李 明，張 思，張建清，張 峰，翟 鈺，盧亞楠

( 1. 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266101 )

溫度、鹽度和pH對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

李 明1，張 思1，張建清1，張 峰1，翟 鈺2，盧亞楠1

( 1. 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266101 )

無(wú)脊椎動(dòng)物主要依靠天然免疫進(jìn)行自身防御，而活性氧在保護(hù)宿主免受病原侵害方面發(fā)揮重要作用。本文研究了環(huán)境因子溫度，鹽度和pH對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞吞噬過(guò)程中活性氧產(chǎn)生的影響。不同環(huán)境條件處理暫養(yǎng)7 d的仿刺參，于不同時(shí)間點(diǎn)抽取體腔液，然后用魯米諾化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)仿刺參體腔細(xì)胞體外吞噬酵母細(xì)胞時(shí)活性氧的產(chǎn)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比(17 ℃)，6 ℃和26 ℃水溫中的仿刺參分別從第1 d和第15 d極大地增加了活性氧的產(chǎn)生。鹽度25和鹽度35兩組仿刺參體腔細(xì)胞比對(duì)照組吞噬過(guò)程產(chǎn)生更多的活性氧，而鹽度16和40兩組第1 d時(shí)活性氧的產(chǎn)生亦顯著增強(qiáng)。較低pH同樣極大增強(qiáng)了吞噬作用中活性氧的產(chǎn)生。研究結(jié)果表明，溫度、鹽度和pH均可影響仿刺參體腔細(xì)胞吞噬過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生。該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究仿刺參在適應(yīng)不同環(huán)境時(shí)的生理生化過(guò)程及無(wú)脊椎動(dòng)物免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

溫度；鹽度；pH；活性氧；仿刺參

活性氧在無(wú)脊椎動(dòng)物防御病原入侵方面發(fā)揮重要作用，其主要包括超氧陰離子，羥自由基和過(guò)氧化氫等，正常代謝和環(huán)境刺激均可產(chǎn)生[1]。在疾病控制方面，活性氧被認(rèn)為是一把雙刃劍[1]。一方面，研究表明活性氧在免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等正常生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如體外刺激蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)變形細(xì)胞，可產(chǎn)生大量活性氧來(lái)清除非自身物質(zhì)[2]。另一方面， 活性氧產(chǎn)生異?；蛘{(diào)節(jié)紊亂又會(huì)造成機(jī)體的氧化損傷[3-4]。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)是一種研究衰老及衰老相關(guān)疾病的模式無(wú)脊椎動(dòng)物，Labuschagne等[5]以其為研究對(duì)象綜述了活性氧和氧化損傷的定量方法，有助于進(jìn)一步理解活性氧引起的衰老和疾病。因此，活性氧的問(wèn)題早已引起人們的關(guān)注。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)被認(rèn)為具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，已成為中國(guó)重要的漁業(yè)資源，仿刺參的養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。仿刺參特殊的進(jìn)化地位對(duì)于從比較免疫學(xué)角度闡述脊椎動(dòng)物免疫進(jìn)化具有重要意義。由于缺少獲得性免疫機(jī)制，仿刺參等棘皮動(dòng)物僅僅依靠天然免疫來(lái)進(jìn)行自身防御[6]。其中，伴隨著吞噬作用產(chǎn)生的活性氧在防御外源物質(zhì)侵害的天然免疫中扮演重要角色。活性氧可以引起DNA損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化和酶活性喪失來(lái)消除外來(lái)微生物或顆粒[7]。但是仿刺參的先天性免疫易受水溫、鹽度和pH等幾個(gè)環(huán)境因子的影響。因此，研究環(huán)境與仿刺參活性氧產(chǎn)生的關(guān)系對(duì)于進(jìn)一步了解仿刺參等棘皮動(dòng)物的免疫機(jī)制和預(yù)防養(yǎng)殖病害具有重要的意義。

筆者以仿刺參為研究對(duì)象，研究溫度、鹽度和pH驟變對(duì)仿刺參活性氧產(chǎn)生的影響。為進(jìn)一步研究仿刺參在適應(yīng)不同環(huán)境時(shí)的生理生化過(guò)程及免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

魯米諾為Sigma 公司產(chǎn)品，硼酸，KOH，HCl，NaOH均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，所用純水均為雙蒸水。

1.1.2 仿刺參

健康仿刺參，平均體質(zhì)量80 g，購(gòu)自大連長(zhǎng)興水產(chǎn)品市場(chǎng)，暫養(yǎng)于循環(huán)充氣水槽(60 cm×50 cm×40 cm)中，日換水1次，定時(shí)投喂配合飼料，清理殘餌和糞便，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d。

1.1.3 無(wú)菌海水

砂濾鹽度29～31的海水，經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素膜抽濾，高壓滅菌后置于錐形瓶?jī)?nèi)保存。

1.1.4 酵母懸液

取仿刺參體腔液于離心管中，4 ℃，5000 r/min離心5 min，留上清液。取100 mg干酵母，用仿刺參體腔上清液調(diào)理2 h(室溫)，離心棄上清液，過(guò)濾無(wú)菌海水離心洗兩次，最后用無(wú)菌海水50 mL配成2.0 mg/mL的懸液，密度約108cfu/mL，分裝于2 μL離心管中，冷凍貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 魯米諾發(fā)光液

稱取7.8 g氫氧化鉀，6.18 g硼酸和0.14 g魯米諾(5-氨基鄰苯二甲基酰肼)粉劑，溶解在79 mL雙重蒸餾水中，置于棕色瓶中，冰箱4 ℃保存。使用時(shí)將魯米諾母液用無(wú)菌海水稀釋10-1倍，即魯米諾濃度10-3mol/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)組設(shè)計(jì)

分別設(shè)置6、12、17 ℃(對(duì)照組)和26 ℃共4個(gè)溫度梯度；16、25、31(對(duì)照組)、35、40共5個(gè)鹽度梯度(用自來(lái)水和海水晶分別將正常海水調(diào)整至目的鹽度)；6.8、7.3、7.9(對(duì)照組)、8.4、8.8共5個(gè)pH梯度(用NaOH和HCl調(diào)整正常海水)。采用條件驟變，將暫養(yǎng)仿刺參直接置于相應(yīng)梯度設(shè)置的海水中。每個(gè)梯度組25只仿刺參。試驗(yàn)過(guò)程中，每日16：00投喂餌料1次，保證仿刺參餌料充足。每日用吸管清理殘餌和糞便，全量換水1次，保持水質(zhì)。溫度和鹽度組分別在第1、3、7、15 d和25 d取樣，pH組在第1、2、3、4 d和5 d取樣。

1.2.2 仿刺參體腔液采集

使用5 mL無(wú)菌注射器從仿刺參腹面口端身體1/3處扎入體腔，抽取體腔液約1 mL。為減少個(gè)體差異造成的影響，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置中隨機(jī)挑選3只仿刺參抽取體腔液，將其混合裝入5 mL無(wú)菌離心管中。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌海水稀釋體腔液到細(xì)胞密度106個(gè)/mL。

1.2.3 化學(xué)發(fā)光測(cè)定

使用Centro XS3 LB960化學(xué)發(fā)光儀(德國(guó)Berthold Technologies公司)，于96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μL混合體腔液，50 μL酵母懸液，50 μL魯米諾工作液，室溫下反應(yīng)，每10 min自動(dòng)生成數(shù)值并記錄(用相對(duì)光單位RLU表示)，反應(yīng)30 min時(shí)，記錄發(fā)光強(qiáng)度并作圖。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)每日相關(guān)梯度組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié) 果

與對(duì)照組相比(17 ℃)，試驗(yàn)中溫度6 ℃組，仿刺參體腔細(xì)胞體外吞噬過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生顯著增強(qiáng)，12 ℃組未受到明顯影響，而26 ℃組從第15 d開(kāi)始吞噬發(fā)光現(xiàn)象也明顯增強(qiáng)。試驗(yàn)過(guò)程中，6 ℃組仿刺參吞噬發(fā)光現(xiàn)象逐漸增強(qiáng)，12 ℃組發(fā)光現(xiàn)象始終變化不大，26 ℃組第1 d吞噬發(fā)光現(xiàn)象增強(qiáng)，隨后降低，第7 d達(dá)到最低值，而后又逐漸增強(qiáng)(圖1)。

不同鹽度處理第1 d，鹽度40與鹽度25及鹽度16極大地增加了仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬發(fā)光強(qiáng)度，隨后逐漸降低，第12 d時(shí)達(dá)到最低峰，第25 d時(shí)，發(fā)光值稍有回升。而鹽度35試驗(yàn)的，仿刺參的吞噬發(fā)光逐漸增強(qiáng)，第7 d時(shí)達(dá)到最高峰并保持穩(wěn)定。整個(gè)試驗(yàn)中對(duì)照組(鹽度31)發(fā)光值比較平穩(wěn)(圖2)。

第1 d，與對(duì)照組(pH 7.9)相比不同pH均抑制了體腔細(xì)胞的吞噬發(fā)光。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中偏堿性環(huán)境都起到了抑制作用。pH 8.8中的仿刺參吞噬發(fā)光現(xiàn)象受到抑制，且發(fā)光值逐漸減小，而第4和5 d發(fā)光值增大，但始終低于對(duì)照組。而較低的pH環(huán)境下從第2 d開(kāi)始，吞噬發(fā)光值顯著增強(qiáng)(P<0.05)(圖3)。

圖1 不同溫度條件下仿刺參體腔細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度

圖2 不同鹽度下仿刺參體腔細(xì)胞化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度

圖3 不同pH環(huán)境下仿刺參體腔細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度

3 討 論

與脊椎動(dòng)物不同，無(wú)脊椎動(dòng)物只能通過(guò)非特異的先天性免疫進(jìn)行自身防御。但是現(xiàn)存動(dòng)物95%為無(wú)脊椎動(dòng)物，這充分證明了先天性免疫系統(tǒng)的高效性。在無(wú)脊椎動(dòng)物中，棘皮動(dòng)物的體腔液細(xì)胞，尤其是吞噬細(xì)胞作為免疫的主要介導(dǎo)者在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。吞噬細(xì)胞對(duì)外來(lái)物質(zhì)的殺傷和清除主要有兩種機(jī)制：一是釋放溶酶體酶和溶細(xì)胞因子，二是呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧自由基。因此，吞噬過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧水平就成了衡量無(wú)脊椎動(dòng)物免疫水平的重要指標(biāo)。Allen于1972年首先發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞吞噬過(guò)程中的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，就此開(kāi)創(chuàng)了化學(xué)發(fā)光法簡(jiǎn)便快速的探測(cè)吞噬發(fā)光的新局面。加入酵母誘導(dǎo)劑后，皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)血細(xì)胞出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象(即檢測(cè)活性氧)，并在30 min左右出現(xiàn)一個(gè)峰值，隨后降低，體現(xiàn)了整個(gè)吞噬過(guò)程[8]。本試驗(yàn)中酵母誘導(dǎo)仿刺參體腔細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，同樣在30 min處達(dá)到峰值。峰值主要反映體腔細(xì)胞的氧化殺菌能力，體現(xiàn)吞噬功能[9]。因此，本研究檢測(cè)并記錄各試驗(yàn)組加入酵母誘導(dǎo)30 min時(shí)，仿刺參體腔細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。

水溫通常會(huì)刺激水生無(wú)脊椎動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答[10]，例如無(wú)脊椎動(dòng)物的雙殼類[11]。近年來(lái)由于溫度在調(diào)節(jié)生理過(guò)程和細(xì)胞中大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性方面的作用被發(fā)現(xiàn)，其重要性再度成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[12]。鹽度也是水生無(wú)脊椎動(dòng)物中一個(gè)非常重要的環(huán)境因子，影響無(wú)脊椎動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)。鹽度對(duì)仿刺參免疫功能呼吸及排泄等方面的影響國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，如鹽度對(duì)仿刺參的呼吸代謝、營(yíng)養(yǎng)需求、滲透調(diào)節(jié)、免疫力和抗逆性等方面的影響[13-15]。龔海濱等[16]的試驗(yàn)表明，仿刺參的鹽度耐受范圍為15～40，呂偉志等[17]發(fā)現(xiàn)在鹽度為16的海水中仿刺參可生存30 d。近岸海水的pH值極易受到其他因素影響而波動(dòng)，如淡水輸入、酸雨、工業(yè)污染和浮游植物代謝。pH波動(dòng)影響無(wú)脊椎動(dòng)物生理生化過(guò)程和免疫反應(yīng)。水生生物的正常生長(zhǎng)繁殖pH一般為6.5～8.2之間[18]。仿刺參的適宜pH范圍通常為7.8～8.7之間[19]。當(dāng)pH值低于6.0或高于9.0時(shí)，仿刺參收縮呈球狀瀕于死亡。預(yù)試驗(yàn)中pH 8.8時(shí)第3 d出現(xiàn)化皮，第8 d時(shí)化皮數(shù)量達(dá)到一半。溫度、鹽度和pH等環(huán)境因子均可以影響無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫細(xì)胞活性和生理過(guò)程[20-23]，對(duì)于水生無(wú)脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)和存活作用更強(qiáng)[24]。然而溫度、鹽度和pH等環(huán)境因子對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞吞噬過(guò)程中活性氧產(chǎn)生的影響研究鮮有報(bào)道。本文基于所參考文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)中的結(jié)果設(shè)計(jì)試驗(yàn)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

3.1 溫度對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

Coteur等[22]發(fā)現(xiàn)無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是在野外，水溫均可影響海星活性氧的產(chǎn)生，與相對(duì)溫度較高條件下的海星相比，低于6 ℃海水中的海星所產(chǎn)生的活性氧顯著增加。本試驗(yàn)中，6 ℃試驗(yàn)的的仿刺參吞噬發(fā)光值同樣顯著提高并且在試驗(yàn)期間逐漸增強(qiáng)。低溫下海水中的溶解氧飽和度明顯提高，更有利于活性氧的產(chǎn)生[25]，同時(shí)低溫刺激仿刺參產(chǎn)生免疫反應(yīng)可能是吞噬發(fā)光逐漸增強(qiáng)的主要原因。12 ℃組，試驗(yàn)第1 d溫度驟變?cè)鰪?qiáng)了仿刺參吞噬發(fā)光現(xiàn)象，隨后逐漸恢復(fù)到正常水平，表明在一定溫度變化范圍內(nèi)，活性氧的產(chǎn)生比較穩(wěn)定。與對(duì)照組(17 ℃)相比，溫度26 ℃組第15 d和25 d，仿刺參體腔細(xì)胞吞噬發(fā)光現(xiàn)象也有增強(qiáng)，此溫度可能導(dǎo)致仿刺參進(jìn)入夏眠[26]，而這一過(guò)程中相關(guān)抗氧化酶活性也顯著增加[27]，可能與活性氧的產(chǎn)生能力增強(qiáng)有關(guān)。

3.2 鹽度對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

本試驗(yàn)表明，處于鹽度40試驗(yàn)組，第12 d和25 d仿刺參吞噬過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生受到抑制。這與Coteur等[22]發(fā)現(xiàn)的海星活性氧的產(chǎn)生隨著鹽度升高而減少的結(jié)果一致。然而鹽度驟變到40、25和16時(shí)導(dǎo)致仿刺參滲透壓失衡，生理平衡受到影響，可能是第1 d活性氧增多的主要原因。試驗(yàn)中，鹽度25試驗(yàn)組中的仿刺參第1 d吞噬發(fā)光現(xiàn)象顯著增強(qiáng)，其后逐漸降低最后基本與對(duì)照組達(dá)到一致水平，表明仿刺參對(duì)海水鹽度小幅變化有一定的適應(yīng)能力。鹽度35試驗(yàn)組，吞噬發(fā)光現(xiàn)象逐步穩(wěn)定增強(qiáng)，表明一定范圍內(nèi)提高鹽度可能有利于仿刺參清除入侵外來(lái)物質(zhì)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。鹽度16試驗(yàn)組中的仿刺參，24 h后吞噬發(fā)光現(xiàn)象顯著增強(qiáng)，其后吞噬發(fā)光現(xiàn)象出現(xiàn)波動(dòng)，可能是較強(qiáng)的鹽度脅迫導(dǎo)致仿刺參滲透壓嚴(yán)重失衡，體腔液及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，能量消耗過(guò)度，吞噬細(xì)胞的功能受到抑制[28]。

3.3 pH對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

第1 d，pH驟變抑制了仿刺參體腔細(xì)胞吞噬過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生，可能是劇烈變化的pH影響了體腔液的酸堿度從而增強(qiáng)了體腔液內(nèi)部抗氧化酶的活性[31]，清除了部分活性氧。低pH隨后幾天極大的促進(jìn)體腔細(xì)胞吞噬過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生。然而pH脅迫中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)24 h后抑制了其抗氧化系統(tǒng)的功能[29]，本試驗(yàn)中，低pH可能會(huì)造成仿刺參的氧化損傷。pH 8.8中的仿刺參受到堿性環(huán)境脅迫，抑制了吞噬過(guò)程，吞噬發(fā)光值逐漸降低，然而第4 d和5 d又有所回升，可能是存活的仿刺參適應(yīng)了環(huán)境。

活性氧的產(chǎn)生對(duì)仿刺參防御病害至關(guān)重要，然而過(guò)多的活性氧對(duì)機(jī)體自身也會(huì)造成損傷，吞噬過(guò)程活性氧產(chǎn)生減少又不利于抵抗外源物質(zhì)的侵害。試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)境因子溫度、鹽度和pH對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞吞噬過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生影響很大，但具體影響機(jī)制還有待深入研究。本文為進(jìn)一步研究仿刺參在適應(yīng)不同環(huán)境時(shí)的生理生化過(guò)程及免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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EffectsofWaterTemperature,SalinityandpHonProductionofROSbyCoelomocytesofSeaCucumber(Apostichopusjaponicus)

LI Ming1, ZHANG Si1, ZHANG Jianqing1, ZHANG Feng1, ZHAI Yu2, LU Yanan1

( 1. Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China′s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China； 2. Qingdao Products Quality Supervision and Inspection Institute, Qingdao 266101, China )

Reactive oxygen species (ROS) play important roles in protection of host from pathogen in invertebrates which rely heavily on innate immune mechanisms to defence themselves. Here, the effects of environmental factors such as water temperature, salinity and pH on production of ROS by coelomocytes were studied in sea cucumberApostichopusjaponicusmaintained under different environmental conditions. Coelomic fluid was extracted at different time points and then ROS production during in vitro phagocytosis of yeast cells by coelomocytes was measured 7 d after being acclimatization by the luminol chemiluminescence method. The results showed that the ROS production in sea cucumbers held in 6 ℃ and 26 ℃ was dramatically increased from the first day and the fifth day compared with the control group (17 ℃). There were in much more ROS in coelomocytes of the sea cucumbers cultured at salinity of 25 and 35 generations than in the control group, while the same went for sea cucumbers kept at salinity of 16 and 40 on the first day. Low pH also led to dramatically enhancement of the production of ROS during phagocytosis. In conclusion, water temperature, salinity and pH can influenced the production of ROS by the coelomocytes of sea cucumber during phagocytosis. Which lays a foundation for the further study of the physiological and biochemical processes of adaptation of sea cucumber to different environments as well as the innate immune mechanisms in invertebrates.

temperature; salinity; pH; ROS; sea cucumber

S968.9

A

1003-1111(2016)04-0346-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.006

2015-12-14；

2016-02-29.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30471323)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2013278).

李明(1986—)，男，碩士研究生；研究方向：海參免疫. E-mail：153835691@qq.com. 通信作者:盧亞楠(1977—)，女，實(shí)驗(yàn)師，博士；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué). E-mail: luyanan@dlou.edu.cn.