禹 剛,簡麗萍

(1.四川省阿壩州人民醫(yī)院重癥科,四川馬爾康 624000;2.西南醫(yī)科大學(xué),四川瀘州 646000)

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谷氨酰胺對克雷伯桿菌引起的大鼠肺炎炎癥的抑制作用

禹 剛1,簡麗萍2

(1.四川省阿壩州人民醫(yī)院重癥科,四川馬爾康 624000;2.西南醫(yī)科大學(xué),四川瀘州 646000)

目的 探討谷氨酰胺對克雷伯桿菌引起的大鼠肺炎炎癥的抑制作用及機(jī)制。方法 將36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，正常組、模型組、谷氨酰胺組，通過氣管滴入克雷伯桿菌建立大鼠肺炎模型，谷氨酰胺組在造模前1 d即腹腔注射10 mL/kg 谷氨酰胺，正常組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，大鼠脫頸處死，取肺組織及血清進(jìn)行檢測。稱量記錄右肺濕重及干重(W/D)，HE染色檢測肺組織病理形態(tài)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測肺組織勻漿及血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量，RT-PCR檢測核因子-κB(NF-κB)p65和NF-κB抑制蛋白(IκBα)mRNA表達(dá)，Western blot檢測NF-κB p6和IκBα蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，谷氨酰胺組能降低W/D比值[5.98±0.29vs. 4.32±0.33(P<0.05)]，減輕肺組織充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤，改善肺組織形態(tài)，抑制血清和肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌(P<0.05)，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平(P<0.05)。結(jié)論 谷氨酰胺能抑制克雷伯桿菌引起的大鼠肺炎炎癥，與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

谷氨酰胺；克雷伯菌，肺炎；肺炎；炎癥；NF-κB信號通路

肺炎(pneumonia)是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由微生物、理化因素等造成，其中細(xì)菌性肺炎是最常見的肺炎，也是最常見的感染性疾病之一。肺炎克雷伯桿菌是細(xì)菌性肺炎最常見的革蘭陰性條件致病菌，是新生兒和嬰兒醫(yī)院獲得性肺炎的常見致病菌，常危及新生兒生命[1]。肺部感染時(shí)產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，從而加重炎癥癥狀。且核因子-κB(NF-κB) p65和IκBα在呼吸道炎癥中具有關(guān)鍵作用，已成為治療肺炎藥物開發(fā)的潛在靶點(diǎn)[2-3]。谷氨酰胺是體內(nèi)含量最為豐富的氨基酸，能在細(xì)胞信號水平抑制機(jī)體的過度炎性反應(yīng)，對細(xì)胞、器官和機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用[4-5]。如谷氨酰胺能改善銅綠假單胞菌引起的大鼠肺部感染[6]，能抑制慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血NF-κB活性[7]，并降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平[8]，從而達(dá)到抗炎作用。說明谷氨酰胺可能通過抑制NF-κB活性來治療肺炎。因此，本研究通過克雷伯桿菌誘導(dǎo)大鼠肺炎，探討谷氨酰胺是否通過NF-κB信號通路抑制炎癥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 (200±20)g的SD雄性大鼠36只，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，室內(nèi)溫度控制為(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2 儀器與試劑 力肽每100 mL含谷氨酰胺活性成分13.46 g(德國費(fèi)森尤斯公司)；BCA法蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)研究所)；TNF-α，IL-1β，IL-6 ELISA檢測試劑盒(美國RB公司分裝)；兔抗p65，pp65，IκBα，p-IκBα單克隆抗體(Epitmics公司)；電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)。肺炎克雷伯桿菌(KP03813)購自重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，在瓊脂平皿中培養(yǎng)，16～18 h后稀釋配制成細(xì)菌混懸液，并通過比濁儀調(diào)節(jié)混懸液濃度，使其最終濃度為1.5×109cfu/mL備用。

1.3 肺炎大鼠模型建立及分組 將36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，正常組、模型組、谷氨酰胺組，谷氨酰胺組在造模前1 d即腹腔注射10 mL/kg 谷氨酰胺，正常組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，大鼠脫頸處死，取肺組織及血清進(jìn)行檢測。造模過程如下：10%水合氯醛麻醉大鼠后，頸部備皮消毒，無菌操作，切開頸部皮膚，暴露大鼠上段氣管，用1 mL注射器經(jīng)氣管滴入0.15 mL菌液，正常組滴入等量的生理鹽水后立即豎立大鼠于固定臺，使大鼠保持直立位約1 min，以保證接種菌液因重力作用而入肺[9]。

1.4 肺濕重/干重比值(W/D) 取右肺中葉用PBS洗凈，吸水紙吸除水分，稱得濕重(W)，在80 ℃溫箱干燥，48 h后再稱干重(D)，求得W/D。

1.5 HE染色 肺組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，抗原修復(fù)，室溫冷卻30 min，PBS沖洗2次，一抗室溫孵育，PBS沖洗2次，二抗(1∶100)37 ℃孵育，PBS洗滌2次，DAB溶液顯色后沖洗、復(fù)染、脫水、透明、樹膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.6 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β及IL-6水平 取20～50 mg右肺中葉于9倍生理鹽水中攪碎，使組織勻漿化，離心收集上清液待測。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測肺組織勻漿及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.7 RT-PCR檢測 總RNA的提取參考trizol試劑盒(Invitrogen)使用說明書，引物設(shè)計(jì)見下表1。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，59 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)。

表1 RT-PCR引物

1.8 Western blot 各組取適量肺組織，按比例加入RIPA(10 μg/mL)裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎制成組織勻漿，將破碎后的組織勻漿放置于冰中30 min，使組織徹底裂解，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，濕法磚膜。一抗孵育，4 ℃過夜；漂洗后二抗室溫孵育1～2 h。漂洗，滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity one軟件對各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺濕重/干重比值(W/D) 正常組、模型組和谷氨酰胺組W/D比值分別為4.08±0.43、5.98±0.29和4.32±0.33，模型組與其他兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

aa：P<0.01，與正常組和谷氨酰胺組比較。

圖1 各組肺濕重/干重比值(W/D)

2.2 各組肺組織病理形態(tài) 正常組中肺泡腔充氣良好，無紅細(xì)胞滲出；模型組中肺組織充血水腫，炎性細(xì)胞因子浸潤，肺泡腔有紅細(xì)胞；谷氨酰胺組中肺組織輕度水腫，炎性細(xì)胞浸潤程度較輕，見圖2。

A：正常組，B：模型組，C：谷氨酰胺組。

圖2 各組肺組織病理形態(tài)

2.3 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β及IL-6含量 與正常組比較，模型組中TNF-α、IL-1β及IL-6含量顯著提高(P<0.01)。與模型組比較，谷氨酰胺組中TNF-α、IL-1β及IL-6含量顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β及IL-6含量

*：P<0.01，與正常組和谷氨酰胺組比較。

2.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量 模型組中TNF-α、IL-1β及IL-6含量顯著高于正常組(P<0.01)。谷氨酰胺組與模型組相比TNF-α、IL-1β及IL-6含量顯著下降(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量

*：P<0.01，與正常組和谷氨酰胺組比較。

2.5 各組大鼠血清中NF-κB 信號通路mRNA的表達(dá) 與正常組比較，模型組中pp65及p-IκBα mRNA表達(dá)量上升(P<0.01)；與模型組比較，谷氨酰胺組中pp65及p-IκBα mRNA表達(dá)量降低(P<0.01)，見圖3。

aa：P<0.01，與正常組和谷氨酰胺組比較。

圖3 各組大鼠血清中NF-κB 信號通路mRNA的表達(dá)

2.6 各組大鼠血清中NF-κB信號通路蛋白的表達(dá) 與正常組比較，模型組中pp65及p-IκBα 蛋白表達(dá)量上升(P<0.01)；與模型組比較，谷氨酰胺組中pp65及p-IκBα mRNA表達(dá)量降低(P<0.01)，見圖4。

aa：P<0.01，與正常組和谷氨酰胺組比較。

圖4 各組大鼠血清中NF-κB 信號通路蛋白的表達(dá)

3 討 論

克雷伯桿菌是最常見的革蘭陰性條件致病菌。當(dāng)克雷伯桿菌等細(xì)菌抵達(dá)下呼吸道，會引起肺泡毛細(xì)血管充血，水腫，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞滲出及炎性細(xì)胞浸潤等癥狀，因此本研究通過氣道滴入克雷伯桿菌構(gòu)建大鼠肺炎模型，經(jīng)病理學(xué)檢測結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致，證實(shí)模型構(gòu)建成功。谷氨酰胺可以減輕內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥[10]，本研究也證實(shí)谷氨酰胺的干預(yù)能一定程度上緩解肺水腫、充血及炎癥浸潤。

谷氨酰胺是人體血液中含量最多的氨基酸，但在創(chuàng)傷、感染等情況下，機(jī)體內(nèi)谷氨酰胺水平迅速下降，同時(shí)大量研究證實(shí)補(bǔ)充谷氨酰胺可能有助于抗炎作用。谷氨酰胺能抑制慢性阻塞性肺疾病患者外周血 NF-κB活性[7]，并降低TNF-α含量[8]，從而達(dá)到抗炎作用。谷氨酰胺能抑制內(nèi)毒素血癥Wistar幼鼠腸組織中NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)，并降低TNF-α含量[11-12]。從而提示了谷氨酰胺能夠通過抑制NF-κB信號通路改善各種肺炎癥狀及其他疾病。而NF-κB p65和IκBα在呼吸道炎癥中具有關(guān)鍵作用，已成為治療肺炎藥物開發(fā)的潛在靶點(diǎn)[2-3]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明谷氨酰胺治療組能抑制pp65、p-IκBα蛋白及mRNA的表達(dá)，從而證實(shí)了谷氨酰胺可作為NF-κB信號通路的抑制劑從而抑制肺炎炎癥。而且谷氨酰胺能抑制敗血癥小鼠NF-κB的激活及細(xì)胞因子的表達(dá)，能顯著降低肺中TNF-α和IL-6的表達(dá)[13]。谷氨酰胺能抑制缺血再灌注Wistar大鼠NF-κB及IL-6陽性表達(dá)，從而抑制黏膜損傷，促進(jìn)腸、肺恢復(fù)[14]。說明谷氨酰胺能通過影響NF-κB信號通路活性從而調(diào)節(jié)其下游相關(guān)基因表達(dá)，因此本研究進(jìn)一步探討谷氨酰胺對于大鼠肺炎NF-κB下游炎癥因子的影響。

NF-κB 能特異性結(jié)合于多種基因啟動子或增強(qiáng)子κB 位點(diǎn)，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞中最常見的作用形式為 p65及p50組成的二聚體，在生理?xiàng)l件下或未受刺激時(shí)與 IκB 結(jié)合，在病理?xiàng)l件或受到刺激時(shí)，IκB被降解，磷酸化，釋放NF-κB p65，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB與TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子可形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在肺炎過程中起著重要作用。TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)炎癥部位白細(xì)胞的聚集和活化，加重炎癥。IL-1β在傳遞信息，激活免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化，增殖與分化及在炎性反應(yīng)中起重要作用。IL-6也主要由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，是介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，是炎癥免疫反應(yīng)的重要遞質(zhì)。在香煙誘導(dǎo)的肺炎肺組織中NF-κB活性升高的同時(shí)，伴有IL-1β、TNF-α等炎癥因子含量升高[15]。而通過谷氨酰胺的干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)伴隨著p65及IκBα磷酸化水平的降低，谷氨酰胺治療組能顯著降低肺組織勻漿及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，與Singleton等[13]，Zabot等[14]的研究結(jié)果類似，進(jìn)而說明谷氨酰胺能使NF-κB信號通路喪失活性，從而抑制其下游炎癥因子的表達(dá)，使得大鼠肺炎炎癥得以減輕。

綜上所述，谷氨酰胺組能降低W/D比值，減輕肺組織充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤，改善肺組織形態(tài)，抑制血清和肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平。

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Inhibition of glutamine on inflammation of rats with pneumonia induced by Klebsiella pneumonia

YuGang1，JianLiping2

(1.DepartmentofICU,People′sHospitalofAbaPrefecture,Barkam,Sichuan624000,China; 2.SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the inhibition effect of glutamine on the inflammation of rats with pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into the normal group, model group and glutamine treatment group. The rat pneumonia model was established by intratracheal instillation of Klebsiella Bacillus pneumonia.Results Compared with the model group, the glutamine treatment group could reduce the ratio of W/D(5.98±0.29)vs.(4.32±0.33)(P<0.05), alleviated the lung tissue edema, inflammatory cell infiltration and then improved the morphology of the lung tissue, inhibited the IL-6, IL-1 and TNF-α secretion in serum and lung homogenate(P<0.05), and inhibited the level of NF-κB p65 and IκBα phosphorylation.Conclusion Glutamine inhibits the inflammation of rats with pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae, which might be related to NF-κB signal pathway.

glutamine; Klebsiella pneumonia; pneumoniae; inflammation; NF-κB signal pathway

禹剛(1980-)，本科，主治醫(yī)師，主要從事呼吸重癥方面的研究。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.005

R563.1

A

1671-8348(2016)33-4622-03

2016-04-11

2016-07-13)