崔萌萌， 劉保生， 李彤彤， 段韶彤

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 河北省分析科學(xué)技術(shù)重點實驗室， 河北 保定 071002)

?

頭孢噻肟鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用的光譜特征

崔萌萌， 劉保生*， 李彤彤， 段韶彤

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 河北省分析科學(xué)技術(shù)重點實驗室， 河北 保定 071002)

將轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)的熒光變化作為研究對象，在298，310，318 K下采用紫外吸收、傳統(tǒng)熒光、同步熒光、圓二色譜法，對TRF與頭孢噻肟鈉(CEM)的結(jié)合進行綜合分析。數(shù)據(jù)處理和分析結(jié)果顯示：TRF的熒光伴隨CEM濃度的提高而呈現(xiàn)規(guī)律性猝滅，猝滅方式是靜態(tài)的。兩者借助靜電作用結(jié)合，反應(yīng)生成新物質(zhì)。結(jié)果的準(zhǔn)確性通過上述方法進行了驗證。此外，同步熒光和圓二色譜也表明CEM影響了TRF的構(gòu)象。

作用機制； 轉(zhuǎn)鐵蛋白； 光譜法； 頭孢噻肟鈉

1 引 言

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, TRF)是血漿蛋白質(zhì)的一類，相對分子量約為80 ku(kDa)，包含679個氨基酸殘基，這些氨基酸殘基排列在一對相似的結(jié)構(gòu)域，即N端和C端[1]。TRF受體能夠在許多癌細(xì)胞表面過度表達，因此TRF作為藥物載體能夠運輸多種配體，如金屬離子和藥物分子[2]。TRF的介導(dǎo)作用可促進藥物進入病變細(xì)胞，防止對未病變細(xì)胞的損傷，增強藥物的靶向性，因此TRF常用于研究藥物在機體的代謝和運輸過程[3]。白蛋白(SA)的研究較多，SA可用于判斷機體的營養(yǎng)情況且能快速體現(xiàn)營養(yǎng)檢測效果，然而SA在機體的半衰期較長，靈敏度差；TRF于肝處合成，半衰期不長，判斷營養(yǎng)狀況時TRF靈敏度高，故研究TRF具有醫(yī)學(xué)意義[4]。

頭孢噻肟鈉(Cefotaxime sodium,CEM)可用于治療大腦、皮膚、骨骼、胃、呼吸道、耳朵和尿路等的多種感染[5]。CEM是第三代頭孢類抗生菌素。早期的頭孢菌素不能滲透進中樞神經(jīng)系統(tǒng)，無法成功治療腦膜炎；然而第三代頭孢菌素能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此可以用于治療革蘭氏陰性菌引發(fā)的腦膜炎[6]。目前TRF的相關(guān)分析不多，沒有報道過與CEM的結(jié)合。本文借助傳統(tǒng)熒光猝滅、紫外吸收、同步熒光以及圓二色譜法來分析TRF、CEM間的作用機制，為以后相關(guān)的臨床用藥以及藥理作用帶來有價值的理論根據(jù)。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

儀器：RF-540熒光分光光度計和UV-265紫外可見分光光度計(島津公司)；MOS-450/SFM300圓二色譜儀(法國Bio-logic)；pHS-3C型精密酸度計(上海雷磁)；CS501超級恒溫水浴(南通科學(xué))。

試劑：TRF(Sigma公司)，純度≥98%，配成濃度為1.0×10-5mol/L的水溶液。CEM，純度≥98.5%，配成1.0×10-3mol/L的水溶液。Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.40，含有0.15 mol/L的NaCl用以維持生理條件下的離子強度。除標(biāo)注外的試劑均是分析純。實驗用水為二次石英蒸餾水。溶液均在4 ℃下避光保存。

熒光強度值按“內(nèi)濾光效應(yīng)”方程[7]校正：

(1)

其中，F(xiàn)cor和Fobs是校正后和測得的TRF-CEM體系熒光強度，Aex和Aem是CEM在激發(fā)和發(fā)射波長處的吸光度。

2.2 實驗過程

在多個5 mL比色管中順序加入0.5 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.5 mL 2.0×10-6mol/L的TRF以及不同濃度的CEM溶液，定容、搖勻、水浴恒溫在298 K下靜置40 min。激發(fā)波長(λex)為280 nm或295 nm，設(shè)置5 nm的狹縫寬度，掃描TRF-CEM體系的熒光光譜。固定波長差Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm，記錄TRF-CEM體系的同步熒光光譜。溫度分別設(shè)置在310 K和318 K下重復(fù)上述實驗。使用1 mm的石英吸收池，測定200～300 nm波長范圍內(nèi)TRF與CEM作用前后的CD譜。在一系列5 mL比色管中加入0.5 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL TRF(1.0×10-5mol/L)溶液及不同濃度的CEM溶液，用二次蒸餾水定容，靜置40 min待反應(yīng)完全。以對應(yīng)濃度的藥物溶液作參比，掃描各體系在190～350 nm的紫外光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 TRF-CEM體系的傳統(tǒng)熒光光譜及猝滅機理

圖1為CEM的分子結(jié)構(gòu)式，圖2為TRF-CEM體系的熒光發(fā)射光譜。

圖1 頭孢噻肟鈉的結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Chemical structure of CEM

CTRF=2.0×10-7mol/L； 1～10:CCEM= (0, 0.02, 0.4, 0.8, 2.0, 5.0, 8.0, 10, 12, 14)×10-5mol/L .

圖2 TRF-CEM體系的熒光發(fā)射光譜 (T=298 K,λex=280 nm)

Fig.2 Fluorescence emission spectra of TRF-CEM system (T=298 K,λex=280 nm)

隨著CEM溶液的加入以及濃度的增大，TRF的熒光逐漸發(fā)生猝滅，說明兩者發(fā)生了相互結(jié)合[8]。實驗數(shù)據(jù)借助斯特恩-沃爾默方程處理[9]：

(2)

方程中F0、F是TRF、TRF-CEM體系的熒光強度，τ0是分子熒光平均壽命(約10-8s)，KSV是猝滅常數(shù)，[L]是CEM的濃度，Kq是猝滅速率常數(shù)。數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表1。表1顯示，溫度升高則KSV變小，Kq值大于2.0×1010L·mol-1·s-1[10]，說明TRF的熒光猝滅主要是生成化合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅[11]。

表1 不同溫度下TRF與CEM的猝滅反應(yīng)參數(shù)

r1為方程F0/F～[L]的線性相關(guān)系數(shù)；r2為lg(F0-F)/F～lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的線性相關(guān)系數(shù)。

以F0/F對[L]作圖(圖3)，圖中顯示隨著CEM濃度的增大，3條斯特恩-沃爾默曲線均未偏向縱軸，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明不存在動態(tài)猝滅。若CEM濃度高時逐漸出現(xiàn)動態(tài)猝滅，則表現(xiàn)為曲線漸偏向縱軸[12]。同時，從298 K到310 K再到318 K，曲線斜率逐漸變小，即KSV變小，與表1所顯示的數(shù)據(jù)規(guī)律相吻合。

針對靜態(tài)猝滅，處理數(shù)據(jù)采用方程[13]：

lg(F0/F-1)=

(3)

可得到Ka(結(jié)合常數(shù))和n(結(jié)合位點數(shù))。方程中[L]、[Bt]各是CEM、TRF的總濃度。n值設(shè)為1，以lg(F0-F)/F～lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}作圖可得大括號外的n值，代入括號內(nèi)繼續(xù)作圖又可得到一個n值，再將得到的n代入括號內(nèi)，如此循環(huán)計算至括號內(nèi)外兩n值相同。得到的數(shù)據(jù)列于表1，從表中可得n值近似于1，說明結(jié)合位點只有一個。溫度降低則Ka值增大說明相互作用生成的復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度降低而增大，進而證明TRF-CEM反應(yīng)過程主要為靜態(tài)猝滅[14]。

CTRF=2.0×10-7mol/L；CCEM=(2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 12, 14)×10-5mol·L .

圖3 不同溫度下TRF-CEM體系的斯特恩-沃爾默曲線 (λex=280 nm)

Fig.3 Stern-Volmer plots of TRF-CEM system at different temperatures (λex=280 nm)

3.2 TRF-CEM體系的吸收光譜以及結(jié)合距離的分析

圖4為TRF-CEM體系的吸收光譜。從圖4可知，CEM溶液濃度增大則TRF吸光度降低，峰位置紅移。該現(xiàn)象表明TRF-CEM體系產(chǎn)生了新的化合物[15]。動態(tài)猝滅過程僅改變熒光分子的激發(fā)態(tài)而不會干擾其吸收譜圖，故CEM對TRF的猝滅是靜態(tài)猝滅[16]。

CTRF=2.0×10-6mol/L； 1～6：CCEM= (0, 0.4, 2.0, 4.0, 8.0, 10)×10-5mol/L .

圖4 TRF-CEM體系紫外吸收光譜圖 (T=298 K)
Fig.4 UV absorption spectra of TRF-CEM system (T=298 K)

依照福斯特能量轉(zhuǎn)移理論，TRF和CEM之間距離r、能量轉(zhuǎn)移效率E、臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0(對應(yīng)E=50%)三者的計算方程[17]為：

(4)

(5)

(6)

其中F0、F分別表示不加CEM、CEM濃度均為2×10-7mol/L時體系的熒光強度；Φ表示僅有TRF的熒光量子產(chǎn)率，取TRF中Trp (Tryptophan 色氨酸) 的量子產(chǎn)率0.118；N表示溶劑的折射率，取1.336；J是TRF的發(fā)射光譜與CEM的吸收光譜之間的重疊積分(圖5中陰影部分)；K2表示取向因子，取TRF和CEM各向隨機分布的平均值2/3；ε(λ)、F(λ)各表示λ處CEM的摩爾吸光系數(shù)和TRF的熒光強度。摩爾吸光系數(shù)和熒光強度值可借助圖5兩縱坐標(biāo)相互換算。在圖5陰影部分曲線1、2交點左側(cè)時，ε(λ)、F(λ)分別取曲線2對應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)和熒光強度值；在交點右側(cè)時，ε(λ)、F(λ)分別取曲線1對應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)和熒光強度值。將所取值代入方程(6) 中即可得J。借助上述3個方程，E、J、R0、r均可得到，列于表2。表2顯示：r<7 nm，證明TRF、CEM兩者間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移[18]；溫度降低時，E增大，r減小，TRF與CEM生成的化合物的穩(wěn)定性增大；r>R0，再次證明CEM、TRF間的反應(yīng)是靜態(tài)猝滅過程[16]。

圖5 CEM的紫外吸收光譜(1) 和TRF的熒光發(fā)射光譜(2) (T=298 K,λex=280 nm)

Fig.5 UV absorption spectra of CEM (1) and fluorescence emission spectra of TRF (2) (T=298 K,λex=280 nm)

表2 不同溫度下TRF與CEM間的E、J、r、R0參數(shù)

Tab.2 Parameters ofE,J,r,R0between TRF and CEM at different temper atures (λex=280 nm)

T/KE/%J/(cm3·L·mol-1)R0/nmr/nm2987.295.29×10-143.244.943105.495.77×10-143.285.273185.185.28×10-143.235.25

3.3 TRF-CEM體系的作用力分析

借助CEM和TRF相互結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)，可判斷TRF和CEM的作用力類型。ΔG、ΔS、ΔH間的關(guān)系方程[19]為：

(7)

(8)

利用方程(7)、(8)計算熱力學(xué)參數(shù)，列于表3。表中ΔG<0、ΔS>0證明TRF和CEM的反應(yīng)是熵變大、自由能變小的自發(fā)反應(yīng)。ΔH<0、ΔS>0證明TRF與CEM作用力類型主要是靜電引力[19]。

表3 不同溫度下TRF-CEM體系的熱力學(xué)參數(shù)(λex=280,295 nm)

3.4 TRF-CEM體系的同步熒光光譜

關(guān)于TRF的同步熒光譜圖，Δλ=15 nm時體現(xiàn)酪氨酸(Tyr)殘基的熒光變化，Δλ=60 nm時體現(xiàn)色氨酸(Trp)殘基的熒光變化[20]。TRF-CEM體系的同步熒光光譜見圖6。Δλ=15 nm時，熒光發(fā)生輕微猝滅和紅移；Δλ=60 nm時，熒光發(fā)生明顯猝滅和紅移。該現(xiàn)象說明只有少量的Tyr參加反應(yīng)，而參加反應(yīng)的主要是Trp。峰位置移動說明TRF、CEM的相互作用致使Trp和Tyr所在微環(huán)境的極性變大，疏水性減小，肽鏈變得松散，進而改變了TRF的構(gòu)象[20]。

CTRF=2.0×10-7mol/L; 1～10:CCEM= (0, 0.4, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 14)×10-5mol/L .

圖6 TRF-CEM體系的同步熒光光譜 (T=298 K)。 (a) Δλ=15 nm; (b)Δλ=60 nm。

Fig.6 Fluorescence spectra of TRF-CEM system (T=298 K). (a) Δλ=15 nm. (b)Δλ=60 nm.

3.5 藥物協(xié)同性

TRF和CEM結(jié)合的協(xié)同性可借助Hill方程[21]中的nH來進行分析：

(9)

其中，nH代表Hill系數(shù)，K代表結(jié)合常數(shù)，Y代表反應(yīng)飽和分?jǐn)?shù)。

(10)

熒光數(shù)據(jù)處理時：

(11)

其中，1/Qm是1/Q～1/[L]作圖所得的截距。將TRF-CEM體系的熒光強度值F代入方程，逐步計算得到相應(yīng)的Hill系數(shù)值，如表4所示。在不同溫度下，λex=280 nm和295 nm時nH都近似于1，說明CEM、 TRF的相互作用不會促進也不會抑制后繼配體與TRF的作用，即表現(xiàn)為無協(xié)同作用[14]。

表4 不同溫度下TRF-CEM體系的Hill系數(shù)nH(λex=280,295 nm)

Tab.4 Hill coefficient of TRF-CEM systems at different temperatures(λex=280, 295 nm)

T/Kλex=280nmλex=295nmnHr3nHr42981.050.99800.960.99363101.010.98681.020.98553181.030.98511.020.9922

r3、r4為方程lg[Y/(1-Y)]～lg[L]的線性相關(guān)系數(shù)。

3.6 TRF-CEM體系的圓二色譜分析

圓二色譜(CD)可用以顯示蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。圖7是TRF-CEM結(jié)合的CD圖。211 nm與219 nm附近各存在一個特征峰，為α螺旋的特征峰。CCEM∶CTRF分別為20∶1、30∶1時，負(fù)峰高度降低，其位置與形狀均無變化，由此顯示：α螺旋變松進而致使TRF熒光猝滅，CEM的存在改變了TRF的構(gòu)象，然而α螺旋依然是其主要結(jié)構(gòu)形式[16]。

CTRF=2.0×10-6mol/L;CCEM=(4.0, 6.0) ×10-5mol/L .

圖7 TRF-CEM體系的圓二色譜圖

Fig.7 Circular dichroism spectra of TRF-CEM system (T=298 K)

4 結(jié) 論

在TRF和CEM的結(jié)合中，r<7 nm，表明該過程存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。CD圖顯示CEM影響了TRF的二級結(jié)構(gòu)，致使熒光強度降低，兩者的反應(yīng)對后繼配體的反應(yīng)不存在促進或抑制的作用。TRF與CEM的結(jié)合常數(shù)Ka顯示兩者能相互結(jié)合。熱力學(xué)參數(shù)顯示TRF、CEM的作用依靠靜電引力。CEM能被TRF運輸，借助血液循環(huán)到達作用部位。本研究能對理解藥物在機體的分布、轉(zhuǎn)運過程和作用機理提供幫助，對抗感染藥物的特定篩選提供參考。

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崔萌萌(1989-),女，山東東營人，碩士研究生，2013年于濟寧學(xué)院獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用的研究。

E-mail: 1286023098@qq.com劉保生(1963-)，男，河北保定人，碩士，研究員，1992年于河北大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用的研究。

E-mail: lbs@hbu.edu.cn

Spectral Properties of The Interaction Between Transferrin and Cefotaxime Sodium

CUI Meng-meng, LIU Bao-sheng*, LI Tong-tong, DUAN Shao-tong

(KeyLaboratoryofAnalyticalScienceandTechnologyofHebeiProvince,CollegeofChemistry&EnvironmentalScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The interaction between transferrin (TRF) and cefotaxime sodium (CEM) at different temperatures (298, 310 and 318 K) was studied by using UV absorption spectroscopy, traditional fluorescence spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy. The experiment results indicate that the fluorescence of TRF is regularly quenched with the addition of CEM. The quenching pattern is static. TRF and CEM are combined by electrostatic interaction, and new compound forms during the process. These different methods verify the accuracy and rationality of the results. In addition, synchronous fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy both show the conformation of TRF is influenced by CEM.

interaction mechanism; transferrin; spectroscopy; cefotaxime sodium

1000-7032(2016)11-1415-07

2016-05-10；

2016-06-17

國家自然科學(xué)基金(21375032)資助項目

O657.3

A

10.3788/fgxb20163711.1415

*CorrespondingAuthor,E-mail:lbs@hbu.edu.cn