楊杰青，沈新強，蔣 玫，李 磊，徐夏芳，董 冉

( 1. 中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090； 2. 上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306； 3. 國家海洋局 寧波海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，浙江 寧波 315012 )

鹽度、pH對文蛤肌肉、鰓、外套膜HSP70基因表達的影響

楊杰青1,2，沈新強1，蔣 玫1，李 磊1，徐夏芳3，董 冉1,2

( 1. 中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090； 2. 上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306； 3. 國家海洋局 寧波海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，浙江 寧波 315012 )

為探討池塘養(yǎng)殖文蛤的適宜鹽度和pH范圍，以β-actin為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術，檢測不同鹽度(16、18、20、22、24)和pH(6.7、7.7、8.7、9.7、10.7)梯度下文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，鹽度16、18、22、24處理組肌肉中HSP70基因的表達量顯著高于鹽度20的對照組(P<0.05)；除鹽度18組鰓和鹽度24組外套膜HSP70基因的表達量與對照組差異不顯著外(P>0.05)，16、18、22、24鹽度組鰓和外套膜中HSP70基因的表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。pH 6.7、7.7、9.7、10.7處理組肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達量與pH為8.7的對照組差異顯著(P<0.05)。試驗結(jié)果表明，超出一定鹽度、pH范圍，可顯著誘導文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的過量表達，研究結(jié)果可為池塘文蛤的健康養(yǎng)殖提供參考。

文蛤；環(huán)境因子；肌肉；鰓；外套膜；HSP70

文蛤(Meretrixmeretrix)隸屬于真瓣鰓目、簾蛤科、文蛤?qū)伲俏覈睾５貐^(qū)經(jīng)濟價值較高的一種貝類[1-2]。其生長受環(huán)境因子變化影響較為顯著[3-4]，鹽度、pH等作為決定濾食性貝類生存與分布的主要環(huán)境因子[5]，對池塘文蛤的健康養(yǎng)殖尤為重要，但受自然或人為活動影響，其波動也較為明顯，如連續(xù)暴雨天氣、池塘自身消毒投放過多的漂白粉、繁殖餌料生物以及養(yǎng)殖過程中不合理的投放藥物等。養(yǎng)殖過程中合理控制環(huán)境因子變化范圍，有利于文蛤快速生長。

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)又稱熱應激蛋白，廣泛存在于從低等原核生物到高等哺乳動物細胞內(nèi)且含量豐富的多肽類蛋白家族[6-8]，是細胞或生物體受外界環(huán)境因子(高溫、毒素、缺氧、重金屬、有機物污染等)刺激后，產(chǎn)生的一類具有高度保守性和應激性并由熱休克基因所編碼的伴隨性細胞蛋白[9-12]。HSP70是熱休克蛋白家族中最保守、最重要、細胞內(nèi)含量最豐富的一種，它能夠使細胞或生物體從各種應激狀態(tài)下自我恢復，改善細胞的生存能力和提高對環(huán)境脅迫的耐受性[13]，因此通過檢測生物體內(nèi)HSP70基因的表達情況便可預知其生長環(huán)境的適宜程度。作為“分子伴侶”其在蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運、降解及調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而且它在細胞周期調(diào)控、抗凋亡、抗氧化、免疫治療等方面也具有重要功能[6,10,14-15]，HSP70是國內(nèi)外學者研究的熱點。

迄今，關于環(huán)境因子脅迫對蝦類[16-18]、蟹類[19]、貝類[20-22]、魚類[23]等水生生物的HSP70基因表達已有諸多報道，鹽度能夠影響馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)外套膜HSP70基因的過量表達[24]；高鹽度刺激可致合浦珠母貝(P.fucata)肌肉、鰓、外套膜等組織內(nèi)HSP70基因的表達量明顯增加[25]； pH可以引起脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)肝胰腺和肌肉中HSP70基因的高表達[16]。研究涉及的貝類雖多，但至今尚未見有關鹽度和pH變化對文蛤HSP70基因表達的研究。研究鹽度、pH的變化對文蛤HSP70基因表達的影響在闡明熱休克蛋白調(diào)控機理及文蛤的實際生產(chǎn)應用中具有重要指導意義。

本研究采用室內(nèi)試驗的形式，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應對不同鹽度、pH梯度下文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因表達量進行測定，旨在了解鹽度、pH的波動變化對文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因表達量的影響，研究可為池塘養(yǎng)殖文蛤健康的生長提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源及馴養(yǎng)

試驗所用文蛤取自江蘇啟東外海灘涂，選擇個體規(guī)格相近、外表完好、有活力的文蛤100枚，平均殼長(3.0±0.7) cm、平均殼寬(3.0±0.5) cm、全質(zhì)量(8.00±1.70) g、鮮肉質(zhì)量(3.50±1.00) g。試驗前馴養(yǎng)7 d，所用海水為經(jīng)沙濾后的天然海水，海水pH 8.7，鹽度20，溫度18～19 ℃，全量日換水一次，并投喂小球藻(Chlorellavulgaris)。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽度試驗

針對池塘養(yǎng)殖過程中，可能出現(xiàn)的連續(xù)雨水天氣導致鹽度偏低的突發(fā)狀況，同時依據(jù)相關研究結(jié)果[26-27]，設置5個鹽度試驗梯度，依次為16、18、20、22、24，各鹽度分3個平行組，對照組鹽度為20，試驗于2 L燒杯內(nèi)進行，鹽度配比采用經(jīng)曝氣的自來水和粗鹽調(diào)節(jié)天然海水得到所需的鹽度值，每日鹽度升降不超過1，試驗溶液pH8.7，溫度為18～19 ℃，自然光照。試驗開始2 h后，分別采集2枚文蛤的肌肉、鰓、外套膜組織加RNA保存液固定并迅速保存于-20 ℃冰箱，以備HSP70表達量的檢測。

1.2.2 pH試驗

針對池塘養(yǎng)殖過程中，繁殖餌料生物和底質(zhì)消毒投放大量化肥和漂白粉導致pH波動較大的突發(fā)狀況，同時依據(jù)相關研究結(jié)果[26，28]，設置5個梯度的pH試驗組，依次為6.7、7.7、8.7、9.7、10.7，各pH梯度分3個平行組，對照組pH為8.7，試驗于2 L燒杯內(nèi)分別采用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)過濾天然海水的pH值，并用pH計(HANNA HI98127型)進行校準。各梯度pH變化幅度為±0.2，每日pH升降不超過1，保持各試驗溶液鹽度為20，其他試驗條件和試驗步驟同上述鹽度試驗組。

1.2.3 HSP70基因表達水平的檢測

1.2.3.1 引物的設計

β-actin在細胞中表達量相對恒定，受外界的刺激影響很小[29]，因此以β-actin為內(nèi)參基因。根據(jù)試驗自文蛤肌肉、鰓、外套膜克隆分別獲得HSP70基因序列以及β-actin基因。并按照實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物設計要求獲取文蛤HSP70基因cDNA序列實際熒光定量檢測引物(表1)。

表1 熒光定量PCR分析基因表達所用的引物

1.2.3.2 總RNA的提取

按Trizol操作說明書提取RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量與完整性。用核酸蛋白測定儀測定RNA樣品的濃度和純度。

1.2.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測HSP70基因表達

以提取的文蛤總RNA為模板，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)的說明合成cDNA。SYBR Green Ⅰ燃料法對目的基因進行相對定量，反應體系為20 μL：2×PowerSYBRRGreen PCR MasterMix(Applied Bio-system)10 μL，10 μmol/L上下引物各加1 μL，模板為0.5 ng的總RNA逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 2 μL，用滅菌雙蒸水定量至20 μL。每個時間點各處理組分別做3～4個平行樣，每個樣品再分別平行做3個重復。以總cDNA為模板，用β-action、HSP70基因引物和Taq DNA聚合酶進行PCR反應。Real-timePCR反應條件為94 ℃ 3 min，40個循環(huán)：94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s。反應結(jié)束后對該反應體系做溶解曲線，分析聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的特異性。所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。基于2-ΔΔCT原理[30]進行目的基因相對表達量的分析。

1.3 試驗數(shù)據(jù)的處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0做數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析，P<0.05作為差異顯著，利用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達

鹽度對文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因表達量見圖1。鹽度16、18、22、24處理組肌肉中HSP70基因的表達量顯著高于鹽度20的對照組(P<0.05)；除鹽度18處理組鰓中HSP70基因的表達量與對照組差異不顯著外(P>0.05)，鹽度16、22、24處理組鰓中HSP70基因的表達量均顯著高于鹽度20的對照組(P<0.05)；外套膜中HSP70基因的表達量，鹽度24處理組與對照組相比差異并不顯著(P>0.05)，但鹽度16、18、22處理組HSP70基因的表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。鹽度16處理組鰓和外套膜中HSP70基因的表達量顯著高于鹽度18處理組(P<0.05)，但肌肉中HSP70基因的表達量顯著低于鹽度18處理組(P<0.05)。鹽度24處理組文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達量均顯著低于鹽度22處理組(P<0.05)。整體上鹽度24處理組各組織中HSP70基因表達量相對低于鹽度16、18處理組。

圖1 不同鹽度下文蛤HSP70基因相對表達量

2.2 pH對文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達

pH對文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達量見圖2。pH 6.7、7.7、9.7、10.7處理組肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達量與pH8.7的對照組差異顯著(P<0.05)。其中pH 6.7、7.7、9.7、10.7處理組鰓和外套膜中HSP70基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05)；pH 6.7、7.7、9.7處理組肌肉中HSP70基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而pH 10.7處理組顯著低于對照組(P<0.05)。pH 6.7處理組肌肉、鰓中HSP70基因的表達量雖顯著低于pH 7.7處理組(P<0.05)，但仍顯著高于對照組(P<0.05)；pH10.7處理組肌肉中HSP70基因的表達量顯著低于pH 9.7處理組(P<0.05)，pH 10.7處理組鰓中HSP70基因的表達量與pH 9.7處理組差異不顯著(P>0.05)。外套膜中pH 6.7處理組HSP70基因的表達量顯著高于7.7處理組(P<0.05)，pH 10.7處理組顯著高于9.7處理組(P<0.05)。

圖2 不同pH下文蛤HSP70基因相對表達量

3 討 論

HSP70作為細胞受外界應激作用后最早出現(xiàn)的保護蛋白，可以保護機體不受或少受傷害，并具有恢復變性蛋白和清除永久變性蛋白的作用[13]。作為水生生物生長過程中較為重要的環(huán)境因子，鹽度的改變迫使生物體通過合成一些大分子物質(zhì)來調(diào)節(jié)滲透壓，以此來穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)和功能[29]。本試驗結(jié)果顯示，相比于鹽度20的對照組，鹽度發(fā)生改變后，整體上文蛤肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達量均有所增加。鹽度脅迫誘導機體HSP70基因表達量的升高，在馬氏珠母貝[24]、合浦珠母貝[25]、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)[9]等研究中也取得了一致結(jié)果。

但與部分研究之間亦存在一定差異性，如仿刺參(Apostichopusjaponicus)[31]隨鹽度的逐漸降低和升高，體壁組織中HSP70基因的表達水平逐漸升高。而本研究各組織中HSP70基因的表達量并不隨鹽度持續(xù)下降或上升而逐漸升高，如肌肉中HSP70基因表達情況，鹽度16處理組顯著低于鹽度18處理組(P<0.05)，鹽度24處理組顯著低于鹽度22處理組(P<0.05)，鹽度24處理組肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因表達量均顯著低于鹽度22處理組(P<0.05)。首先這可能由于脅迫時間、受試生物的不同。受脅迫時間的影響，熱休克蛋白基因的表達量一般呈先升后降的變化趨勢。如0～48 h內(nèi)羅非魚(Oreochremis)肌肉、鰓、垂體和腎中HSP70基因的表達量整體上呈先升后降的變化趨勢[32]。本研究中高鹽度(24)和低鹽度(16)處理組的文蛤受鹽度變化脅迫時間相對大于鹽度18、22處理組，采樣檢測時其表達量可能正處于下降階段。但究竟多長時間后表達量達到峰值，或從何時開始表達量呈下降趨勢，這也是本研究存在的不足之處，仍需對此做深入探討。其次，文蛤長時間處于過高或過低鹽度條件下，機體受到一定應激損傷，變性蛋白迅速增加，修復變性蛋白[33]的同時其表達量有所下降。再者，HSP70的表達受到負反饋調(diào)控[34-35]，即鹽度應激初期機體出現(xiàn)高含量HSP70，因轉(zhuǎn)錄水平需熱激轉(zhuǎn)錄因子與熱激元件共同參與，高含量的HSP70會與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的蛋白熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，減少了熱激轉(zhuǎn)錄因子與熱激元件的特異性結(jié)合，控制了熱休克基因的進一步轉(zhuǎn)錄，但隨著應激時間的延長，部分組織受應激損傷限制，導致HSP70基因表達量表現(xiàn)出相對不高的特征。

另外，鹽度18處理組肌肉和外套膜中HSP70基因的表達量顯著高于鹽度20處理組(P<0.05)，而對于鰓中HSP70基因表達量與鹽度20處理組差異并不顯著(P>0.05)。這可能與不同組織中HSP70基因表達量的增加幅度、表達量的多少及表達量達峰值時間的不同有關，如鹽度22條件下，羅非魚[32]垂體中HSP70基因表達量在0～48 h內(nèi)持續(xù)緩慢增加，48 h達峰值；而肌肉中表達量迅速升高，于24 h達峰值，且其達峰值的表達量顯著高于垂體。另外也可能因文蛤喜歡生長有淡水注入的內(nèi)灣或河口[1]，因此對相對低鹽度水體的抗脅迫能力優(yōu)于高鹽度，鹽度18仍是處于文蛤適宜生長可接受范圍內(nèi)。從另一角度看，高鹽度(24)各組織中HSP70表達量相對低于低鹽度組(16、18)，這也同樣說明文蛤?qū)Φ望}度水體的抗脅迫能力高于高鹽度，姚國興等[4]研究也證實了小規(guī)格文蛤?qū)Φ望}度海水忍耐性較強。

pH作為另一重要環(huán)境因子對貝類生長具有重要作用，多種因素可導致池塘水體中pH的波動變化，例如連續(xù)性降雨、繁殖餌料生物、池塘底質(zhì)消毒及浮游植物優(yōu)勢種的突然改變等。生物受應急刺激(重金屬、缺氧、高溫、有機污染等)可誘導體細胞合成熱休克蛋白來保護機體免受傷害[36-37]，其中pH的誘導致使生物體中熱休克蛋白表達量顯著增加,在其他生物中也得到一致結(jié)果，如韓俊英等[16,38]的研究表明，pH低于或高于對照組水平，脊尾白蝦和中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肌肉、肝胰腺組織中HSP70基因表達量均顯著高于對照組。本試驗結(jié)果顯示，整體上文蛤受pH脅迫作用后，其肌肉、鰓、外套膜中HSP70基因的表達量顯著增加(P<0.05)。

但與其他研究不同之處在于，超出機體所承受的pH范圍后部分組織中HSP70基因表達量呈下降趨勢。如pH 6.7處理組文蛤肌肉和鰓中HSP70基因的表達量顯著低于pH 7.7處理組(P<0.05)，pH 10.7處理組肌肉中HSP70基因的表達量顯著低于9.7處理組和對照組(P<0.05)。主要因pH 6.7處理組與pH 7.7處理組、pH 8.7處理組相比，水體性質(zhì)發(fā)生了改變，并且pH過低超出了文蛤適宜生活范圍，一般文蛤最適生長pH為7.8～8.6[28]，暴露于酸性條件下肌肉和鰓受到一定的應激損傷，而外套膜抗脅迫能力較強[39]，肌肉和鰓中變性蛋白或永久性變性蛋白快速增加，HSP70修復變性蛋白和清除永久性變性蛋白的同時受應激損傷限制其表達量下降。pH過高(10.7)也超出了文蛤適宜生活范圍，可能因pH過高造成機體有氧代謝異常，過量的活性氧引起機體氧化損傷[40-41]，嚴重時能引起細胞凋亡或壞死，機體抗氧化能力明顯降低，文蛤的肌肉關系到貝殼的張開和關閉，過高的pH引起肌肉氧化損傷，導致pH 10.7處理組中肌肉中HSP70基因的表達水平較對照組低。

另外，pH 10.7處理組肌肉和鰓中HSP70基因的表達量顯著低于外套膜(P<0.05)，pH 7.7處理組肌肉和鰓中HSP70基因的表達量顯著高于外套膜(P<0.05)?？赡芤驗椴煌慕M織其表達具有差異性，其表達量達峰值的時間不同。如近江牡蠣(Crassostreahongkongensis)鰓中HSP70基因表達量于3 h達峰值，外套膜于6 h達峰值[42]。肌肉和鰓對高pH的刺激其表達量達峰值的時間早于外套膜而導致pH 10.7組肌肉和鰓中HSP70基因的表達量顯著低于外套膜。與pH的改變組織敏感性具有差異也有關，如曲凌云等[22,43]認為，貝類鰓組織較其他組織對水環(huán)境的改變更為敏感，可能因文蛤肌肉和鰓對低pH的波動較外套膜更敏感，而導致pH 7.7處理組肌肉和鰓中HSP70基因的表達量相對高于外套膜。

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EffectsofSalinityandpHonExpressionofHSP70GeneinMuscle,GillandMantleofClamMeretrixmeretrix

YANG Jieqing1,2, SHEN Xinqiang1, JIANG Mei1, LI Lei1, XU Xiafang3, DONG Ran1,2

( 1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；2. College of Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Marine Environmental Monitoring Center of Ningbo, SOA, Ningbo 315012, China )

As the main environmental factors affecting survival and distribution of shellfish, huge changes in salinity and pH bring massive death to clamMeretrixmeretrix. The housekeeping gene β-actin was used as control gene to study the suitable range of salinity and pH in pond clam farming. The transcription changes in HSP70 gene was quantified in muscle, gill and mantle under different salinity(16,18,20,22, and 24) and pH (6.7,7.7,8.7,9.7, and 10.7) by means of real-time fluorescence quantitative RT-PCR method. The results proved that the HSP70 gene was induced significantly in muscle, gill and mantle of the clam by salinity and pH. The expression of HSP70 gene was decreased significantly beyond a certain range of salinity and pH, but it still significantly higher than that in control group. The findings showed that there were significantly higher expression of HSP70 gene in salinity of 16,18,22, and 24 groups than in muscle in the control group of 20(P<0.05).Except in gill in the salinity group of 18 and in mantle in the group of 24, there were no significant difference in the expression of HSP70 gene with the blank group of 20(P>0.05),the salinity group of 16,18,22 and 24 in gill and mantle there were significantly higher the expression of HSP70 gene than that in the blank group of 20(P<0.05). However, the expression of HSP70 gene in the in muscle, gill and mantle in the pH group of 6.7,7.7.9.7 and 10.7 showed a significant difference with that in control group of 8.7(P<0.05).

Meretrixmeretrix; environmental factor;muscle;gill;mantle;HSP70

S968.31

A

1003-1111(2016)04-0398-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.015

2015-10-15；

2015-12-10.

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目(CARS-48).

楊杰青(1990—)，男，碩士研究生；研究方向：漁業(yè)生態(tài)學與環(huán)境保護.E-mail:513118751@qq.com. 通訊作者：沈新強(1951—)，男，研究員；研究方向：漁業(yè)生態(tài)與環(huán)境.E-mail:xinqiang_shen@hotmail.com.