賈樂生，鄭剛，夏凡，楊爽

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨外三科，沈陽 110024）

硫辛酸對骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響及機(jī)制研究

賈樂生，鄭剛，夏凡，楊爽

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨外三科，沈陽 110024）

目的探討氧化應(yīng)激及抗氧化劑硫辛酸在大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)生中的作用及可能的機(jī)制。方法選用8周齡Wistar雌性大鼠24只，隨機(jī)分為對照組、骨質(zhì)疏松組和硫辛酸干預(yù)組，采用雙側(cè)卵巢切除法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，硫辛酸組采用60 mg/kg硫辛酸腹腔注射，干預(yù)共8周；檢測骨密度，全血堿性磷酸酶（ALP），骨鈣素，鈣、磷水平，股骨組織MDA、SOD和GSH?Px含量；Western blotting方法測定股骨組織護(hù)骨素（OPG）和細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（RANKL）蛋白含量，Real?time PCR方法測定股骨組織OPG和RANKLmRNA表達(dá)水平。結(jié)果骨質(zhì)疏松組大鼠骨密度，股骨組織中SOD、GSH?Px、OPGmRNA及蛋白表達(dá)低于對照組大鼠（P＜0.05）；血清骨鈣素，ALP水平，股骨組織中MDA、RANKLmRNA及蛋白水平都顯著高于對照組大鼠（P＜0.05）。硫辛酸組大鼠骨密度和股骨組織中SOD、GSH?Px、OPGmRNA及蛋白表達(dá)高于骨質(zhì)疏松組大鼠（P＜0.05）；血清骨鈣素，ALP水平，股骨組織中MDA、RANKLmRNA及蛋白表達(dá)水平都顯著低于骨質(zhì)疏松組大鼠（P＜0.05）。結(jié)論氧化應(yīng)激可能通過OPG/RANKL通路促進(jìn)了大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而抗氧化劑硫辛酸可緩解骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。

骨質(zhì)疏松；硫辛酸；氧化應(yīng)激；護(hù)骨素；細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基

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隨著中國人口老齡化，老年人常見疾病——骨質(zhì)疏松癥引起廣泛關(guān)注，中國40歲以上人群骨質(zhì)疏松總體患病率達(dá)13.2%［1］。骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性疾病，主要特征骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，可導(dǎo)致骨脆性增加及骨折危險性增加［2］。引起骨質(zhì)疏松的因素很多，如遺傳、營養(yǎng)、生活習(xí)慣等［3?4］。近期有研究［5］發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中起重要作用，可加重骨組織破壞。氧化應(yīng)激引起骨質(zhì)疏松可能與一氧化碳、核因子κB、護(hù)骨素（os?teoprotegerin，OPG）/細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor?κB ligand，RANKL）等相關(guān)，但目前具體機(jī)制還不清楚。硫辛酸為公認(rèn)的抗氧化劑，其在骨質(zhì)疏松中是否有保護(hù)作用有待進(jìn)一步探討。本實驗通過建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，探討氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松中作用，并選用抗氧化劑硫辛酸干預(yù)，探討其對骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響以及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

健康Wistar大鼠24只，雌性，8周齡，體質(zhì)量（253.3±18.5）g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組（對照組）、骨質(zhì)疏松組和硫辛酸組，每組8只。

1.2骨質(zhì)疏松模型的建立及處理

骨質(zhì)疏松組和硫辛酸組大鼠3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/g）腹腔注射麻醉，下腹部備皮，開腹找到子宮，結(jié)扎卵巢動脈，完整切除雙側(cè)卵巢，建立骨質(zhì)疏松模型，對照組僅切除卵巢周圍小塊脂肪組織，其他操作同骨質(zhì)疏松模型組。硫辛酸組大鼠腹腔注射硫辛酸注射液（60 mg/kg），骨質(zhì)疏松組腹腔注射生理鹽水，1周注射6 d，共干預(yù)8周。8周后大鼠麻醉后腹主動脈取血，取雙側(cè)股骨，-80℃保存待測。

1.3指標(biāo)檢測

1.3.1骨密度檢測：取出標(biāo)本室溫下解凍，小心剔除右側(cè)股骨兩端軟組織，將待測的骨置于雙能X線骨密度檢測儀測試臺上（Prodigy型，GE公司），應(yīng)用小動物軟件（Hologic，Bedford，MA，美國）程序掃描，整段股骨進(jìn)行骨密度分析測定。

1.3.2全血堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素、鈣和磷檢測：采用生物化學(xué)方法，使用貝克曼全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.3.3丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH?Px）檢測：取出股骨，0.9%氯化鈉溶液1∶10稀釋勻漿，4℃離心（3 000 r/min，15 min）。MDA、SOD、GSH?Px和總蛋白測定具體操作嚴(yán)格按照試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行。

1.3.4Real?time PCR方法檢測OPG和RANKL mRNA表達(dá)：采用Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系擴(kuò)增，使用SYBR Green相對定量的方法。采用Primer 3軟件設(shè)計PCR引物，以β?actinmRNA為內(nèi)參照，引物序列如下：RANKL上游引物，5’?GACAGGCACGGACTCGTA?3’，下游引物，5’?CGCTCATGCTAGTCGTCTA?3’；OPG上游引物，5’?TACAGCATCACTACGTAGGAC?3’，下游引物，5’?ACGTCATGCGATCACATATCG?3’；β?actin上游引物，5’?GAAATCGTGCGTGACATTA?3’，下游引物，5’?TAGGAGCCAGGGCAGTAA?3’。運用2-ΔΔCt方法，比較各組mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.5OPG和RANKL蛋白檢測：采用Western blot?ting方法，取股骨組織樣品，加入預(yù)冷的蛋白裂解液勻漿，組織勻漿機(jī)粉碎，12 000 r/min冷凍離心，取上清分裝用于分析。取等量的核蛋白，在12%SDS－聚丙烯酰胺中電泳分離蛋白，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉中封閉過夜，TTBS洗3次，加入兔抗大鼠（OPG、RANKL）Ⅰ抗抗體，4℃孵育過夜，TTBS洗3次，加入辣根過氧物酶螯合的羊抗兔抗體（Ⅱ抗）于室溫下孵育2 h，洗膜后用ECL發(fā)光體，采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.13組大鼠體質(zhì)量比較

實驗開始前對照組［（250.6±13.7）g］、骨質(zhì)疏松組［（259±22.4）g］和硫辛酸組［（250.2±19.6）g］大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。實驗8周，骨質(zhì)疏松組大鼠體質(zhì)量（402.4±15.9）g，顯著高于對照組［（375.9±10.8）g］和硫辛酸組大鼠［（383.6±18.1）g］（P＜0.05），而硫辛酸組和對照組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.23組大鼠骨密度及血骨鈣素、鈣、磷水平比較

實驗8周后，骨質(zhì)疏松組大鼠的骨密度顯著低于對照組大鼠，而血中骨鈣素和ALP水平顯著高于對照組大鼠（P＜0.05）；硫辛酸組大鼠骨密度高于骨質(zhì)疏松組大鼠，而骨鈣素和ALP水平顯著低于骨質(zhì)疏松組大鼠（P＜0.05），見表1。

2.33組大鼠MDA、SOD、GSH?Px含量比較

實驗8周后，骨質(zhì)疏松組大鼠的股骨組織中MDA水平顯著高于對照組大鼠，而SOD和GSH?Px水平顯著低于對照組大鼠（均P＜0.05）；硫辛酸組大鼠MDA低于骨質(zhì)疏松組大鼠，而SOD和GSH?Px水平顯著高于骨質(zhì)疏松組大鼠（均P＜0.05），見表2。

2.43組大鼠OPG和RANKLmRNA表達(dá)水平比較

實驗8周后，骨質(zhì)疏松組大鼠的股骨組織中OPGmRNA水平顯著低于對照組大鼠，而RANKL mRNA水平顯著高于對照組大鼠（均P＜0.05）；硫辛酸組大鼠OPGmRNA高于骨質(zhì)疏松組大鼠，而RANKLmRNA水平低于骨質(zhì)疏松組大鼠（P＜ 0.05），見表3。

表1　實驗8周3組大鼠骨密度及血骨鈣素、ALP、鈣、磷水平變化（x±s，n=8）Tab.1　Levels of BMD，steocalcin，ALP，Ca，and P among 3 groups at 8 weeks（x±s，n=8）

表2實驗8周3組大鼠MDA，SOD，GSH?Px含量比較（x±s，n=8）Tab.2　Comparison of MDA，SOD，and GSH?Px levels among 3 groups at 8 weeks（x±s，n=8）

2.53組大鼠OPG和RANKL蛋白水平比較

表3OPG和RANKL mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（x±s，n=8）Tab.3　Comparison of OPG and RANKL mRNA and protein among 3 groups at 8 weeks（x±s，n=8）

實驗8周后，骨質(zhì)疏松組大鼠的OPG蛋白顯著低于對照組大鼠，而RANKL水平顯著高于對照組大鼠（P＜0.05）；硫辛酸組大鼠OPG高于骨質(zhì)疏松組大鼠，而RANKL水平低于骨質(zhì)疏松組大鼠（P＜0.05）；RANKL/OPG比值骨質(zhì)疏松組顯著高于對照組，硫辛酸組低于骨質(zhì)疏松組（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 實驗8周3組大鼠OPG和RANKL蛋白水平比較Fig.1　Comparison of OPG and RANKL protein levels among 3 groups in 8 weeks

3　討論

本次實驗發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松組MDA水平顯著高于對照組，而SOD和GSH?Px水平顯著低于對照組，骨質(zhì)疏松組氧化抗氧化水平失衡，氧化損傷增高同時抗氧化系統(tǒng)減弱，可見氧化損傷與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，另有研究［6］也表明活性氧參與骨質(zhì)疏松的病理過程。本次試驗增加抗氧化劑硫辛酸的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)硫辛酸組的MDA水平較骨質(zhì)疏松組下降，而SOD和GSH?Px水平較骨質(zhì)疏松組升高，同時骨鈣素水平降低，骨密度增高，可見使用抗氧化劑可能改善骨質(zhì)疏松大鼠骨的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。

有研究［7］表明OPG/RANKL通路是破骨細(xì)胞分化過程中的一個重要信號傳導(dǎo)通路，有報道［8］認(rèn)為當(dāng)氧化應(yīng)激水平增高時，RANKL表達(dá)水平會增高，OPG表達(dá)水平下降，OPG/RANKL比值降低，RANKL與RANK結(jié)合增多，而OPG與RANK結(jié)合反而減少，破骨細(xì)胞的形成、分化、成熟會被促進(jìn)，骨吸收增加，最終導(dǎo)致骨組織損傷，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。本研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松組RANKL表達(dá)水平增高，OPG表達(dá)水平降低，RANKL/OPG比值升高，同時骨組織中氧化應(yīng)激水平顯著升高，同上述報道一致，本研究還增加了抗氧化劑硫辛酸的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)硫辛酸干預(yù)組同骨質(zhì)疏松組比較RANKL表達(dá)水平降低，OPG表達(dá)水平升高，RANKL/OPG比值降低，進(jìn)一步印證氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松形成中的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激可能通過OPG/RANKL通路促進(jìn)了骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而抗氧化劑硫辛酸可緩解骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。本次實驗采用大鼠骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行研究，若在人群中推廣需要更多的臨床數(shù)據(jù)證實。氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松形成中的具體機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究。

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（編輯武玉欣）

Effects of Lipoic Acid on Bone Metabolism in Osteoporosis Rat and Its Mechanism

JIA Lesheng，ZHENG Gang，XIA Fan，YANG Shuang
（Department of Orthopeadic Surgery，The Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate the effects of oxidative stress and lipoic acid（antioxidant）on bone metabolism and explore the underlying mechanism.MethodsA total of 24 Wistar rats aged 8 weeks were randomly divided into three groups.Osteoporosis rats model was established by bilateral ovaries deleted.Rat in lipoic acid group was injected with lipoic acid（60 mg/kg）for 8 weeks.The bone mineral density（BMD），steo?calcin，ALP，Ca，P，MDA，SOD and GSH?Px were detected.The levels of OPG and RANKL in serum were measured by Western blotting.OPG andRANKLmRNA were detected by real?time PCR.ResultsThe level of BMD level in blood，SOD，GSH?Px，OPGmRNA and protein level in femur of osteoporosis group were significantly lower than the control group（P＜0.05）.On the other hand，steocalcin，ALP，MDA，RANKLmRNA and protein level were significantly higher than the control group（P＜0.05）.The level of BMD level in blood，SOD，GSH?Px，OPGmRNA and protein level of lipoic acid group were significantly higher than the osteoporosis group（P＜0.05）.The steocalcin，ALP，MDA，RANKLmRNA and protein level were significantly lower than the osteoporosis group（P＜0.05）.ConclusionOxidative stress may increase osteoporosis through the upregulation of OPG/RANKL pathway in rats，and antioxidant lipoic acid can alleviate the progress of osteoporosis.

osteoporosis；lipoic acid；oxidative stress；osteoprotegerin；receptor activator of nuclear factor?kB ligand

R68

A

0258-4646（2016）12-1133-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.017

賈樂生（1974-），男，副主任醫(yī)師，碩士. E-mail：happylifejia@foxmail.com

2016-04-07

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