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        依卡倍特鈉對反流性食管炎大鼠食管黏膜的保護(hù)作用及可能機(jī)制

        2016-12-16 07:59:01楊柳,孫明軍,黃玉紅
        陜西醫(yī)學(xué)雜志 2016年11期
        關(guān)鍵詞:特鈉食管炎食管

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        依卡倍特鈉對反流性食管炎大鼠食管黏膜的保護(hù)作用及可能機(jī)制

        目的:探討依卡倍特鈉(ES)對反流性食管炎大鼠食管黏膜病變的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:采用食管十二指腸吻合術(shù)建立大鼠RE模型,進(jìn)行藥物干預(yù)。HE染色檢測各組大鼠食管黏膜損傷情況;ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子水平;Real-time PCR檢測食管內(nèi)TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達(dá);Western blot檢測食管內(nèi)ERK及P38通路活化。結(jié)果:ES低、中、高濃度干預(yù)不同程度緩解了食管黏膜病變,降低血清中TNFα、IL-1β水平及食管中TNFα、IL-1、Cox2表達(dá)(P<0.05),抑制ERK及P38通路的異?;罨?P<0.05)。結(jié)論:ES通過抑制MAPK信號通路抑制TNFα、IL-1、Cox2的表達(dá),影響炎癥因子的釋放和炎癥發(fā)生,從而緩解食管黏膜病變。

        胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease, GERD)嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致Barrett食管及食管癌[1]。反流性食管炎(Reflux esophagitis, RE)是胃食管反流病的一種。依卡倍特鈉(Ecabet sodium,ES)作為一種胃黏膜保護(hù)劑,可以選擇性的在胃黏膜損傷處形成保護(hù)層,改善內(nèi)膜局部血流量,增強(qiáng)防御因子的作用,一直主要用于胃炎、胃潰瘍的臨床治療[2],近年來開始進(jìn)行RE治療方面的應(yīng)用。有研究指出其對大鼠RE具有緩解作用[3],但是具體分子機(jī)制尚未清楚。有報(bào)道指出,ES可能通過MAPK信號途徑保護(hù)腸上皮細(xì)胞損傷[4]。因此,本文擬建立大鼠混合反流性食管炎及依卡倍特鈉治療模型,研究MAPK信號通路及相關(guān)細(xì)胞因子變化情況,觀察ES對RE的治療作用是否與該信號通路相關(guān),以期尋找臨床治療RE的理想藥物。

        材料與方法

        1 材 料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物:健康8周齡SD雄性大鼠70只,體重約200 g,購買自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器:微量移液器購自美國Eppendorf公司;離心機(jī)為美國Sigma公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS;石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱購自天津泰斯特公司;超純水系統(tǒng)購自香港Heal Force公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑:奧美拉唑?yàn)閺V東逸舒制藥有限公司產(chǎn)品;依卡倍特鈉為天津田邊制藥有限公司產(chǎn)品;二甲苯、無水乙醇及曙紅Y(醇溶)均為國藥集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品;蘇木精為Solarbio公司產(chǎn)品;大鼠血清TNFα及IL-1β ELISA檢測試劑盒為Boster公司產(chǎn)品;ERK、p-ERK、P38和p-P38抗體為沈陽萬類生物科技有限公司產(chǎn)品。

        2 方 法

        2.1 大鼠混合反流性食管炎模型建立及藥物干預(yù):大鼠于實(shí)驗(yàn)前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3 d,隨機(jī)分成對照組、假手術(shù)組、模型組、ES干預(yù)組(低、中、高劑量)及奧美拉唑(療效對照)組,每組10只,除對照組和假手術(shù)組外,其余組均按食管十二指腸吻合術(shù)進(jìn)行反流性食管炎建模。具體方法為:先予10 %水合氯醛麻醉大鼠,將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上,消毒后腹部正中切口,將食管下段分離,保留迷走神經(jīng),切斷食管,胃賁門端作荷包縫合,將胃曠置,距幽門端約l cm處縱行切開十二指腸壁約0.4~0.5 cm,與食管下端行端側(cè)吻合,然后逐層縫合腹部傷口。對照組不作任何處理,假手術(shù)組只開腹不做其他處理,15 min后逐層縫合腹部傷口。模型建立后0 d,ES干預(yù)組分別以20 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg給予低、中、高濃度的依卡倍特鈉灌胃,療效對照組以20 mg/kg給予奧美拉唑灌胃,對照組、假手術(shù)組、模型對照組給予等體積蒸餾水,每天給藥一次連續(xù)給藥2周。

        2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色:各組固定后的食管組織標(biāo)本,經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋,約5 μm厚連續(xù)切片,每組隨意取10張切片用于HE染色,每組隨意抽取5張切片于200倍光鏡下觀察并拍照。

        2.3 ELISA檢測血清中炎癥因子TNFα、IL-1β的水平:處死各組大鼠后,取血,于室溫下放置30 min左右待其凝固后,于離心機(jī)上3000 rpm離心10 min,取血清,參照說明書用TNFα及IL-1β ELISA檢測試劑盒檢測大鼠血清中TNFα、IL-1β的水平。

        2.4 RT-PCR檢測食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達(dá)水平:取食管組織,正常提取組織總RNA,行Real time PCR擴(kuò)增,用β-actin做內(nèi)參。取5 μl的PCR產(chǎn)物,電泳、染色、成像,用Quantity One軟件行灰度分析,目的基因mRNA的表達(dá)值用基因產(chǎn)物與內(nèi)參的灰度比值表示。

        2.5 Western blot檢測ERK、p-ERK、P38、p-P38的表達(dá)及磷酸化:取食管組織,正常提取蛋白質(zhì),化學(xué)發(fā)光法顯色,對條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。用β-actin做內(nèi)參。采用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參吸光度值的比值進(jìn)行比較。

        結(jié) 果

        1 各組大鼠食管粘膜損傷程度 食管組織連續(xù)切片HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠食管未見明顯的組織學(xué)病變。模型組大鼠食管可見鱗狀上皮細(xì)胞增生,鱗狀上皮的黏膜固有層乳頭伸長,部分可見黏膜糜爛或潰瘍形成。療效對照組鱗狀上皮未見增生,黏膜尚完整,未見明顯糜爛、潰瘍等病變,固有膜乳頭縮短,固有膜內(nèi)可見少許慢性炎細(xì)胞浸潤。ES低濃度干預(yù)組大鼠食管黏膜部分區(qū)域仍可見糜爛,ES中濃度干預(yù)組大鼠的食管黏膜損傷有所改善,而高濃度ES干預(yù)組大鼠食管鱗狀上皮未見明顯細(xì)胞病變,黏膜較完整,未見糜爛、潰瘍等病變,這與療效對照組相似(圖1)。

        圖1 各組大鼠食管粘膜病理形態(tài)學(xué)觀察[HE染色;×200;對照組(A)、假手術(shù)組(B)、模型組(C)、低劑量ES干預(yù)組(D)、中劑量ES干預(yù)組(E)、高劑量ES干預(yù)組(F)和療效對照組(G)]

        2 各組大鼠血清TNFα、IL-1β炎癥因子水平 模型組血清TNFα、IL-1β炎癥因子明顯高于正常對照組(P<0.001);對照組TNFα及IL-1β水平明顯低于模型組(P<0.01);低濃度ES干預(yù)組TNFα的水平明顯低于RE模型組(P<0.05),而IL-1β的水平與RE模型組無明顯差異;中濃度及高濃度ES干預(yù)組TNFα、IL-1β的水平均明顯低于RE模型組(P<0.05)。此外,高濃度的ES干預(yù)組TNFα的水平明顯低于對照組(P<0.01),但I(xiàn)L-1β水平無明顯差異(圖2)。

        3 各組大鼠食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA相對表達(dá)水平mRNA表達(dá)水平 模型組食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P<0.001);低、中、高濃度ES干預(yù)組TNFα、IL-1和Cox2 mRNA的表達(dá)均明顯低于模型組(P<0.05)。此外,療效對照組TNFα、IL-1和Cox2 mRNA的表達(dá)均明顯低于高濃度的ES干預(yù)組(P<0.001)(圖3)。

        4 各組大鼠食管組織ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白水平 模型組ERK的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.001),而P38的表達(dá)明顯低于對照組(P<0.001),但是p-ERK和p-P38的表達(dá)都明顯高于對照組(P<0.001)。對照組ERK及P38的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05),但是其p-ERK和p-P38的表達(dá)都明顯低于對照組(P<0.001)。中、低濃度ES干預(yù)組ERK的表達(dá)與模型組相比無明顯差異,高濃度ES干預(yù)組ERK的表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05),但高、中、低濃度ES干預(yù)組p-ERK的表達(dá)均明顯低于RE模型組(P<0.001);高、中、低濃度ES干預(yù)組P38的表達(dá)雖然都明顯高于模型組(P<0.05或P<0.001),但其p-P38的表達(dá)均明顯低于模型組(P<0.001)。這與療效

        對組大鼠食管中ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白的表達(dá)情況相似(圖4)。

        圖2 各組大鼠血清TNFα、IL-1β炎癥因子水平(與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與療效對照組相比,&P<0.05,&&P<0.01)

        圖3 各組大鼠食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達(dá)水平(與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與療效對照組相比,&P<0.05,&&P<0.01)

        圖4 各組大鼠食管組織ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白水平(與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與療效對照組相比,&P<0.05,&&P<0.01)

        討 論

        反流性食管炎(RE)容易長期、反復(fù)發(fā)作,能夠并發(fā)潰瘍、出血、穿孔以及Barrett食管等,嚴(yán)重者能夠發(fā)展成食管腺癌,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[5]。

        依卡倍特鈉(ES)是一種胃黏膜保護(hù)劑,主要用于胃炎、胃潰瘍的臨床治療[2],近年來有研究指出其對大鼠RE具有緩解作用[3]。奧美拉唑是臨床治療RE的代表藥物之一[6],因此選作療效對照。為探究ES治療RE的分子機(jī)制,本研究采用食管十二指腸吻合術(shù)建立大鼠RE模型,比較了ES干預(yù)前后各組大鼠食管黏膜的病理學(xué)變化。結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組呈現(xiàn)明顯的食管黏膜炎癥表現(xiàn),說明食管十二指腸吻合術(shù)可成功建立大鼠RE模型;經(jīng)ES干預(yù)治療后,RE模型組上皮增生、糜爛和潰瘍均有不同程度減輕??梢姡珽S對RE模型大鼠受損食管黏膜確有保護(hù)和修復(fù)作用。研究表明,多種促炎性細(xì)胞因子在RE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。Ku等人[8]通過仙茅根莖提取物緩解RE大鼠食管損傷,同時(shí)降低了TNFα、IL-1及IL-6的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ES干預(yù)顯著降低模型組大鼠血清及食管TNFα、IL-1水平,提示ES可能通過抑制TNFα、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)緩解RE模型中的食管損傷。環(huán)氧合酶-2(Cox2)與炎癥性疾病的關(guān)系非常密切。Hayakawa等[9]的研究證實(shí)Cox2在反流性食管炎的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中,ES干預(yù)顯著降低模型組食管Cox2的升高,提示ES可通過抑制Cox2的表達(dá)減少炎癥反應(yīng),從而緩解RE模型中的食管損傷。文獻(xiàn)表明,抑制P38 MAPK信號通路的激活可以緩解RE大鼠的食管粘膜損傷[10],說明P38 MAPK信號通路可能參與RE的病理進(jìn)程。在本實(shí)驗(yàn)中,ES干預(yù)能夠顯著抑制模型組大鼠ERK和P38的異?;罨?,提示ES可能通過抑制ERK和P38的磷酸化參與RE模型中的食管損傷修復(fù)。

        綜上,ES通過抑制MAPK信號通路影響TNFα、IL-1、Cox2的表達(dá),進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放和炎性反應(yīng),緩解RE模型中的食管黏膜病變。本研究探討了ES緩解RE食管損傷的分子機(jī)制,可為臨床預(yù)防及治療RE提供重要的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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        (收稿:2016-03-18)

        中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(沈陽 110001) 楊 柳 孫明軍 黃玉紅△

        Esophageal mucosa protective effects and its mechanism of Ecabet sodium in rat reflux esophagitis

        The First Hospital of China Medical University(Shenyang 110001) Yang Liu Sun Mingjun Huang Yuhong

        Objective: To inquire into the esophageal mucosa protective effects of Ecabet sodium(ES) in rat reflux esophagitis (RE) and its possible mechanism. Methods: The operation of end-to-side anastomosis of the esophagus and duodenum was performed to establish rat RE model. Esophageal mucosa lesion was examined by HE stain. The level of TNFα and IL-1β in sera was determined by ELISA. The level of TNFα, IL-1 and Cox2 in esophageal tissues were detected by Real-time PCR. The activation of ERK and P38 was detected by western blot. Results: Low, middle and high concentration ES intervention showed different levels of alleviation of esophageal mucosa disease, decreased the level of TNFα and IL-1β in serum and TNFα, IL-1, Cox2 in esophagus (P<0.05). Otherwise, ES inhibited the abnormality activation of ERK and P38(P<0.05). Conclusion: By inhibiting the MAPK signaling pathways and suppress the expression of TNFα, IL-1 and Cox2, ES thereby inhibits the release of inflammatory cytokines and inflammation, and as a result reduces esophageal mucosal lesions in RE model.

        Ecabet sodium Reflux Esophagitis/drug therapy Demullents/pharmacology Gastroesophageal reflux @MAPK signaling pathway Rats

        食管炎/藥物療法 黏膜保護(hù)劑/藥理學(xué) 胃食管反流 @MAPK信號通路 大鼠

        R392.5

        A

        10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.004

        △通訊作者

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