陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)李 旭 安改麗 黃尚科 鄭 琪 張 茜 廖子君 趙新漢#

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阿帕替尼對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞抑制作用體外研究*

陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)李 旭 安改麗△黃尚科▲鄭 琪 張 茜 廖子君 趙新漢▲#

目的:探討阿帕替尼對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)影響及其機(jī)制。方法：將不同濃度的阿帕替尼作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24h、48h、72h，采用MTT法檢測(cè)不同濃度及時(shí)間的阿帕替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)阿帕替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用后的凋亡率及其細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果：阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且存在時(shí)間劑量依賴關(guān)系；阿帕替尼可以明顯的促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 其凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加, 與對(duì)照組相比, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；阿帕替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的作用與其對(duì)細(xì)胞周期的相關(guān)性作用不明顯。結(jié)論 阿帕替尼能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力。

新生血管為腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展提供了必要的條件,腫瘤血管生成和腫瘤發(fā)生和發(fā)展的密切關(guān)系，所以腫瘤血管成為抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一，這在多種惡性腫瘤的治療中得到了驗(yàn)證和應(yīng)用[1]。近年來(lái)乳腺癌抗血管生成治療再次引起了人們的廣泛關(guān)注[2-3]。甲磺酸阿帕替尼片是一種口服的小分子抗血管生成新藥，通過(guò)抑制腫瘤血管生成來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用，目前臨床發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤有抗腫瘤作用。不僅可以抑制腫瘤新生血管, 還能直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。三陰性乳腺癌是一種特殊類型的乳腺癌亞型，不能從內(nèi)分泌治療和抗Her-2治療中獲益，是目前臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，作為三陰性乳腺癌代表的MDA-MB-231細(xì)胞系被發(fā)現(xiàn)與血管生成較為密切。因此，本研究旨在探討阿帕替尼對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制，為阿帕替尼應(yīng)用于三陰性乳腺癌患者的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；噻唑蘭(MTT)(美國(guó)sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)sigma公司)；Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒(江蘇凱基)；DNA含量檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞周期)(江蘇凱基)；細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國(guó)Thermo 公司)；Genios 多功能酶標(biāo)儀( 美國(guó)TECAN 公司)； FACScan 流式細(xì)胞儀( 美國(guó)BD 公司)； Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀(美國(guó)LI-COR 公司產(chǎn)品)；倒置顯微鏡( DXM1200) (日本Nikon 公司)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞采用含10%小牛血清的RMPI-1640進(jìn)行培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以約1×104/ml密度接種于96孔板上，將5、10、20、40、80 g/ml濃度的阿帕替尼分別加入孔內(nèi)，每孔加200l，每組5個(gè)復(fù)孔。以含相同濃度的DMSO培養(yǎng)液為對(duì)照，培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 L，孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 L DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。用多功能微板測(cè)試系統(tǒng)于490 nm處測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(%)=(1-試驗(yàn)孔平均OD 值/對(duì)照孔平均OD值)×100%，繪制生長(zhǎng)抑制曲線。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞消化后將細(xì)胞濃度控制在1×106個(gè)/ml，以2ml/孔接種于6孔板內(nèi)，RPMI-1640培養(yǎng)基孵育48h 后，用阿帕替尼(20mg/ml)處理24h 、48h 、72h后, 收集各處理組MDA-MB-231細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測(cè)將收集的細(xì)胞用PBS 洗滌二次后以70 %乙醇4 ℃固定過(guò)夜, 加入RNA 酶至終濃度為100 mg/ml , 加入PI 至終濃度50 mg/ml , 37 ℃避光染色30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。凋亡檢測(cè)采用不含EDTA的胰酶消化收集后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500ml的Bingding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5ml Annexin-V/PI混勻后，加入5ml PI，混勻后室溫避光反應(yīng)15min后在1h內(nèi)進(jìn)行流失細(xì)胞儀的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析， 以P<0 .05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT 不同濃度梯度的阿帕替尼作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24 -72 h 后, 其生長(zhǎng)抑制率，見(jiàn)表1。繪制生長(zhǎng)抑制曲線，見(jiàn)圖1。多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析顯示,阿帕替尼24h組與阿帕替尼作用72h組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿帕替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外生長(zhǎng)具有明顯的增殖抑制作用, 隨濃度的增加, 抑制率明顯升高, 呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系 (P<0 .05)。

表1 阿帕替尼作用MDA-MB-231細(xì)胞不同時(shí)間的生長(zhǎng)抑制率

圖1 阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

2 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)20mg/ml的阿帕替尼分別處理24h、48h、72h后, 與空白對(duì)照組一起上流式儀檢測(cè)凋亡情況。結(jié)果對(duì)照組、阿帕替尼24h、48h、72h組凋亡率均值分別為0.46 %、5.32 %、9.17 %、13.83 %,對(duì)照組與各干預(yù)組，以及各干預(yù)組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示阿帕替尼處理后各組細(xì)胞凋亡率均顯著增加, 呈時(shí)間依賴關(guān)系(圖2、圖3)。阿帕替尼20mg/ml作用MDA-MB-231細(xì)胞48h，與空白對(duì)照比較細(xì)胞周期，處理組G0/G1、G2/M、S期均值比例分別為63.15%、31.76%、5.09%；對(duì)照組分別為62.64%、32.89%、4.47%，處理組對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響，同對(duì)照組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

討 論

乳腺癌是一類異質(zhì)性很高的惡性腫瘤，基于分子表型可分為4種亞型：Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2過(guò)表達(dá)型和基底樣型[5]。四種不同分子亞型的乳腺癌患者具有不能的臨床病理特征及不同的預(yù)后，治療方面也存在一定的差異[6]。 三陰性乳腺癌(TNBC)是ER、PR、Her-2受體均陰性的乳腺癌，是具有獨(dú)特生物學(xué)特性及臨床特征的一種乳腺癌亞型,有將近10%～20.8%的乳腺癌患者屬于此種類型[7]。由于其不能從內(nèi)分泌治療及靶向Her-2治療中獲益，導(dǎo)致三陰性乳腺癌患者預(yù)后差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、病死率高。

圖2 阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞不同作用時(shí)間點(diǎn)流式凋亡

圖3 阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞不同作用時(shí)間流式凋亡率比較

隨著科學(xué)家對(duì)惡性腫瘤認(rèn)識(shí)的不斷加深，腫瘤抗血管生成已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)及治療新策略。甲磺酸阿帕替尼片是一種小分子抗血管生成的口服抑制劑，通過(guò)高度選擇性地抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2( VEGFR-2) 酪氨酸激酶的活性，阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF) 與其受體結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤血管生成，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[8]。2014年12月國(guó)家食品藥品管理監(jiān)督總局( CFDA)批準(zhǔn)其為晚期胃癌或胃食管結(jié)合部腺癌三線及三線以上治療方案。

本研究用不同濃度的阿帕替尼作用MDA-MB-231細(xì)胞24～72 h 后, 采用MTT 法檢測(cè)不同濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率, 結(jié)果表明MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制,抑制率隨阿帕替尼濃度和作用時(shí)間的增加而增加, 呈一定的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系?？梢?jiàn)阿帕替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用可能還通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮直接抗腫瘤作用[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察阿帕替尼作用MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡情況，證實(shí)阿帕替尼可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡,凋亡率隨給藥時(shí)間的遞增而增強(qiáng)。是否也參與對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞血管生成的作用還有待進(jìn)一步研究?？傊?，阿帕替尼對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且存在時(shí)間-劑量依賴關(guān)系；阿帕替尼可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其對(duì)乳腺癌MDA-MB-231的抑制作用機(jī)制與其促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

阿帕替尼作為新型的口服小分子抗血管生成抑制劑新藥，以其毒性低,療效確切的特點(diǎn)在腫瘤治療中備受矚目。其不僅通過(guò)抑制腫瘤新生血管起到抗腫瘤作用，我們的研究證實(shí)其也能通過(guò)直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為阿帕替尼和其他腫瘤治療方式的結(jié)合, 提高腫瘤綜合治療療效提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),我們還將研究其與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤作用機(jī)制，為以后其臨床應(yīng)用提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(收稿：2016-02-23)

The inhibitory effect of Apatinib on the growth of triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 in vitro Department of First Internal Medicine, Shaanxi Province Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Li Xu An Gaili Huang Shangke et al

Objective: To investigate the effect of Apatinib on the proliferation of triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 cells as well as the relevant underlying mechanism. Methods:MDA-MB-231 cells were treated with Apatinib at different concentration and different time, Cell growth inhibition was assessed by MTT, the apoptosis and cell cycle changes of the cells in response to apatinib treatment were observed by flow cytometry. Results:Apatinib significantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells in vitro, and the inhibition effects presented with time-and dose-dependent response. Apatinib treatment obviously increased the apoptotic rate of the MDA-MB-231cellsina time-dependent manner, and the difference has statistical significance compared with the control group; but produced no significant effect on the cell cycle. Conclusion: Apatinib inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells through inducing cell apoptosis.

Breast neoplasms/immunology Angiogenesis inhibitors MDA-MB-231 Cell proliferation Apoptosis

*陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015JM8394)

乳腺腫瘤/免疫學(xué) 血管生成抑制劑/治療應(yīng)用 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.002

陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(2014D15)

△陜西省人民醫(yī)院

▲西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

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