated by cAMP in MC313-El osteoblasts[J].FASEB J,1999，13(3)：553-557.

[10]Pender N.Quantitation of actin polymerization in two human fibroblast subtypes responding to mechanical stretching[J].J Cell Sci，1991，100(Pt1)：187-193.

[11]Damsky CH.Signal transduction by integrin receptors for extracellular matrix：cooperative processing of extracellular information[J].Curr Opin Cell Biol，1992，4(5)：772-781.

[12]趙可偉,邱俊林,潘旭楓,等.中藥骨康調(diào)控成骨細胞核內(nèi)結(jié)合因子α1的表達[J].中國組織工程研究,2013，17(33):5929-5935.

[13]黃杰文,秦佳佳,張素萍.中藥骨康對骨質(zhì)疏松大鼠模型骨密度的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2009，26(6):546-549.

[14]戚孟春,胡靜,韓立赤,等.成骨細胞在機械力刺激下細胞骨架及細胞形態(tài)改變的體外研究[J].中國口腔領(lǐng)面外科雜志,2004，2(3):181-184.

[15]趙可偉,唐菊英,肖林，等.中藥骨康含藥血清培養(yǎng)脂肪干細胞移植促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中cbfa1和OCN的表達變化[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2013，19(6):561-567.

[16]Wang B，Luo YW，Hu NH.Gukang containing serum-induced rat bone marrow stromal cell diffentiation into osteoblasts direction experimental study[J].Chinese Journal of Traumatology，2007，11(1)：32-36.

[17]艾江平,譚光宏,余德濤,等.阿侖膦酸鈉對機械應力下大鼠成骨細胞骨架修復的影響[J].中國醫(yī)藥,2013，8(5):659-661.

[18]莊洪,邵敏.中藥骨康對去勢大鼠骨吸收與骨形成影響的實驗研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2002，10(4):26-29.

[19]莊洪,魏合偉,林一峰.中藥骨康含藥血清中類雌二醇樣物質(zhì)含量的測定[J].中醫(yī)正骨,2003，15(11):14-16.

[20]李志輝,王興水,韋玉玲,等.骨康方促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合的機理[J].中醫(yī)臨床研究,2014，6(1)：1-2.

(2015-08-20收稿 責任編輯：徐穎)

Preliminary Study on the Protective Effects of Gukang Fang on Microfilaments of Osteoblasts in Rats

Zhang Shujiang1, Li Ying2, Bai Bo1, Chen Yi1

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongKeylaboratoryofOrthopaedicTechnologyandImplantMaterials,Guangzhou510120,China; 2GuangdongIntegratedHospitalofTraditionalChineseMedicineandWesternMedicine,Foshan528200,China)

Objective: To explore the protective and repairing effect of Gukang serum for the F-actin of osteoblasts. Methods: Two groups of New Zealand adult rabbits were fed with Chinese medicine Gukang Fang and estradiol valerate to make the serum containing Gukang and estrogen. The osteoblasts were separated from SD rats and then cultured. The cells were seeded onto cover glasses, and divided into Chinese medicine group and estrogen group, which were cultured with Gukang-containing serum and estrogen-containing serum respectively. Non-drug group(control group) and blank group were also set up. The Chinese medicine group, estrogen group and control group were centrifuged at 240 g and 200 g for 4 min. All the samples were fixed by paraformaldehyde solution and then dyed by FITC-phalloidin. The samples were observed by confocal microscope, and the fluorescence intensities were calculated and compared by one-way ANOVA. Results: The two groups disposed by drug-containing serum showed better fluorescence intensitiy than the control group(P<0.001). At 200 g, Chinese mecicine group presented better than the estrogen group in fluorescence intensity; while at 240 g, estrogen group performed better in fluorescence intensity, and the differences were significant(P<0.001). Conclusion: Gukang-containing serum may protect and repair the microfilaments in osteoblasts of rat when exposed to centrifugal force, yet as the force increases, the protective and repairing effect might be limited.

Medicine; Chinese traditional; Osteoblast; Actins; Stress; Mechanical

廣州市科技計劃項目創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃珠江科技新星專項(編號：2012J2200037)；國家自然科學基金項目(編號：81001532)；廣東省自然科學基金項目(編號：S2014A030313748)；廣東省科技計劃項項目(編號：2013B021800162)

張姝江(1977.02—)，女，醫(yī)學博士，骨外科學講師，研究方向：骨與軟骨的損傷修復及組織工程，E-mail：orthop_zsj@163.com，Tel：(020)83341479

李穎(1979.02—)，男，醫(yī)學博士，骨外科學副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合骨質(zhì)疏松治療，E-mail：leewinly@163.com

R285

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.035