任 洪 濤

( 河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003 )

不同質(zhì)量濃度Zn2+對草魚腦、肝胰臟組織結構及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響

任 洪 濤

( 河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003 )

水溫(20±1) ℃，采用靜水測試法研究了養(yǎng)殖水體中不同質(zhì)量濃度Zn2+(0、9.52、13.14、18.30、25.02、34.53 mg/L)對體質(zhì)量約10 g的草魚腦和肝胰臟的組織結構及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響，探討重金屬的毒性積累和毒性機制。試驗結果表明，Zn2+對草魚的24、48 h和96 h半致死質(zhì)量濃度分別為23.058、19.317、10.155 mg/L，由公式(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和96 h LC50×0.1計算出安全質(zhì)量濃度分別為4.068 mg/L和1.0155 mg/L。中毒初期草魚腦細胞輕微聚集，細胞核微增大；隨時間延長腦異常加重，細胞聚集明顯，核增大幾乎充滿整個腦細胞；肝胰臟細胞膨大，離散，核縮小，胞漿輕微溢出，少數(shù)肝胰臟細胞胞漿溢出，殘留的核物質(zhì)散亂分布，肝胰臟細胞凝固性壞死。隨著Zn2+質(zhì)量濃度的升高和時間延長，草魚肝臟中超氧化物歧化酶活性降低。

草魚；Zn2+；質(zhì)量濃度；組織器官；超氧化物歧化酶

鋅是動物必需的礦物微量元素，具有促進動物生長的作用，大量添加到人工配合飼料中用于集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)，常造成鋅過剩，通過排泄物釋放到土壤和水體中，危害水生動物的健康。Zn2+是鋅對水生生物致毒的主要離子形式，多余的Zn2+能夠與生物體內(nèi)的酶和核酸等生物大分子結合，使水生動物中毒。其毒性大小與環(huán)境的理化因素、受試生物的種類、規(guī)格、生長條件等多種因素有關[1]。草魚(Ctenopharyngodonidellus)作為我國淡水養(yǎng)殖四大家魚之一，也是主要的池塘養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖范圍與面積非常廣，草魚在全國各地的河流、湖泊、水庫中皆有分布。每年的草魚總產(chǎn)量居于所有水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的前列，草魚肉質(zhì)細嫩、個體大、肌間刺少；含有豐富的不飽和脂防酸，營養(yǎng)價值非常高；另外草魚的消化力強，生長快，適應能力強，具有極高的經(jīng)濟和研究價值。目前有關草魚的研究主要集中在營養(yǎng)價值、轉基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，而對于養(yǎng)殖水環(huán)境重金屬污染對草魚毒性效應方面的研究較少。

養(yǎng)殖水環(huán)境中的Zn2+的毒性主要取決于Zn2+在生物體內(nèi)的吸收和積累，所以，研究在一定含量和時間下，Zn2+在草魚組織中吸收、積累的影響，有利于揭示重金屬離子的吸收、積累機制。因此本試驗主要研究了養(yǎng)殖水體中不同質(zhì)量濃度鋅對草魚腦和肝胰臟組織學及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響，以期為研究重金屬的毒性積累和毒性機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用草魚購自洛陽市水產(chǎn)市場，暫養(yǎng)3 d后進行試驗。暫養(yǎng)期間24 h連續(xù)充氣，每日投喂市售商品s飼料1～2次，并及時清理殘餌及糞便等雜物。正式試驗前停食1 d，選取體長8.0～10.0 cm、體質(zhì)量約10 g、體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的個體進行試驗。

試驗在6 L水桶中進行。Zn2+由硫酸鋅(ZnSO4·7H2O，分析純，上?；瘜W試劑總廠生產(chǎn))配制。

1.2 方法

試驗用水為曝氣24 h的自來水，水溫(20±1) ℃，pH 7.0±0.5。試驗期間連續(xù)充氣。每一試驗桶中加入1 L的藥液， 10尾草魚，不投喂也不充氧。死亡標準為腹部朝上、失去游動能力、針刺無反應，死亡個體及時撈出。

1.2.1 預試驗

配制1000 mg/L的硫酸鋅母液，以十倍之差估計系列質(zhì)量濃度0.5、5、50、500、5000 mg/L，每個質(zhì)量濃度組放入5尾草魚，用靜態(tài)方式進行，試驗持續(xù)24 h，每日至少2次記錄各容器內(nèi)死魚數(shù)，及時取出死魚。試驗進行2～3次，找出Zn2+的100%致死質(zhì)量濃度與最小致死質(zhì)量濃度，記錄重金屬離子染毒時，草魚的反應。

1.2.2 正式試驗

(1)采用靜水生物測試法[2]，試驗周期為96 h，根據(jù)預試驗得出的結果，按等比級數(shù)設5個質(zhì)量濃度組(0、9.52、13.14、18.30、25.02、34.53 mg/L)。每個質(zhì)量濃度組設3個平行組，每一個系列設一個空白對照，每組用10尾魚，所有魚在10 min內(nèi)轉移完畢。連續(xù)觀察草魚對Zn2+的行為反應和中毒癥狀，分別于24、48、96 h記錄不同質(zhì)量濃度下死亡的草魚尾數(shù)，統(tǒng)計各Zn2+質(zhì)量濃度下不同時間內(nèi)草魚的死亡率。

(2)根據(jù)各質(zhì)量濃度狀態(tài)下不同時間(24、48、96 h)的死亡率，采用直線回歸法，求出各種毒物的半致死質(zhì)量濃度LC50。再根據(jù)公式SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)和公式SCⅡ=96 h LC50×0.1求出毒物的安全質(zhì)量濃度[3]。

(3)取出死亡草魚肝胰臟和腦組織，一部分放入10%甲醛溶液中固定，用來制作組織切片；另一部分裝入1.5 mL EP管中，做標記，置于冰箱中-20 ℃保存。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)的方法測定肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進行整理；運用SPSS軟件中的單因素方差分析檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 草魚Zn2+中毒的行為癥狀

高質(zhì)量濃度Zn2+組中的草魚短時間內(nèi)就出現(xiàn)明顯中毒癥狀：局促不安、快速游動、亂竄，持續(xù)數(shù)小時后游泳速度逐漸減緩，反應遲鈍，身體失去平衡，與水面成45°角，頭露出水面游動，偶爾躍出水面；隨后，呼吸困難，失去游泳能力，在水中側翻、旋轉，腹部側斜并朝向水面，最后側臥底部不動，僅見鰓蓋微動直至死亡。低質(zhì)量濃度組草魚中毒癥狀出現(xiàn)的比高質(zhì)量濃度組晚，在試驗剛開始的數(shù)小時內(nèi)，魚的行為特征與對照組差異不大，在容器底部緩慢自如地游動，隨著染毒時間的延長逐漸失去活力，胸鰭和腹鰭基部充血，對外界刺激反應遲鈍。臨死前的癥狀與高質(zhì)量濃度組相似。

2.2 Zn2+對草魚的急性毒性

草魚在不同質(zhì)量濃度、不同暴露時間的死亡率見表1。

由表1可知，Zn2+質(zhì)量濃度與草魚的平均死亡率之間呈現(xiàn)明顯的時間效應和劑量效應關系：相同的時間內(nèi)，草魚的死亡率隨著Zn2+質(zhì)量濃度升高而增加；相同質(zhì)量濃度下，草魚的平均死亡率隨著時間的延長而增加。

不同暴露時間下，Zn2+質(zhì)量濃度與草魚死亡概率的線性回歸方程及相應時間下的半致死質(zhì)量濃度、安全質(zhì)量濃度的計算結果見表2。

表1 草魚在不同質(zhì)量濃度Zn2+和暴露時間的死亡率

表2 Zn2+對草魚的急性毒性試驗線性回歸方程、半致死質(zhì)量濃度及安全質(zhì)量濃度

注：y：死亡概率；x：質(zhì)量濃度對數(shù)；n：試驗魚個體數(shù)；r：相關系數(shù)；LC50：半致死質(zhì)量濃度；SC：安全質(zhì)量濃度.

由表2可知，Zn2+對草魚的24、48、96 h 半致死質(zhì)量濃度分別為23.058、19.317、10.155 mg/L；由SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ=96 h LC50×0.1計算出安全質(zhì)量濃度分別為4.068 mg/L和1.0155 mg/L。隨著染毒時間的延長，草魚對Zn2+的敏感性逐漸增強，半致死質(zhì)量濃度值越小毒性越強，即24 h半致死質(zhì)量濃度>48 h半致死質(zhì)量濃度> 96 h半致死質(zhì)量濃度。

2.3 Zn2+對草魚腦和肝胰臟組織結構的影響

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，Zn2+處理的草魚腦細胞出現(xiàn)不同程度的異常(圖1)。

由圖1可見，對照組草魚腦細胞完整，可以清晰地分辨出細胞輪廓，無異常；Zn2+處理24 h時，腦組織輕微異常，腦細胞輕微聚集，細胞核輕微增大；Zn2+處理96 h時，腦組織異常嚴重，腦細胞聚集明顯，細胞核明顯增大，幾乎充滿整個腦細胞。Zn2+誘導自由基介導過程發(fā)生改變，脂質(zhì)過氧化，生物膜被破壞和細胞功能障礙，以上組織病變程度隨處理時間的延長而加深。

Zn2+處理的草魚肝細胞出現(xiàn)不同程度的異常(圖2)。由圖2可見，對照組草魚肝胰臟細胞完整，可以清晰地分辨細胞輪廓，無異常；Zn2+處理24 h時，肝臟細胞結構多不完整，輕微異常，細胞輕微膨大，呈離散狀態(tài)，細胞核相對縮小，胞漿輕微溢出；Zn2+處理96 h時，肝胰臟細胞明顯膨大，無序散程度增大，細胞核明顯相對縮小，少數(shù)肝細胞胞漿完全溢出，殘留的核物質(zhì)散亂分布，肝細胞出現(xiàn)凝固性壞死，正常壁狀結構消失。

圖1 Zn2+對草魚腦組織結構的影響A1：空白對照；A2：Zn2+處理24 h；A3：Zn2+處理96 h，×40.

2.4 Zn2+對草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性的影響

與對照組相比，24 h時，Zn2+質(zhì)量濃度13.14 mg/L處理組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性下降不顯著(P>0.05)，到96 h時，下降顯著(P<0.05)；34.53 mg/L時，24 h和96 h時，草魚肝臟超氧化物歧化酶活性下降顯著(P<0.05)。同一質(zhì)量濃度下，不同時間相比： 24 h和96 h時13.14 mg/L組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)； 34.53 mg/L時，24 h和96 h時,草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)。同一時間，不同質(zhì)量濃度條件相比：24 h時，13.14 mg/L和34.53 mg/L組草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)；96 h，差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

圖3 Zn2+作用下草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性注：圖中標注星號(*)表示相同時間不同質(zhì)量濃度之間的差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 急性毒性試驗

本試驗中，Zn2+質(zhì)量濃度與草魚的平均死亡率之間呈明顯的時間效應和劑量效應關系：相同的時間內(nèi)，草魚的死亡率隨Zn2+質(zhì)量濃度升高而增加；相同質(zhì)量濃度下，草魚的平均死亡率隨時間的延長而增加。Zn2+對草魚的24、48 h和96 h 半致死質(zhì)量濃度分別為23.058、19.317 mg/L和10.155 mg/L，安全質(zhì)量濃度分別為4.068 mg/L和1.0155 mg/L。Zn2+對草魚魚種的毒性隨著染毒時間的延長，草魚對Zn2+的敏感性逐漸增強，半致死質(zhì)量濃度值越小毒性越強，即24 h半致死質(zhì)量濃度>48 h半致死質(zhì)量濃度>96 h半致死質(zhì)量濃度。此結果與侯麗萍等[4]的研究結果和張彩明等[5]對日本黃姑魚(Nibeaalbiflora)和脊尾白蝦(Exopalamoncarincauda)的研究的結果一致。但是，本試驗得出96 h半致死質(zhì)量濃度為10.155 mg/L，這與侯麗萍等[4]研究的Zn2+對草魚96 h半致死質(zhì)量濃度為5.73 mg/L有差異，且與Zn2+對脊尾白蝦[5]96 h半致死質(zhì)量濃度為0.33 mg/L差異也很大，說明不同物種對Zn2+的耐受能力不同。

3.2 Zn2+對草魚腦和肝胰臟組織結構的影響

本試驗結果表明，隨著Zn2+暴露時間的延長，草魚腦和肝胰臟組織的形態(tài)變化和損壞程度加深：腦細胞輕微聚集，細胞核微增大，幾乎充滿整個腦細胞。肝胰臟細胞結構多不完整，細胞輕微膨大，離散，細胞核相對縮小，胞漿輕微溢出，凝固性壞死。此結果與王少博等[6]對草魚研究的結果一致。

3.3 Zn2+對超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶作為保護酶系統(tǒng), 能維持體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，防止自由基的毒害。而逆境條件下，細胞中活性氧往往增多或清除能力減弱，在這種情況下，活性氧清除能力的高低也就成為生物抗逆境能力的大小和能否在逆境中生存的關鍵。本試驗結果表明，把草魚放在含有不同質(zhì)量濃度Zn2+的養(yǎng)殖水體中后，該平衡被打破，體現(xiàn)于超氧化物歧化酶活性隨Zn2+質(zhì)量濃度的提高而下降。

本試驗中，與對照組相比，24 h時，低質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性下降不顯著，96 h時，超氧化物歧化酶活性下降顯著；高質(zhì)量濃度組在24 h和96 h時，超氧化物歧化酶活性下降均顯著。低質(zhì)量濃度組在24～96 h之間，超氧化物歧化酶活性下降依然很顯著，但高質(zhì)量濃度組在24～96 h，超氧化物歧化酶活性下降不顯著。在急性染毒的24 h和48 h期間，較低質(zhì)量濃度的鎘鋅溶液會導致短暫的“毒性興奮效應”，保護機體免受抗氧化損傷。王重剛等[7-8]研究表明，不利因素對魚肝臟超氧化物歧化酶誘導作用，本試驗結果與上述結論相一致。此結果與張迎梅等[9]對泥鰍的研究結果一致。他們認為，Zn2+能抑制泥鰍的超氧化物歧化酶活性，使超氧化物歧化酶活性降低。由于草魚肝胰臟組織超氧化物歧化酶活性的降低程度與水體Zn2+污染水平有一定的關系，這一現(xiàn)象可否用Zn2+作為檢測水體污染的一種生物學指標，還有待進一步深入研究。

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[3] 楊先樂, 周劍光, 葉國安, 等. 魚蟲凈對白鰱及草魚夏花的急性毒性研究[J].水產(chǎn)科技情報，1997, 24(1):13-19.

[4] 侯麗萍, 馬廣智. 鎘與鋅對草魚種的急性毒性和聯(lián)合毒性研究[J]. 淡水漁業(yè), 2002, 32(3):44-46.

[5] 張彩明.幾種常見重金屬對日本黃姑魚和脊尾白蝦的毒性效應研究[D]. 舟山：浙江海洋學院，2013.

[6] 王少博, 王維民, 郭亞楠, 等. 重金屬鎘和鉻對草魚苗的急性和慢性毒性效應[J]. 蘭州大學學報：自然科學版, 2007, 43(4):60-64.

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EffectsofDifferentConcentrationsofZincIononHistologicalStructureofBrainandHepatopancreasandHepatopancreaticSODActivityinGrassCarpCtenopharyngodonidellus

REN Hongtao

( Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003，China )

The influences of different concentrations of zinc ion (Zn2+) (0, 9.52, 13.14, 18.30, 25.02, and 34.53 mg/L) on histological structure of brain and hepatopancreas and superoxide dismutase(SOD) activity in hepatopancreas were studied in grass carpCtenopharyngodonidelluswith body weight of some 10 g at water temperature of(20±1) ℃ by a hydrostatic test to seek for the accumulation and toxicity mechanism of heavy metals. It was found that the LC50of Zn2+to grass carp was 23.058 mg/L in 24 h, 10.155 mg/L in 48 h, and 19.317 mg/L in 96 h, with safe concentration of 4.068 mg/L calculated by formula(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2and 1.0155 mg/L estimated by formula 96 h LC50×0.1. In the early stage of Zn2+poisoning, the grass carp exposed to Zn2+had clustered brain cells with the slightly enlarged nuclei, and as the time elapsed, the brain cells aggregated significantly, and the whole brain cells were almost filled with the nuclei. The hepatopancreas cells were found to be expansion, discrete, nuclear reduction, a slight overflow of the cytoplasm, a small number of liver cell cytoplasm overflow, and residual nuclear material scattered distribution in the grass carp exposed to Zn2+, thus leading to cell necrosis. With the increase in Zn2+concentration and time, the activity of SOD in the hepatopanceas of grass carp was decreased.

Ctenopharyngodonidellus; Zn2+; mass concentration; tissue and organ; SOD

S965.112

A

1003-1111(2016)04-0415-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.018

2015-09-26；

2015-11-24.

河南科技大學博士科研啟動基金資助項目(09001760)；河南科技大學科學研究基金資助項目(2014QN059)；河南科技大學教育教學改革項目(2013Y—003).

任洪濤(1977-)，男，講師，博士；研究方向:水產(chǎn)動物分子生物學.E-mail:hthn2012@163.com.