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p53與bcl-2基因變化在股骨頭缺血性壞死發(fā)病中的影響實驗研究*

兒童股骨頭缺血性壞死即Perthes 病，多發(fā)于幼兒,病程2～4年，如治療不及時后期可出現(xiàn)長造成局部髖關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[1-2]。 研究表明,該疾病的主要以骨細胞的的凋亡為主要改變的病理過程[3]。骨組織中含量最多的細胞是骨細胞，骨細胞的凋亡易引起股骨頭骨骺部分或全部壞死。Perthes 病因復(fù)雜， 確切的發(fā)病機制和病理過程仍不明確。研究已經(jīng)表明p53調(diào)節(jié)細胞的正常凋亡，它對于調(diào)節(jié)細胞的正?；顒佑兄匾淖饔?，而p53與bcl-2以相互拮抗的方式來調(diào)節(jié)細胞的正常活動、對于細胞正常凋亡有著重要的角色。當某種因素造成p53基因突變，表達異常增加，組織的正常生長調(diào)控破壞，其代謝發(fā)生變化，可引起骨細胞大量凋亡[4]。本次實驗通過建立動物 Perthes病模型，觀察股骨頭p53與bcl-2表達的變化，研究該基因在Perthes疾病中的作用及該病的發(fā)病機制。

材料和方法

1 實驗動物與分組 本次動物實驗的實施完成在西北醫(yī)院骨科動物實驗室進行，時間為2011年12月至2012年5月，32只實驗動物均購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，雌性和雄性各16只。32只實驗動物隨機分為實驗組和對照組各半。

2 實驗方法 本實驗按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》進行[5]。

2.1 建模：實驗動物靜脈注射麻醉，應(yīng)用骨穿刺套針經(jīng)股骨頸穿刺。實驗組至右側(cè)股骨頭骺板遠側(cè)，向股骨頭內(nèi)注入醫(yī)用TH0.5ml[3]。參照同上方法吸取0.5ml 生理鹽水注射入對照組右側(cè)股骨頭內(nèi)。動物模擬人類站立位雙側(cè)髖關(guān)節(jié)負重的生理狀態(tài)[6-7]。

2.2 取材：于建模術(shù)后第6、8、10、12周分別取兩組動物各4只，臀大肌注射人用氯胺酮10 mg/kg，予動脈耳緣靜脈內(nèi)注射氣體5ml致氣體栓塞，解剖實驗側(cè)股骨頭，并給予 10%甲醛溶液固定。

2.3 病理學(xué)檢測：標本進行切片處理固定，顯微鏡下隨機分成10個區(qū)域，隨機記錄每個區(qū)域內(nèi)100個骨細胞，計算所有區(qū)域內(nèi)細胞凋亡總數(shù)，測定p53和bcl-2。

2.4 細胞凋亡檢測：凋亡細胞檢測按照TUNEL試劑盒說明書進行。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件，組間比較采用t檢驗，采用Pearson相關(guān)分析法進行相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 32只動物在實驗期間全部存活，5只動物出現(xiàn)腹瀉，給予口服土霉素后癥狀消失。

2 實驗組16只動物右下肢于術(shù)后第6周出現(xiàn)跛行；對照組右下肢活動良好，無異常表現(xiàn)。兩組動物體重及毛發(fā)光澤等正常生長。

3 對照組右側(cè)股骨頭外觀未見異常，與正常股骨頭基本一致。實驗組第6周時右側(cè)髖關(guān)節(jié)周圍組織開始腫脹，出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液及關(guān)節(jié)間隙的增寬，隨著試驗時間延長部分股骨頭軟骨面可出現(xiàn)點狀充血，并逐漸擴大；到達第12周時，實驗組股骨頭雖形態(tài)正常，未見塌陷，但股骨頭軟骨面失去鮮亮色澤，可見骨質(zhì)疏松明顯，骨質(zhì)硬度差，易碎。

4 實驗組右側(cè)股骨頭骨小梁排列紊亂，部分中斷，數(shù)量減少，骨細胞內(nèi)可見脂肪變性，部分骨細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；骺板細胞排列發(fā)生變化，厚度變薄，可見有TH膠存留于骺板小靜脈內(nèi)將其栓塞。對照組右側(cè)股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)量、組織結(jié)構(gòu)未見明顯變化，骨骺厚度及細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常。

5 根據(jù)TUNEL試劑標準對凋亡細胞進行標記，顯示凋亡細胞染色呈淡黃色或棕黃色，陽性信號在核內(nèi)分布，周圍無炎性反應(yīng)細胞，形態(tài)大小不一，核邊界清楚。

6 模型組和對照組細胞凋亡率變化，見表1。

7 實驗組右側(cè)股骨頭p53和bcl-2基因的表達在第8、10、12周分別與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，見表2。

表1 各組動物細胞凋亡率比較

表2 凋亡誘導(dǎo)及抑制基因率比較( 100%)

8 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，實驗組股骨頭骺板細胞凋亡率與p53基因表達陽性率呈正相關(guān)性(r=0.7,P<0.05)，與bcl-2基因表達陽性率之間呈負相關(guān)性(r=-0.7,P<0.01)。

討 論

Perthes 病動物模型的建立既是治療研究的基礎(chǔ)，也是研究該病病因及發(fā)病機制十分重要的手段。國內(nèi)學(xué)者目前主要是通過向股骨頭內(nèi)注射醫(yī)用TH膠建立的兒童股骨頭壞死動物模型，該方法操作性強，穩(wěn)定，經(jīng)濟，成功率高。本實驗中所建立的動物模型出現(xiàn)了髖關(guān)節(jié)周圍組織水腫，軟骨面出現(xiàn)充血變性區(qū)，關(guān)節(jié)間隙增寬與兒童股骨頭軟骨炎的表現(xiàn)及發(fā)病機制相似， 重現(xiàn)了Perthes病的基本特征，對于進一步研究 Perthes 病提供了可靠模型。

對于p53與bcl-2基因表達的研究，國內(nèi)外學(xué)者長期致力于Perthes病病因及發(fā)病機制的研究,目前有諸多學(xué)說,但其確切機制還不十分明了。正常情況下當細胞發(fā)生壞死時常出現(xiàn)組織腫脹及周圍炎癥反應(yīng)，而該疾病未出現(xiàn)上述變化，目前機制不明，還不能完全確定該疾病為局部出現(xiàn)了骨壞死[8]。多細胞生物細胞死亡的方式為凋亡和壞死,凋亡是指在自身內(nèi)部程序下，在特定的生理或病理條件下細胞出現(xiàn)死亡過程。而細胞壞死是指在非正常情況下，即病理狀態(tài)下細胞出現(xiàn)的非正常死亡過程，他們之間非同一種變化，但又有聯(lián)系,細胞壞死不能向凋亡轉(zhuǎn)化。目前需要明確的是Perthes病中骨細胞的死亡方式,對該病的防治有重要意義。當出現(xiàn)Perthes疾病時，局部骨細胞出現(xiàn)缺血缺氧，使p53凋亡基因異常表達和bcl-2凋亡抑制基因表達減少，引起了骨細胞凋亡及壞死，因此學(xué)者們認為Perthes疾病中,骨細胞出現(xiàn)的凋亡而非壞死[9]。并且在Perthes病患側(cè)股骨頭骨髓組織體外培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)了當骨內(nèi)壓的升高時可誘發(fā)凋亡基因的表達的異常活躍，造成骨細胞的凋亡及生成減少，引起股骨頭壞死[10]。

因此，應(yīng)用TH膠注射法建立兒童股骨頭壞死動物模型，造成局部血液循環(huán)障礙，組織缺血水腫，骨內(nèi)壓持續(xù)增高，細胞在持續(xù)的缺血狀態(tài)下，不能維持自身正常代謝過程，造成一氧化氮合成酶含量增加,p53的異常表達增加,而bcl-2抑制凋亡基因表達的減少，造成骨細胞生成減少，且出現(xiàn)凋亡增加，最終導(dǎo)致骨壞死。本實驗研究發(fā)現(xiàn)引起Perthes病的病因可能為Perthes病微血管病變，它也是引起p53、bcl-2凋亡相關(guān)基因出現(xiàn)異常表達的原因，從而引起骨細胞出現(xiàn)大量程序性死亡，引起了兒童股骨頭壞死的發(fā)生。

[1] 王翠英,董晨輝,王愛民. 小兒股骨頭壞死診治研究進展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2014,30(6)：872-874.

[2] Jesper Johannesen , Julie Briody, Mary Mc Quade,etal. Systemic effects of zoledronic acid in children with traumatic femoral head avascular necrosis and legg[J].Calve Perthes Disease Bone ，2009，45：898-902.

[3] 姬峻芳,詹啟敏,吳 旻. Bcl-2與P53的相互作用[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2005,2(2):102-104.

[4] 盧 誠. TNF-α、IL-1β在Perthes病髖關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達及意義[D]. 南昌大學(xué),2015.

[5] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. [J].Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals,2006.

[6] Uziel Y，Butbul- Aviel Y，Barash J，etal. Recurrent tran-sient synovitis of the hip in child-Journal of clinical Pediatric surgery, Longterm outcome among 39 patients [J]. JRheumatol，2006，33(4):810- 811.

[7] 孟海濤,李 林,王翠蘋,等. Ⅱ型膠原基因型變化與Legg-perthes病發(fā)病的相關(guān)性研究[J]. 實用骨科雜志,2015,21(2)：134-135.

[8] 俞 松,謝 祎. Perthes病的病因與治療[J]. 實用醫(yī)院臨床雜志,2012,9(4)：38-40.

[9] 彭黎明,王曾禮.細胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:66-68.

[10] Weinstein RS,Nicholas RW,Manolagas SC.Apoptosis of osteonecro-sis in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the hip[J]. J Clinical Endocrinology&Metabolism,2000,85:2907-2912.

(收稿：2015-12-18)

陜西省第四人民醫(yī)院骨二科(西安710043) 張亞斌 龐仲輝 姚永鋒 夏利鋒

目的：觀察p53和bcl-2基因在股骨頭壞死動物模型中的變化，了解其在該疾病發(fā)病的作用。方法：32只3個月齡新西蘭大白兔隨機分為實驗組和對照組(均以幼兔的右側(cè)股骨頭為實驗側(cè))，給予實驗組動物經(jīng)右側(cè)股骨頸注射醫(yī)用TH膠0.5ml致骺板缺血，建立幼兔Perthes 病模型(A組)，以相同方法用給予對照組右側(cè)股骨頭注射同等劑量生理鹽水(B組)，分別于建模后第6、8、10、12 周取兩組等量動物進行股骨頭病理切片，觀察兩組股骨頭p53 和bcl-2凋亡基因表達的變化。結(jié)果：A組p53 基因表達陽性率與股骨頭骺板細胞凋亡率呈明顯正相關(guān)性(r=0.7,P<0.05)，bcl-2 基因表達陽性率與其之間呈明顯負相關(guān)性(r=-0.7,P<0.01)。B組p53與bcl-2基因無明顯變化。結(jié)論：p53和bcl-2凋亡基因與兒童股骨頭壞死有相關(guān)性。

P53 and the change of the bcl - 2 gene in children experimental study of the influence the incidence of ischemic necrosis of the femoral head

Fourth People's Hospital of Shaanxi Province (Xi’an710043 )Zhang Yabin Pang Zhonghui Yao Yongfeng et al

Objective： to observe the p53 and BCL - 2 gene expression in animal models of children femoral head necrosis, discusses its impact on the pathogenesis of the disease. Methods：32 New Zealand rabbit were randomly divided into experimental group and control group, through the femoral neck give experimental group (group A) the right side of the femoral head in medical TH glue injection of 0.5 ml, giving the control group (group B) the right side of the femoral head in normal saline of 0.5 ml,after 6,8,10,12 weeks observe two groups of femoral head p53 and bcl -2 apoptosis gene expression changes. Results：After modeling group A positive rate of p53 gene expression and femoral head epiphyseal plate apoptosis rate was significantly positive correlation (r= 0.7,P<0.05), the BCL - 2 gene expression was significantly negative correlation between positive rate (r= 0.7,P<0.7), Conclusion: p53 and bcl - 2 apoptosis genes have correlation with children femoral head necrosis.

Femur head necrosis/immunology Genes,p53 Genes,bcl-2 Apoptosis Disease models,animal Rabbits

*陜西省科技廳科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(S2012SF2889)

股骨頭壞死/免疫學(xué) 基因，p53 基因，bcl-2 細胞凋亡 疾病模型，動物 免

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.005