張怡，王玉*，班立桐，黃亮，鄭志廣，肖月梅

（天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津300384）

白色金針菇搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

張怡，王玉*，班立桐，黃亮，鄭志廣，肖月梅

（天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津300384）

以菌絲球干質(zhì)量、密度、直徑為考察指標，利用單因素試驗和L9(34)正交試驗對白色金針菇搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適搖瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10 g/L、紅糖13 g/L、黃豆粉3 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。在此條件下，白色金針菇菌絲球干質(zhì)量達到15.48 g/L，菌絲球密度66.48個/mL，菌絲球直徑為1.45 mm。

白色金針菇；搖瓶發(fā)酵；培養(yǎng)基優(yōu)化

白色金針菇（Flammulina velutipes）是一種低溫型、經(jīng)濟價值很高的優(yōu)質(zhì)食用菌，其菇體乳白鮮嫩，菌柄絨毛少，口感較好，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。我國白色金針菇的生產(chǎn)大多利用空調(diào)、通風設(shè)備等在廠房中進行工廠化全年生產(chǎn)，傳統(tǒng)的食用菌菌種擴繁為母種、原種、栽培種三級固體菌種擴繁方式，存在生長周期長、菌齡不一致、成本高、管理過程繁雜等缺點[3]，而液體菌種具有生長周期短、出菇整齊、工藝簡便、易規(guī)模生產(chǎn)、成本低廉、效率高等優(yōu)勢[4-5]。

本試驗通過單因素試驗及正交試驗確定白色金針菇搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方，為白色金針菇液體發(fā)酵工廠化生產(chǎn)過程的控制提供相關(guān)的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

白色金針菇（Flammulina velutipes）T-011：天津濱海德盛農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基[6]：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

種子、液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，VB10.01 g/L。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：秦皇島鵬遠淀粉有限公司；瓊脂、蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硫酸鎂：天津市化學試劑三廠；氫氧化鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇（體積分數(shù)為95%）：天津市風船化學試劑科技有限公司；乳糖：天津市奧淇醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司；麥芽糖：新興化工試劑研究所；紅糖：北塘區(qū)博零食尚食品商行；尿素：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；麥麩：市售；黃豆粉：北大荒集團；玉米漿：上海方畦儀器有限公司。所有化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

BSP-250恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；GIX-GF101-1-S-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱：上海賀德實驗設(shè)備有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 菌種活化[7-8]

將白色金針菇菌種塊（1.5～2.0 cm2）接種到斜面培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)至滿管，挑取菌絲粗壯、濃密、無污染的菌種4℃條件下冷藏備用。

1.3.2 白色金針菇液體菌種生長曲線的測定

將0.5 cm24塊活化的白色金針菇菌塊置于裝液量為100mL/250mL液體發(fā)酵基中，25℃靜置24h，25℃、120r/min繼續(xù)培養(yǎng)至200 h，定時取樣，分別測量液體菌種的菌絲球干質(zhì)量、密度、直徑等指標，確定白色金針菇生長狀態(tài)。

1.3.3 種子液的制備

將0.5cm24～5塊活化的白色金針菇菌塊接種于裝液量為100mL/250mL種子培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)24h，25℃、120 r/min繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3.4 白色金針菇搖瓶液體菌種的制備

裝液量為100 mL/250 mL，接種量10%，25℃靜置24 h，25℃、120 r/min繼續(xù)培養(yǎng)120 h。

1.3.5 白色金針菇液體發(fā)酵最適碳源的篩選

分別考察添加量為20 g/L的葡萄糖、紅糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖，搖床（25℃、120 r/min）培養(yǎng)7 d后，檢測菌絲球干質(zhì)量、密度和直徑，確定最適碳源。

1.3.6 白色金針菇液體發(fā)酵最適氮源的篩選

分別考察添加量為5 g/L蛋白胨、牛肉浸粉、尿素、麥麩、酵母膏、黃豆粉、玉米漿，搖床（25℃、120 r/min）培養(yǎng)7 d后，檢測菌絲球干質(zhì)量、密度和直徑，確定最適氮源。

1.3.7 白色金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗[9]

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用L9（34）正交設(shè)計，以菌絲球干質(zhì)量為評價指標，對葡萄糖（A）、紅糖（B）、黃豆粉（C）含量進一步優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.8 指標檢測方法[10]

（1）菌絲球干質(zhì)量測定方法

取一定體積發(fā)酵培養(yǎng)液，80目篩網(wǎng)過濾得到菌絲球，蒸餾水洗滌2次，于80℃烘干至恒質(zhì)量。

（2）菌絲球密度檢測方法

1 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中菌絲球的數(shù)目即為菌絲球密度。

（3）菌絲球直徑檢測方法

取1 mL培養(yǎng)液置于皿中，隨機取至少10個菌絲球，將其緊密相連排成一線，用直尺測量其總長度，并計算菌絲球平均直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 白色金針菇液體菌種生長曲線的測定

將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基靜置24 h后，每24 h取樣，檢測菌絲球干質(zhì)量、密度和直徑，結(jié)果見圖1。

圖1 白色金針菇生長曲線Fig.1 Growth curve ofF.velutipes

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，白色金針菇液體菌種菌絲球干質(zhì)量也逐漸增大；72 h后菌體進入快速生長階段，192h時菌絲球干質(zhì)量達到最大值；192 h后，菌絲球逐漸變?yōu)槊扌鯛?，培養(yǎng)液黏度很大，導(dǎo)致溶氧不足，且由于養(yǎng)分減少，菌絲逐漸自溶，干質(zhì)量下降。菌絲球直徑隨著培養(yǎng)時間延長先增大后減小，菌絲球密度變化趨勢與直徑相反，菌球直徑變小而密度增加。液體菌種接種于栽培瓶后，菌絲球密度越大則生長點越多，且前期預(yù)實驗結(jié)果表明，直徑偏小的菌絲球在栽培料中萌發(fā)較快。本試驗與馬瑞霞等[11-12]的結(jié)果一致。結(jié)果表明，為保證菌絲球生長良好，確定液體發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)時培養(yǎng)120 h為宜。

2.2 白色金針菇液體發(fā)酵最適碳源的篩選

考察不同碳源（添加量均為20 g/L）對白色金針菇液體發(fā)酵生長的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同碳源對白色金針菇生長的影響Fig.2 Effects of different carbon sources onF.velutipes growth

由圖2可知，當碳源為紅糖時，菌絲球干質(zhì)量最大，菌絲球的密度和直徑僅次于碳源為葡萄糖的情況；當碳源為葡萄糖時，菌絲球的密度最大，直徑最小，而干質(zhì)量僅次于紅糖。本實驗與PANAGIOTA D等[13]的研究結(jié)果一致。由于紅糖價格較高，因此選擇紅糖和葡萄糖各10 g/L作為培養(yǎng)基碳源。

2.3 白色金針菇液體菌種最適氮源的篩選

考察不同氮源（添加量均為5 g/L）對白色金針菇液體發(fā)酵生長的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對白色金針菇生長的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources onF.velutipesgrowth

由圖3可知，以尿素為氮源時，培養(yǎng)基中僅有少量菌絲，無菌絲球產(chǎn)生，其余氮源均有菌絲球產(chǎn)生，可見無機氮源不利于白色金針菇的生長。菌絲球干質(zhì)量較高的氮源種類依次為黃豆粉、蛋白胨和麥麩，其中黃豆粉為氮源的菌絲球中混有少量未降解的黃豆粉原料。黃豆粉的菌絲球密度也最大，且明顯高于麥麩和蛋白胨，并且菌絲球直徑也最小。朱家騮等[14]的實驗表明最適氮源為麩皮或麩皮水。本研究認為由于麥麩（麩皮）在使用前需先煮沸取上清液，工序復(fù)雜不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，選擇黃豆粉為最適氮源。

2.4 白色金針菇液體菌種最適培養(yǎng)基的正交試驗

由于無機鹽與維生素對金針菇菌絲生長影響較小[15]，所以本研究以菌絲干質(zhì)量為評價指標，利用L9（33）正交設(shè)計對白色金針菇液體菌種培養(yǎng)基的主要成分進行了優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，通過極差比較，各因素對白色金針菇液體發(fā)酵菌絲產(chǎn)量的影響由小到大順序為：紅糖＞黃豆粉＞葡萄糖。培養(yǎng)基配方最優(yōu)組合為A2B3C2，即最適搖瓶培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖10 g/L、紅糖13 g/L、黃豆粉5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。在此最佳培養(yǎng)基配方條件下進行驗證試驗，白色金針菇液體發(fā)酵菌絲干質(zhì)量可達到15.48g/L，菌絲球密度66.48個/mL，菌絲球直徑1.45mm。由表3可知，葡萄糖、紅糖和黃豆粉對白色金針菇液體發(fā)酵菌絲產(chǎn)量均有顯著影響（P＜0.05），其中紅糖含量有極顯著影響（P＜0.01）。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由于表2中沒有最優(yōu)組合為A2B3C2，因此進行驗證實驗，結(jié)果表明，在最適培養(yǎng)基配方中，白色金針菇液體發(fā)酵菌絲干質(zhì)量可達到15.48g/L，菌絲球密度66.48個/mL，菌絲球直徑1.45mm。優(yōu)化后的白色金針菇液體菌種菌絲球干質(zhì)量大、密度大、直徑小、且大小均一，較之初始配方干質(zhì)量和密度分別提高了90.88%、89.50%，各項指標明顯提高。

3 結(jié)論

通過對白色金針菇液體菌種生長曲線的測定，確定發(fā)酵養(yǎng)時間為靜置24 h后，培養(yǎng)72 h。利用單因素試驗確定最適碳源、氮源分別為葡萄糖、紅糖，黃豆粉。通過正交試驗確定二級搖瓶培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 g/L、紅糖13 g/L、黃豆粉5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。優(yōu)化后的白色金針菇液體菌種菌絲球干質(zhì)量大、密度大、直徑小、且大小均一，較未優(yōu)化培養(yǎng)基干質(zhì)量和密度分別提高了90.88%、89.50%。

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Optimization of shaking flask fermentation medium ofFlammulina velutipes

ZHANG Yi,WANG Yu*,BAN Litong,HUANG Liang,ZHEN Zhiguang,XIAO Yuemei
(College of Agronomy&Resources and Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384,China)

Using the dry mass,density and diameter of mycelia as the evaluation indexes,the shaking flask medium ofFlammulina velutipeswas optimized by single factor experiments and L9(34)orthogonal experiments.The results showed that the optimum shaking flask medium formula were glucose 10 g/L,brown sugar 13 g/L,soybean meal 3 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.5 g/L,VB10.01 g/L.Under the conditions,the dry mass,density and diameter of mycelia were 15.48 g/L,66.48 unit/mL and 1.45 mm,respectively.

Flammulina velutipes;shake flask fermentation;medium optimization

S646.1

0254-5071（2016）11-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.028

2016-06-26

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目（201303010）；東麗區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專項資金產(chǎn)學研合作項目（2014001）

張怡（1985-），女，實驗師，碩士，主要從事食用菌方面的研究工作。

*通訊作者：王玉（1980-），女，副教授，碩士，主要從事食用菌方面的研究工作。