劉 偉，代應貴，袁振興，孫際佳，劉 麗

( 1. 貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州大學 特種水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025；3. 華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642 )

基于線粒體DNA D-loop的都柳江鲇形目兩種經(jīng)濟魚類種群遺傳多樣性研究

劉 偉1,2，代應貴1,2，袁振興1,2，孫際佳3，劉 麗3

( 1. 貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州大學 特種水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025；3. 華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642 )

以采自貴州都柳江的鲇魚、斑鳠各39尾個體為樣品，采用PCR和DNA測序技術，研究了這兩種魚類線粒體DNA D-loop的結構和種群遺傳多樣性。獲得了鲇魚、斑鳠D-loop 5′端長度分別為544～545 bp、546～547 bp的DNA序列，并分別檢測到58、15個變異位點。同時，識別了該2種魚類D-loop終止序列區(qū)和中央保守區(qū)的核心序列，在中央保守區(qū)之后均有一個Poly-T結構。都柳江鲇魚、斑鳠種群D-loop序列中，分別有51、12個多態(tài)位點，并分別定義了11、8種單倍型。都柳江鲇魚、斑鳠種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)分別為 0.772、0.02301、12.451和0.331、0.00131、0.714。目前，都柳江鲇魚種群遺傳多樣性較為豐富，具有良好的種質(zhì)價值和保護前景; 斑鳠種群遺傳多樣性貧乏，保護和恢復該種群的數(shù)量和遺傳多樣性刻不容緩。

都柳江；鲇魚；斑鳠；D-loop；遺傳多樣性

都柳江屬珠江水系，發(fā)源于貴州獨山縣，流經(jīng)貴州境內(nèi)三都縣、榕江縣和從江縣，全長360 km，為柳江的源流河段[1]。鲇魚(Silurusasotus)、斑鳠(Mystusguttatus)分別隸屬于鲇形目鲇科、鲿科，其中鲇魚廣泛分布于我國各大水系(除青藏高原及新疆外)，斑鳠分布于珠江、元江及錢塘江等水系[2]。這兩種魚類均為我國重要淡水經(jīng)濟魚類，深受當?shù)叵M者喜愛[2-3]。近年來，由于過度的捕撈、壞境污染等因素的影響，這兩種魚類野生資源遭到了一定程度的破壞。為了更好地保護和利用其資源，開展這兩種魚類種群遺傳多樣性研究具有重要意義。近年來，已有國內(nèi)學者分別采用RAPD[4]、Cyt b基因[5]、微衛(wèi)星DNA[6]等分子標記研究了鲇魚不同種群的遺傳多樣性。有關斑鳠種群遺傳多樣的研究報道甚少，僅見陳賽等[7]利用同工酶標記對珠江水系西江斑鳠種群遺傳多樣性的研究。迄今為止，尚無貴州都柳江鲇魚、斑鳠種群遺傳多樣性的研究報道。

在進行物種遺傳分化及遺傳多樣性研究時，DNA序列分析比其他分子標記如RELP、RAPD等更為直接和可靠[8]。線粒體DNA因其具有分子小、結構簡單、多態(tài)性高及母系遺傳等特點而常被用作遺傳多樣性研究的分子標記[9]。線粒體DNA D-loop，又稱線粒體DNA控制區(qū)，是mtDNA的非編碼區(qū)，不受自然選擇壓力的影響，具有較高的突變積累，適用于進行種內(nèi)、種群或個體間遺傳多樣性的研究[10]。本文擬對貴州境內(nèi)都柳江鲇魚、斑鳠種群mtDNA D-loop序列進行測序分析，研究該序列的結構特征和種群遺傳多樣性，以期為開展都柳江鲇形目這兩種經(jīng)濟魚類種質(zhì)資源的利用及保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用鲇魚、斑鳠各39尾鮮活個體，于2014年8月至10月，分別采自貴州都柳江干流上、中、下游的獨山、三都、榕江、從江。每尾活魚取肌肉3～5 g用乙醇固定，帶回實驗室后于冰箱-20 ℃保存，備用。

1.2 DNA模板制備

基因組DNA的提取采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒，并參照其提供的方法提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質(zhì)量和純度，于冰箱-20 ℃儲存、備用。

1.3 D-loop PCR擴增及序列測定

擴增鲇魚、斑鳠D-loop的引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列分別為：D-loop-F: 5′-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′ 和D-loop-R: 5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′[11-12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對測得序列進行Blastn在線同源性檢測，確定序列的邊界及長度，并用SeqMan軟件進行比對，輔以人工校對。采用DnsSP(version 5.10)軟件計算遺傳多樣性參數(shù)。用MEGA 5.0軟件統(tǒng)計序列的堿基含量并用Kimura雙參數(shù)法計算遺傳距離。分別以GenBank中大口鲇(S.meridionalis)mtDNA D-loop同源序列(登錄號：NC_014866.1)、大鰭鳠(M.macropterus)mtDNA D-loop同源序列(登錄號：NC_019592.1)作為外類群，構建都柳江鲇魚、斑鳠種群的鄰接系統(tǒng)樹。采用劉煥章等[13-15]的方法進行鲇魚、斑鳠D-loop的結構分析。

2 結 果

2.1 都柳江鲇魚、斑鳠種群的mtDNA D-loop序列堿基組成及多態(tài)性

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)單向測序，再去除所獲序列測序峰圖中兩端波峰混亂的序列后，得到了都柳江鲇魚、斑鳠各39尾個體mtDNA D-loop 5′端長度分別為544～545 bp、546～547 bp 的DNA序列，用于其各自種群遺傳多樣性的研究。結果顯示，都柳江鲇魚、斑鳠種群D-loop序列堿基組成相似，且均表現(xiàn)為A+T占堿基總數(shù)的比例顯著高于G+C的比例，并均以A所占比例最高、以G所占比例最低，具有明顯的堿基偏倚性(表1)。同時，該兩個種群所獲D-loop序列末端均有一個poly-T結構。

表1 都柳江鲇魚、斑鳠種群mtDNA D-loop堿基組成(n=39) %

都柳江鲇魚種群39尾個體mtDNA D-loop序列長度為544～545 bp，有變異位點58個，變異位點數(shù)占分析序列長度的10.64%～10.66%(表2)。其中，有51個簡約信息位點(含2個簡約信息位點同時存在缺失：206 nt位點為T→C轉(zhuǎn)換同時存在缺失T，536 nt位點為A→T顛換同時存在缺失A)、2個單一變異位點、4個插入位點(135 nt、213 nt、246 nt位點插入A，202 nt位點插入C)和3個缺失位點(177 nt位點缺失A，206 nt位點缺失T，536 nt位點缺失A)?？梢姡撔蛄泄灿?1個多態(tài)位點。同時，該序列含有47個轉(zhuǎn)換位點和7個顛換位點， 其中1 個位點同時存在轉(zhuǎn)換與顛換(244 nt，簡約信息位點：C→T、C→A)，平均轉(zhuǎn)顛換比為6.71。

都柳江斑鳠種群39個個體mtDNA D-loop基因序列長度為546～547 bp，共有15個變異位點，變異位點數(shù)占分析序列長度的2.74%～2.75%(表3)。其中含1個簡約信息位點、11個單一變異位點、2個插入位點(20 nt位點插入A、44 nt位點插入T)和1個缺失位點(52 nt位點缺失C)，共有12個多態(tài)位點。該序列含有11個轉(zhuǎn)換位點和2個顛換位點，其中一個位點同時存在轉(zhuǎn)換和顛換(111 nt，單一變異位點：G→A、G→C)，平均轉(zhuǎn)顛換比約為5.5。

不計插入或缺失位點，都柳江鲇魚、斑鳠種群分別定義了11、8個單倍型(表2、3)。在鲇魚種群11個單倍型中，單倍型1 (Hap_1) 個體數(shù)最多、達18個，為優(yōu)勢單倍型。在斑鳠種群8個單倍型中，單倍型2 (Hap_2)占個體數(shù)最多、達31個，其余單倍型均為一個個體。

表2 都柳江鲇魚種群mtDNA D-loop的多態(tài)位點及單倍型

注: 圓點(.)表示與 Hap_1 相同的堿基.表3同.

表3 都柳江斑鳠種群mtDNA D-loop的多態(tài)位點及單倍型

2.2 都柳江鲇魚、斑鳠mtDNA D-loop的結構

采用劉煥章等[13-15]的方法，識別了都柳江鲇魚、斑鳠D-loop終止序列區(qū)和中央保守區(qū)，但未能識別保守序列區(qū)。

2.2.1 鲇魚mtDNA D-loop的結構

在都柳江鲇魚種群mtDNA D-loop序列中，識別了終止序列區(qū)2個終止相關序列，分別為ETAS1(TACATAATATGCATAA-CTGG，“-”表示發(fā)生變異的堿基，下同)和ETAS2(-ACATATTATGTATAATAT)(圖1)。在終止序列區(qū)共有7個核心序列(TACAT)和1個與核心序列互補的序列(ATGTA)。終止序列區(qū)長度為250～251 bp，含有38個變異位點，變異率為15.14%～15.20%。同時，還識別了中央保守區(qū)的CSB-F、CSB-E、CSB-D等核心序列，分別為ATGTTTAGTAGTGAGAGACCATCAACC、TCAGGGACAAAACTTGTGGGGGT、TATTACTGGCATC

TGGTTCCTATTTCA，其中CSB-E包含GTGGG-box。中央保守區(qū)序列長251～252 bp，含17個變異位點，變異率為6.75%～6.77%。在CSB-D后有一個poly-T結構(TATTTTTTTTTTT)。

2.2.2 斑鳠mtDNA D-loop的結構

在都柳江斑鳠mtDNA D-loop序列中，識別了終止序列區(qū)(ETAS)1個終止相關序列：TACATAATATGTATAATAT(圖2)。在終止序列區(qū)，有6個核心序列(TACAT)和1個與其反向互補的序列(ATGTA)。終止序列區(qū)長232～233 bp，共有9個變異位點，變異率3.86%～3.88%。此外，還識別了中央保守區(qū)3個核心序列，即CSB-F(ATGTAGTAAGAAACCAGCAACCCTCAATA)、CSB-E(TCAGGGACAA-AATTGTGAGGGTT)、CSB-D(TATTACTGGCATCTGGTTCCTAT)。中央保守區(qū)序列長度為252 bp，含有6個變異位點，變異率2.38%。在CSB-D后也存在一個poly-T結構(TATTTTTTTTTTTT)。

圖1 都柳江鲇魚mtDNA D-loop部分序列

圖2 都柳江斑鳠mtDNA D-loop部分序列

2.3 都柳江鲇魚、斑鳠種群的遺傳多樣性及種群遺傳結構

用DnaSP 5.10軟件對都柳江鲇魚、斑鳠種群mtDNA D-loop的遺傳多樣性進行了分析。結果表明，鲇魚種群各項遺傳多樣性指數(shù)均明顯高于斑鳠種群(表4)。

表4 都柳江鲇魚、斑鳠種群mtDNA遺傳多樣性指數(shù)

應用MEGA 5.0 軟件的Kimura 雙參數(shù)模型計算都柳江鲇魚、斑鳠種群單倍型之間的遺傳距離。結果顯示，鲇魚種群11個單倍型之間的遺傳距離為0.0019～0.0837，平均遺傳距離為0.0343；斑鳠種群8個單倍型之間的遺傳距離為0.0018～0.0167，平均遺傳距離為0.0063?？梢?，鲇魚種群單倍型之間的平均遺傳距離明顯大于斑鳠種群。

構建的鄰接系統(tǒng)樹表明，鲇魚11個單倍型聚為兩分支(Gp1和Gp2)，其中Gp1包括9個單倍型，置信值為99，代表34個個體，為優(yōu)勢分支;Gp2包括2個單倍型，代表5個個體，該分支置信值高達100(圖3)。2個分支間平均遺傳距離為0.0745。斑鳠8個單倍型分為兩支，其中一支由7個單倍型組成，代表38個個體，置信值為82；另一支僅1個單倍型Hap_8，代表一個個體(圖4)。

圖3 基于都柳江鲇魚種群mtDNA單倍型間遺傳距離構建的鄰接系統(tǒng)樹注：分支處的數(shù)字為Bootstrap值，重復次數(shù)為1000次；Hap_1～Hap_11代表不同的單倍型.

圖4 基于都柳江斑鳠種群mtDNA單倍型間遺傳距離構建的鄰接系統(tǒng)樹注：分支處的數(shù)字為Bootstrap值，重復次數(shù)為1000次；Hap_1～Hap_8代表不同的單倍型.

3 討 論

3.1 都柳江鲇魚、斑鳠種群mtDNA D-loop的序列變異

線粒體DNA D-loop區(qū)為非編碼區(qū)，不受自然選擇壓力的影響，存在較多的突變?nèi)鐗A基替換、缺失、插入及串聯(lián)重復等，是mtDNA中變異最多的區(qū)域[16]。本研究測定了都柳江鲇魚種群、斑鳠種群mtDNA D-loop部分序列，分別存在58、15個變異位點，變異類型包括堿基替換、插入和缺失，并存在同一位點同時發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換、缺失和轉(zhuǎn)換或缺失和顛換的現(xiàn)象。都柳江鲇魚、斑鳠種群D-loop堿基轉(zhuǎn)顛換比值分別為6.71、5.5，轉(zhuǎn)換頻率均大于顛換頻率，這與脊椎動物DNA中發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率通常高于顛換的規(guī)律[17]相符。

3.2 都柳江鲇魚、斑鳠mtDNA D-loop的結構

魚類mtDNA D-loop區(qū)結構較為復雜，一般可分為3個區(qū)域：終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)[14]。本研究識別了都柳江鲇魚、斑鳠種群D-loop的終止序列區(qū)和中央保守區(qū)的3個核心序列(CSB-F、CSB-E、CSB-D)。與GenBank中鲇魚(登錄號：JX256247.1)、斑鳠(登錄號：NC_023976.1)mtDNA D-loop全序列的比對表明，本研究中鲇魚、斑鳠D-loop保守序列均應在其各自所獲序列末端poly-T結構之后而已被去除，因而未能識別出其各自的保守序列。

都柳江鲇魚、斑鳠種群D-loop終止序列區(qū)堿基變異率均高于其各自中央保守區(qū)的堿基變異率，可見終止序列區(qū)表現(xiàn)了較高的變異性。此外，本研究還識別了都柳江鲇魚種群D-loop終止序列區(qū)的2個終止相關序列——ETAS1、ETAS2。同樣，朱世華等[15, 18]在鲹科魚類和斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)控制區(qū)中也發(fā)現(xiàn)了2個ETAS序列。當魚類mtDNA D-loop中存在多個終止相關序列時，劉煥章等[13]認為其中只有1個ETAS可行使功能，而其他ETAS只是復制的結果，不行使功能。都柳江斑鳠種群D-loop僅識別了1個ETAS，其核心識別序列與鳑鲏亞科魚類[13]、鲿科魚類[14]略有不同，與同屬的大鰭鳠[19]則差異較大。此外，還識別了鲇魚、斑鳠中央保守區(qū)3個核心序列(CSB-F、CSB-E、CSB-D)。其中，除鲇魚的CSB-F與鲿科魚類差異較大外，其他核心序列則與鲿科魚類基本一致[13]。本研究中，在鲇魚、斑鳠D-loop區(qū)CSB-D后均存在一個poly-T結構(TATTTTTTTTTTT)，在中國野生香魚(Plecoglossusaltivelis)[20]、大鰭鳠[21]和大口(Psettodeserumel)[22]中也發(fā)現(xiàn)了類似的結構，其功能尚不清楚，還有待研究。

3.3 都柳江鲇魚、斑鳠種群的遺傳多樣性

本研究基于mtDNA D-loop序列，選取多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)等5個參數(shù)研究了都柳江鲇魚、斑鳠種群的遺傳多樣性。其中，單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)是衡量一個種群遺傳多樣性高低的2個重要指標。由于核苷酸多樣性指數(shù)考慮了各單倍型在群體中所占的比例，因而較單倍型多樣性指數(shù)更為可靠[23]。本研究測定了都柳江鲇魚、斑鳠各39個個體mtDNA的D-loop序列，分別定義了11和8個單倍型。都柳江鲇魚種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.772、0.02301，而斑鳠種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.331、0.00131?？梢姡剂郁~種群遺傳多樣性高于斑鳠種群。

都柳江鲇魚種群單倍型多樣性指數(shù)略低于長江水系、珠江水系和黑龍江水系8個草魚(Ctenopharyngodonidella)野生群體[24]、長江中游5個青魚(Mylopharyngodonpiceus)群體[25]、長江中游湖泊黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)群體[26]，但其核苷酸多樣性指數(shù)均高于上述3種魚類群體。而都柳江斑鳠種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)均低于上述3種魚類群體。此外，都柳江鲇魚種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)均顯著高于同分布于都柳江的易危魚類小口白甲魚(Onychostomalini)種群[27]，而都柳江斑鳠種群單倍型多樣性指數(shù)略高于都柳江小口白甲魚種群但核苷酸多樣性指數(shù)則低于都柳江小口白甲魚種群。因此，目前都柳江鲇魚種群尚保存著較豐富的遺傳多樣性，而斑鳠種群遺傳多樣性則較為貧乏。鲇魚、斑鳠均為我國的名優(yōu)淡水經(jīng)濟魚類，其中鲇魚還為我國重要的養(yǎng)殖魚類，斑鳠為極具馴養(yǎng)開發(fā)價值的野生魚類。都柳江鲇魚種群較高的遺傳多樣性，表明該種群具有良好的種質(zhì)價值和較好的保護前景。都柳江斑鳠種群目前遺傳多樣性貧乏，保護和恢復該種群的數(shù)量和遺傳多樣性刻不容緩。

Grant等[28]認為，可以根據(jù)種群單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)值推測該種群的歷史，即單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)較高的種群可能由一個大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過長時間演化所產(chǎn)生或由兩個不同系群的種群二次接觸所形成，而單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)較低的種群最近可能發(fā)生了瓶頸效應或奠基者效應。都柳江鲇魚種群較高的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)，這表明該種群可能源于大而穩(wěn)定的種群并且目前仍維持著較高的遺傳多樣性。斑鳠為西江“四大名魚”之一[3]，經(jīng)濟價值高，近年來因過度捕撈導致其種群數(shù)量急劇減少，進而降低了都柳江斑鳠種群單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)，推測該種群近期可能發(fā)生了瓶頸效應。

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GeneticDiversityof2EconomicallyImportantFishesinSiluriformesfromDuliuRiverBasedonmtDNAD-loopSequences

LIU Wei1, 2, DAI Yinggui1, 2, YUAN Zhenxing1, 2,SUN Jijia3, LIU Li3

( 1. College of Animal Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Special Fisheries Research Institute, Guizhou University, Guiyang 550025,China;3. College of Animal Sciences, Agricultural University of South China, Guangzhou 510642, China )

The composition of mtDNA D-loop and genetic diversity were studied in 39 individuals of catfishesSilurusasotusandMystusguttatuscollected in the Guizhou section of Duliu River by the methods of PCR and DNA sequencing on the basis of sequences of mtDNA D-loop.There were 544—545 bp and 546—547 bp of D-loop sequences near the 5′ end of D-loop, including 58 variable loci inS.asotusand 15 variable loci inM.guttatus. The characteristic sequences were identified in the extended termination associated sequence and the central conserved domain and a poly-T next to the 3′ end of central conserved domain in the D-loop sequence in each of the two species.There were 51 and 12 polymorphic loci and 11 and 8 haplotypes in the populations ofS.asotusandM.guttatus, respectively.S.Asotushad haploidtype diversity of 0.772,nucleotide diversity of 0.02301,and average nucleotide differences of 12.451, andM.guttatushad haploidtype diversity of 0.331,nucleotide diversity of 0.00131,and verage nucleotide differences of 0.714 .The population ofS.asotusfrom the Duliu River showed abundant genetic diversity,good germplasm value and protection outlook. While the population ofM.guttatushad much low genetic diversity in the Duliu River. Therefore,it is urgent to protect and recover the genetic diversity ofM.guttatuspopulation from the Duliu River.

Duliu River;Silurusasotus;Mystusguttatus; D-loop; genetic diversity

S917

A

1003-1111(2016)04-0386-07

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.013

2015-09-11；

2016-01-12.

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303048);貴州省留學人員科技活動項目[黔人項目資助合同(2013)10].

劉偉(1992—)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種與種質(zhì)資源學.E-mail: 892913900@qq.com.通訊作者：代應貴(1968—)，男，教授；研究方向：魚類學、漁業(yè)資源與環(huán)境.E-mail: daiygui@163.com.