齊 倩，胡曉琳

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·論著·

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良的關(guān)系研究

齊 倩，胡曉琳

目的 探討谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的關(guān)系。方法 選取2010年3月—2013年12月在武漢市第三醫(yī)院新生兒科及華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)住院的患有BPD的早產(chǎn)兒60例為BPD組(其中男38例，女22例)，及同期入住華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院NICU無肺部疾病的早產(chǎn)兒99例為對照組(其中男63例，女36例)。釆用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測GSTP1基因多態(tài)性。結(jié)果 兩組GSTP1基因型頻率均符合Hardy-Weinbery平衡，具有群體代表性。兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 GSTP1基因多態(tài)性與BPD易感性無關(guān)。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1；支氣管肺發(fā)育不良；多態(tài)性，單核苷酸；疾病易感性

齊倩，胡曉琳.谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(34)：4213-4215.[www.chinagp.net]

QI Q,HU X L.Relationship of gene polymorphisms of glutathione S-transferase P1 and bronchopulmonary dysplasia[J].Chinese General Practice，2016，19(34)：4213-4215.

支氣管肺發(fā)育不良(BPD)常見于早產(chǎn)兒，特別是胎齡小的早產(chǎn)兒。由于其對早產(chǎn)兒的存活率影響較大，目前已成為全球新生兒學(xué)研究的熱門課題。BPD可由包括遺傳易感性、氧中毒、氣壓傷/容量傷和感染/炎癥在內(nèi)的多種因素誘發(fā)，各種因素導(dǎo)致的活性氧水平上升，進(jìn)而引起細(xì)胞氧化損傷是其主要的病理學(xué)機(jī)制之一，而人體內(nèi)的抗氧化酶可減少活性氧并調(diào)節(jié)炎癥瀑布，從而為機(jī)體提供一定的保護(hù)作用[1]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶系(GSTs)是一個(gè)Ⅱ相反應(yīng)代謝的超家族酶系，其在肺部抗氧化過程中起重要作用。研究表明，GSTs的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與其酶的活性密切相關(guān)。其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)亞群的第5外顯子存在SNP位點(diǎn)(A/G)，密碼子編碼的是纈氨酸(val)或異亮氨酸(ile)，而氨基酸序列的改變影響了酶的活性。研究顯示105val形式比105ile形式清除活性氧的效率高，且105ile是多種呼吸道疾病的易患基因[2-4]。鑒于GSTs廣泛的抗氧化效應(yīng)，而GSTP1基因多態(tài)性與BPD的相關(guān)性在國內(nèi)還罕見報(bào)道，故設(shè)計(jì)本研究旨在探討二者間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年3月—2013年12月在武漢市第三醫(yī)院新生兒科及華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)住院的患有BPD的早產(chǎn)兒60例為BPD組，其中男38例，女22例；出生體質(zhì)量1.10～1.70 kg，平均(1.30±0.22)kg；胎齡28～32周，平均(30.1±1.9)周。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；(2)出生后持續(xù)用氧超過28 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形、膈疝、呼吸系統(tǒng)畸形、嚴(yán)重先天性心臟病(室間隔缺損、房間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉)、染色體異常等致死性先天畸形者。另外選取同期入住華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院NICU無肺部疾病的早產(chǎn)兒99例為對照組，其中男63例，女36例；出生體質(zhì)量1.10～2.00 kg，平均(1.37±0.20)kg；胎齡28～32周，平均(30.5±1.7)周。兩組性別(χ2=0.002，P=0.969)、出生體質(zhì)量(t=2.060，P=0.401)和胎齡(t=1.370，P=0.460)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測GSTP1基因多態(tài)性。采集兩組患兒靜脈血2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用基因組DNA試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)有限公司，中國)提取DNA。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。GSTP1上游引物：5′-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3′，下游引物：5′-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3′，片段長度：433 bp。PCR反應(yīng)體系20 μl：含10 μl 2×PCR Plus Mix(DBI公司)，1 μl DNA模板，上下游引物各0.5 μl，二次蒸餾水(ddH2O)8 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃再延伸4 min。PCR產(chǎn)物7 μl，加入限制性核酸內(nèi)切酶Alw26I(Fermentas公司，加拿大)11 μl，磷酸鹽緩沖液(PBS)2 μl，總反應(yīng)體系20 μl。置于37 ℃水浴中消化2 h。消化完畢后取8 μl酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠加樣孔內(nèi)，80 mA電泳30 min，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。隨機(jī)取上述PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證PCR-RFLP的準(zhǔn)確性和特異性。

2 結(jié)果

2.1GSTP1基因PCR-RFLP檢測結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到GSTP1基因PCR產(chǎn)物，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Alw26I切后，其純合野生型(AA)的PCR產(chǎn)物被水解為329bp和104bp兩個(gè)片段；由于A→G變異導(dǎo)致一個(gè)新的酶切位點(diǎn)形成，故GSTP1基因純合變異型(GG)的PCR產(chǎn)物被水解為222bp、107bp和104bp3個(gè)片段；而其雜合型(AG)的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后則水解為329bp、222bp、107bp、104bp4個(gè)片段。由于107bp和104bp不易區(qū)分，因此在顯色后表現(xiàn)為1個(gè)條帶(見圖1)。

2.2 兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較 兩組GSTP1基因型頻率均符合Hardy-Weinbery平衡，具有群體代表性。兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.3 兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較 兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

注：1、2、4、5、9為AA基因型，3、6、10為GG基因型，7、8為AG基因型；GSTP1=谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1

表1 兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較〔n(%)〕

注：GSTP1=谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1，BPD=支氣管肺發(fā)育不良

表2 兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較〔n(%)〕

3 討論

BPD的本質(zhì)是在遺傳易感性基礎(chǔ)上由各種有害環(huán)境因素對不成熟肺造成損傷，以及損傷后的異常修復(fù)過程所致[5]。在BPD長達(dá)數(shù)十年的發(fā)病機(jī)制研究中，肺氧中毒被確定為重要致病因素之一，由其導(dǎo)致的過量活性氧可氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或DNA，進(jìn)而損傷肺部組織細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[6]。有報(bào)道證實(shí)患BPD的早產(chǎn)兒臍血中過氧化物的含量較未患BPD的患兒明顯增多[7]；而早產(chǎn)兒缺乏抗氧化能力也是過氧化物造成肺損傷的主要原因之一[8]。

GSTs可催化谷胱甘肽(GSH)的巰基與過氧化物的結(jié)合，從而保護(hù)DNA及一些蛋白質(zhì)免受氧化損傷。GSTs主要分為alpha(α)、mu(μ)、pi(π)、theta(θ)和sigma(σ)五類水溶性GSTs，另外還有一類是脂溶性的微粒體同工酶。其中GSTP1在肺臟中含量最高，尤其多分布于肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡、呼吸性細(xì)支氣管等肺臟外周部位[9]。GSTP1編碼序列中第5外顯子內(nèi)的105位氨基酸殘基位于其酶蛋白的疏水性底物結(jié)合部點(diǎn)(H-site)，在這一位點(diǎn)上發(fā)生氨基酸殘基的替換將會(huì)改變酶分子的空間構(gòu)象，進(jìn)而影響酶與親電子底物結(jié)合的特異性、穩(wěn)定性及催化活性，并改變蛋白酶的抗氧化能力[10]。所以GSTP1第5外顯子基因多態(tài)性可能是肺組織抗氧化防御能力個(gè)體差異的分子遺傳基礎(chǔ)之一。在非裔美國人的研究中，發(fā)現(xiàn)GSTP1 105ile是BPD的易患基因[11]。試管內(nèi)的研究證實(shí)了105val的解毒效率高于105ile[12]。另有相關(guān)研究報(bào)道，105ile增加哮喘和特異反應(yīng)性疾病的易感性[13]。本研究結(jié)果顯示，兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間均無差異，同時(shí)考慮到BPD在男性患兒中多見，所以將兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)一步比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組男性間亦無差異。說明GSTP1基因多態(tài)性與BPD易感性無關(guān)，分析原因可能為等位基因A在各種族中分布頻率不同，基因易患性可能存在種族差異[14]。

BPD的發(fā)病原因較為復(fù)雜，且有多種病理學(xué)改變。單一基因與疾病的相關(guān)性鑒定起來非常困難。本課題組將進(jìn)一步針對肺部氧化-抗氧化機(jī)制中的其他抗氧化酶進(jìn)行多態(tài)性研究，并探索多態(tài)性位點(diǎn)間的相互作用。目前BPD的預(yù)防和治療效果進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期，如能識(shí)別其“高?；颉保M(jìn)行有針對的預(yù)防和治療，將使BPD的防治得到突破。

作者貢獻(xiàn)：齊倩進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫論文并對文章負(fù)責(zé)；胡曉琳進(jìn)行資料及部分樣本的收集。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔沙沙)

Relationship of Gene Polymorphisms of Glutathione S-Transferase P1 and Bronchopulmonary Dysplasia

QIQian,HUXiao-lin.

DepartmentofPediatrics,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:QIQian,DepartmentofPediatrics,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,China;E-mail:125956514@qq.com

Objective To investigate the relationship of gene polymorphisms of glutathione S-transferase P1(GSTP1) and bronchopulmonary dysplasia.Methods 60 hospitalized premature infants with BPD in Neonatology Department in Wuhan Third Hospital,and Neonatal Intensive Care Unit(NICU) of Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology from March 2010 to December 2013 were selected as BPD group(38 boys,22 girls),and 99 hospitalized premature infants without pulmonary disease in NICU of Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology at the same period were enrolled as control group(63 boys,36 girls).The gene polymorphism of GSTP1 was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Results The genotype frequencies of GSTP1,with representativeness of the groups,were consistent with Hardy-Weinbery equilibrium.There was no significant difference in genotype frequency and allele frequency of GSTP1 between the two groups(P>0.05).There was no significant difference in genotype frequency and allele frequency of GSTP1 genotype between males in the two groups(P>0.05).Conclusion The gene polymorphism of GSTP1 is not associated with the susceptibility BPD.

Glutathione S-transferase P1;Bronchopulmonary dysplasia;Polymorphism,single nucleotide;Disease susceptibility

430060湖北省武漢市第三醫(yī)院兒科(齊倩)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科(胡曉琳)

齊倩，430060湖北省武漢市第三醫(yī)院兒科；

E-mail：125956514@qq.com

R 726.553

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.34.013

2016-07-07；

2016-10-25)