王瀟霖，遲象陽，劉炬，劉威岑，劉樹玲，邱順芳，溫中華，范鵬飛，劉坤，宋小紅，付玲，張軍，于長明

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

利用轉(zhuǎn)基因小鼠篩選全人源炭疽致死因子中和抗體

王瀟霖，遲象陽，劉炬，劉威岑，劉樹玲，邱順芳，溫中華，范鵬飛，劉坤，宋小紅，付玲，張軍，于長明

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

王瀟霖, 遲象陽, 劉炬, 等. 利用轉(zhuǎn)基因小鼠篩選全人源炭疽致死因子中和抗體. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(11): 1590-1599.

Wang XL, Chi XY, Liu J, et al. Screening of full human anthrax lethal factor neutralizing antibody in transgenic mice. Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1590-1599.

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病。炭疽毒素包括3種蛋白質(zhì)成分：保護(hù)性抗原 (PA)、致死因子 (LF) 和水腫因子 (EF)。PA與LF形成致死毒素 (LT)，與EF形成水腫毒素 (ET)。由于致死毒素 (LT) 在感染者損傷及死亡中發(fā)揮主要作用，因此在炭疽感染晚期單純使用抗生素治療難以發(fā)揮療效，治療性中和抗體成為目前最有效的炭疽治療藥物。目前國外獲得的炭疽毒素抗體多為炭疽PA抗體，美國FDA已批準(zhǔn)瑞西巴庫 (人源PA單抗) 用于吸入性炭疽的治療。一旦炭疽芽孢桿菌被人為改構(gòu)或PA中和表位發(fā)生突變，針對PA單一表位的抗體將可能失效，因此針對LF的抗體將成為炭疽治療的有效補(bǔ)充。目前國外已有的LF抗體多為鼠源抗體和嵌合抗體，而全人源抗體可以避免鼠源抗體免疫原性高等缺點(diǎn)。本研究首先用LF抗原免疫人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，利用流式細(xì)胞儀從小鼠脾淋巴細(xì)胞中分選抗原特異的記憶B細(xì)胞，通過單細(xì)胞PCR方法快速獲得兩株具有結(jié)合活性的抗LF單抗1D7和2B9。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Expi 293F細(xì)胞制備抗體，通過毒素中和實(shí)驗(yàn) (TNA) 發(fā)現(xiàn)1D7和2B9在細(xì)胞模型中均顯示較好的中和活性，并且與PA單抗聯(lián)合使用時(shí)，表現(xiàn)出較好的協(xié)同作用?？傊?，本文利用轉(zhuǎn)基因小鼠、流式分選技術(shù)和單細(xì)胞PCR技術(shù)的優(yōu)勢，快速篩選到全人源LF抗體，為快速篩選全人源單克隆抗體開辟了新的思路與方法。

炭疽致死因子，轉(zhuǎn)基因小鼠，流式分選，記憶B細(xì)胞，單細(xì)胞PCR，全人源單克隆抗體

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的嚴(yán)重威脅人類健康的乙類傳染病[1]。依據(jù)感染途徑不同，將炭疽分為皮膚炭疽、胃腸炭疽和肺炭疽3種類型。肺炭疽致死率高達(dá)90%[2]，我國將其按甲類傳染病進(jìn)行預(yù)防和控制。美軍將炭疽芽孢桿菌列為A類生物劑[3]，因此炭疽防控是防生和反恐的重要研究目標(biāo)。

炭疽毒素包括3種蛋白質(zhì)成分：保護(hù)性抗原PA、致死因子LF和水腫因子EF。它們的作用機(jī)理是：PA和細(xì)胞膜上的炭疽毒素受體結(jié)合后被細(xì)胞膜上的Furin蛋白酶水解成PA63，PA63形成七聚體再與LF形成致死毒素LT或與EF結(jié)合形成水腫毒素ET，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，從而發(fā)揮毒性作用[4-5]。

炭疽的治療策略主要有兩類：一類是抗生素，但抗生素只對敏感的炭疽芽孢桿菌有效，對體內(nèi)的炭疽毒素?zé)o效，因此必須早期使用。另一類是治療性抗體，治療性抗體對耐藥的炭疽芽孢桿菌有效[6]，而且可以中和體內(nèi)的炭疽毒素，在出現(xiàn)癥狀后能明顯提高存活率；而且致死毒素 (LT) 在炭疽感染者損傷甚至死亡中發(fā)揮著主要作用，這也是炭疽感染晚期單純使用抗生素治療難以發(fā)揮療效的原因。因此，治療性抗體是目前最有效的炭疽治療藥物[7-8]。

目前國外獲得的炭疽毒素抗體多為炭疽PA抗體[9]，美國FDA已批準(zhǔn)瑞西巴庫 (人源PA單抗) 用于吸入性炭疽的治療[10]，但一旦炭疽芽孢桿菌被人為改構(gòu)或PA中和表位發(fā)生突變，針對PA單一表位的抗體將可能失效。研究顯示當(dāng)炭疽LF抗體與PA抗體聯(lián)合使用時(shí)會產(chǎn)生一定的協(xié)同作用[16-18]，抗體混合物可以識別多個(gè)毒素蛋白上的不同表位，提高治療效果，這對“雞尾酒療法”也奠定了基礎(chǔ)。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的LF抗體多為鼠抗和嵌合抗體[11-15]，由于鼠源性較高應(yīng)用到人體易引起人抗鼠抗體反應(yīng) (HAMA) 從而很難應(yīng)用于臨床。因此，研究全人源炭疽LF抗體具有重要的軍事意義和社會意義。

隨著PCR技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和抗體庫技術(shù)的不斷發(fā)展，單克隆抗體由鼠源性單抗、嵌合型單抗逐漸被人源化單抗和全人源單抗取代[19]。全人源抗體避免了鼠源抗體免疫原性高等缺點(diǎn)，因此得到了廣泛的應(yīng)用。由于LF抗原不是已批準(zhǔn)的疫苗組分，因此不能直接用于免疫志愿者從而獲得人抗體基因；而人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠克服了無疫苗免疫或病患血樣等缺點(diǎn)，可用于抗原免疫后來篩選特異性的全人源單克隆抗體[20]，采用流式分選和單細(xì)胞PCR技術(shù)可以快速獲得抗體基因[21-22]。

本課題的創(chuàng)新點(diǎn)在于建立了基于轉(zhuǎn)基因小鼠、流式分選技術(shù)和單細(xì)胞PCR技術(shù)相結(jié)合的人源抗體快速篩選體系，不僅快速獲得了全人源炭疽LF單克隆抗體，也為快速篩選其他全人源單克隆抗體開辟了新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK 293T人胚腎細(xì)胞、Expi 293F細(xì)胞、J774A.1小鼠單核巨噬細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA-H質(zhì)粒、pcDNA-κ質(zhì)粒、pcDNA3.4載體、rLF甘油凍存菌為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存；rPA蛋白由本實(shí)驗(yàn)室前期制備并保存；6?8周齡普通C57BL/6雄性小鼠由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；6?8周齡雄性C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠由山東國際生物科技園提供；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；MEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、FBS、ExpiFectamine?293 Transfection Kit購自Gibco公司；ELISA板購自Thermo Nunc公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 rLF的制備

將rLF甘油凍存菌復(fù)蘇于3 mL LB中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，按1∶20轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)4 h，再按1∶100轉(zhuǎn)接于1 L 新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6左右。加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L，28 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)5 h。4 ℃、8 000×g離心10 min收集菌體，沉淀用高滲溶液 (20%蔗糖，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris，pH 8.0) 重懸，冰上靜置5 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，收上清。再將沉淀用低滲溶液 (0.1 mmol/L MgCl2) 重懸，冰上靜置10 min，12 000×g離心10 min，收上清，將兩次上清混合。經(jīng)過CHT柱和Source 30Q柱(GE，Healthcare公司) 兩步純化，用10 kDa的超濾管 (購自Millipore公司) 濃縮并換液至PBS，pH 7.4。目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照后用Image J軟件分析蛋白純度。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫

初次免疫，rLF按1∶1加入弗式完全佐劑混合，攪拌乳化，20 μg/只腹腔皮下注射，免疫5只轉(zhuǎn)基因小鼠，設(shè)置C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對照組。第二、三次免疫分別于第2、4周加強(qiáng)免疫，20 μg/只rLF按1∶1加入弗式非完全佐劑混合。其中3只轉(zhuǎn)基因小鼠和3只C57BL/6小鼠分別在免疫后4、7、14、21、28、35、42、56、70、91和112 d采血。剩下2只用于分選的轉(zhuǎn)基因小鼠在免疫前及免疫后7、14、28和42 d采血。間接ELISA法檢測血清抗體效價(jià)，TNA法檢測血清中和抗體水平。選擇血清效價(jià)最高轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行分選。

1.2.3 流式分選及單細(xì)胞PCR

第3次免疫14 d后取轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟，研磨制備脾細(xì)胞懸液。EZ-Link Sulfo-NHS-LCBiotin (購自Thermo公司) 標(biāo)記rLF，根據(jù)說明書計(jì)算標(biāo)記一定rLF時(shí)需要生物素的量，將二者混勻后在冰上靜置2 h，待用。脾細(xì)胞懸液中加入PE-anti mouse CD3、FITC-anti mouse CD19、PE/cy7-anti mouse CD27熒光標(biāo)記抗體(購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司) 以及生物素標(biāo)記的抗原LF。使用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀分選單個(gè)抗原特異的記憶B細(xì)胞于96孔板中 (購自Bio-rad公司)，96孔板中事先每孔加入20 μL無RNA酶水 (購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)和20 U RNA酶抑制劑 (購自Promega公司)。單細(xì)胞打入96孔板后，迅速放入-80 ℃冰箱待用。

采用單細(xì)胞 PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體基因 (具體步驟參考文獻(xiàn)[23])。One-step反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒 (購自QIAGEN公司) 進(jìn)行RT-PCR，獲取雙鏈cDNA。以單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物為模板，采用 TransStart Taq DNA聚合酶 (購自北京全式金生物技術(shù)有限公司) 分別對抗體的VH和VL進(jìn)行單細(xì)胞巢式PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，VH/L配對基因測序后，Vector NTI、IMGT/V-QUEST對序列進(jìn)行分析。

1.2.4 構(gòu)建線性表達(dá)框快速表達(dá)抗體基因

以H/K鏈配對成功的單細(xì)胞巢式PCR產(chǎn)物為模板，再次擴(kuò)增可變區(qū)基因，將可變區(qū)兩端加入重疊延伸PCR所需的基因接頭 (具體步驟參考文獻(xiàn)[23])。TransStart Taq DNA聚合酶擴(kuò)增啟動(dòng)子-前導(dǎo)序 (CMV-UP) 片段、恒定區(qū)-多聚A尾 (TK-POLYA) 片段。以CMV-UP、TK-POLYA和可變區(qū)片段為模板，經(jīng)重疊延伸PCR獲得全長抗體重鏈和輕鏈的線性表達(dá)框基因。對目的片段進(jìn)行切膠純化 (膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司)，使用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑 (購自Thermo Fermentas公司)，將配對的全長IgH/L鏈基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)上清貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 LF結(jié)合單抗的ELISA篩選

LF、抗人IgG抗體 (購自BD公司) 2 μg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃放置過夜。PBST洗96孔酶標(biāo)板，3%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，PBST洗96孔酶標(biāo)板。加入線性表達(dá)框轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清表達(dá)液，37 ℃溫育1 h。PBST洗4遍后，加入二抗HRP標(biāo)記的羊抗人IgG (購自Sigma公司)，37 ℃溫育1 h。PBST洗4遍，加入顯色液，顯色15 min，2 mol/L硫酸終止。用酶標(biāo)儀以630 nm為參考波長，檢測450 nm波長處的吸光值。

1.2.6 LF單抗表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與純化

全長IgH/L鏈PCR產(chǎn)物和pcDNA載體用EcoRⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶 (購自NEB公司)酶切，使用T4 DNA連接酶 (購自NEB公司)，將抗體重鏈和輕鏈抗體全長基因分別克隆至pcDNA載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài) (購自天根生化科技有限公司)，單菌落PCR鑒定陽性克隆。重、輕鏈pcDNA表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞。8 000×g離心15 min收細(xì)胞上清，Protein A親和層析柱純化抗體蛋白 (購自GE Healthcare 公司)。BCA protein assay kit (購自Thermo 公司) 測定抗體濃度。

1.2.7 BIACORE測定抗體親和力

Biacore T100檢測rLF與LF抗體之間相互作用，采用直接偶聯(lián)法，anti-human IgG Fc偶聯(lián)在CM5芯片上，捕獲抗LF抗體，LF抗原為流動(dòng)相，檢測二者的相互作用，得出動(dòng)力學(xué)親和力數(shù)據(jù)。

1.2.8 LF中和單抗的體外中和活性TNA測定

采用細(xì)胞模型的毒素中和實(shí)驗(yàn) (TNA) 對抗體中和活性進(jìn)行測定。J774A.1小鼠單核巨噬細(xì)胞以每孔4×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。終濃度50 ng/mL的rPA和20 ng/mL的rLF的毒素加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，首孔加入100 μg/mL單抗，對倍稀釋，每個(gè)樣品設(shè)置10個(gè)稀釋度，設(shè)置死亡對照和存活對照孔，37 ℃孵育1 h。加入96孔J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃溫箱培養(yǎng)4 h。每孔100 μL1 mg/mL MTT (購自Sigma公司) 替換細(xì)胞培養(yǎng)上清，37 ℃溫箱培養(yǎng)1 h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入100 μL MTT溶解液。待完全溶解后，酶標(biāo)儀以630 nm為參考波長，檢測570 nm波長處的吸光值。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞存活百分比，GraphPad Prism 5擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算抗體的IC50。

1.2.9 LF中和性單抗與PA單抗體外協(xié)同作用的TNA測定

按照1.2.8的方法進(jìn)行TNA測定，但改變加入的抗體量。1D7和2B9分別與炭疽PA單抗2A6組合，每種組合設(shè)置4種濃度梯度的樣品，分別為：1D7、2B9抗體從100 μg/mL二倍梯度稀釋；2A6抗體從1 μg/mL二倍梯度稀釋；1D7、2B9抗體從100 μg/mL二倍梯度稀釋，2A6抗體濃度保持不變；2A6抗體從1 μg/mL二倍梯度稀釋，1D7、2B9抗體濃度保持不變，其中抗體保持恒定的濃度低于每株中和單抗IC50值。最后根據(jù)TNA測定結(jié)果，擬合抗體濃度和細(xì)胞存活曲線。

圖1 LF純化效果的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAEG analysis of LF purification. 1: marker; 2: the fraction collection of Source 30Q and CHT. The position of LF protein band was marked with an arrow.

2 結(jié)果與分析

2.1 rLF抗原的純度及活性測定

目的蛋白經(jīng)過CHT柱和Source 30Q柱兩步層析純化，目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳 (圖1)。目的蛋白純度約96%，可以用于動(dòng)物免疫。細(xì)胞毒性試驗(yàn)測定LF的蛋白活性，本試驗(yàn)固定PA的濃度，把LF的濃度做二倍比例梯度稀釋后一起作用于J774A. 1細(xì)胞。當(dāng)PA為50 ng/mL時(shí)，可導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的LF濃度 (EC50) 為4.223 ng/mL (圖2)。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的LF在細(xì)胞模型上具有良好的生物學(xué)活性。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠免疫LF后的抗體反應(yīng)研究

免疫后小鼠在不同天數(shù)采血，對比不同時(shí)間點(diǎn)兩種小鼠血清中抗體效價(jià)水平的變化(圖3)。轉(zhuǎn)基因小鼠抗體效價(jià)水平與C57BL/6小鼠存在差別，轉(zhuǎn)基因小鼠免疫抗原后抗體效價(jià)上升速度比C57BL/6小鼠緩慢；C57BL/6小鼠三免后，血清中抗體效價(jià)達(dá)到1∶10 000以上，轉(zhuǎn)基因小鼠三免后，抗體效價(jià)只達(dá)到1∶6 000左右，低于C57BL/6小鼠效價(jià)水平。TNA檢測2只轉(zhuǎn)基因小鼠血清中LF中和抗體水平 (圖4)。選擇效價(jià)相對較高的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行分選。

2.3 LF特異性單克隆抗體的篩選及鑒定

取第三次免疫后14 d的轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟，研磨獲取脾淋巴細(xì)胞。熒光抗體染色后，使用流式細(xì)胞儀從脾淋巴細(xì)胞中分選出288個(gè)抗原特異的記憶B細(xì)胞。經(jīng)單細(xì)胞PCR，從288個(gè)記憶B細(xì)胞中獲得48對重、輕鏈配對的抗體可變區(qū)基因。通過重疊延伸PCR，構(gòu)建線性表達(dá)框，將48對全長抗體基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行快速表達(dá)。轉(zhuǎn)染上清用于ELISA檢測，獲得結(jié)合單抗2株，分別為1D7和2B9。通過Vector NTI、IMGT/V-QUEST對其基因序列分析，兩對基因序列均為人源抗體，與胚系基因相似性達(dá)98%以上 (表1)。

圖2 LF的細(xì)胞毒活性Fig. 2 Cytotoxicity of LF. J774 macrophages were incubated with 50 ng/mL PA and LF concentration were titrated 1:2 from 20 ng/mL.

圖3 抗體效價(jià)時(shí)間變化對比圖Fig. 3 Serum antibody titers comparison at different time points. Mice were immunized with LF on day 0, 14 and 28. The horizontal axis represents the blood sampling time. Normal: C57BL/6 mice; Trans: transgenic mice.

圖4 免疫六周血清中LF中和抗體效價(jià)Fig. 4 MTT cell viability assay to measure protective ability of 6-week sera on J774 macrophage cells against LeTx. LF: transgenic mice immunized with LF; Pre: preimmune transgenic mice.

構(gòu)建LF單克隆抗體表達(dá)質(zhì)粒，瞬轉(zhuǎn)293F細(xì)胞，目的蛋白經(jīng)過Protein A親和層析柱純化。ELISA法對兩株LF單抗結(jié)合能力進(jìn)行測定(圖5)，1D7結(jié)合能力大于2B9。為進(jìn)一步研究兩株抗體的結(jié)合特性，采用SPR技術(shù)測定抗體親和力大小 (表2)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn) (TNA) 對LF單抗中和活性進(jìn)行測定 (圖6)。1D7和2B9的IC50值為別為：11.97 μg/mL和49.91 μg/mL，1D7比2B9中和活性要強(qiáng)。

表1 2株LF結(jié)合單抗的特性Table 1 Characteristics of the 2 LF-specific human monoclonal antibodies

圖5 ELISA測定LF單克隆抗體結(jié)合能力Fig. 5 Relative binding capacity of IgG MAbs to LF as determined by ELISA. The ELISA plate was coated with 2 μg/mL LF, and MAbs concentration were titrated 1:2 from 100 μg/mL.

表2 兩株LF人源單抗親和力測定Table 2 Binding affinities of the 2 LF-specific human monoclonal antibodies

圖6 TNA法測定LF單克隆抗體中和活性Fig. 6 Protective efficacy of LF-specific MAbs by TNA. In vitro cytotoxicity assay to measure MAb-mediated toxin protection. J774 macrophages were incubated with 50 ng/mL PA and 20 ng/mL LF with or without MAbs at various concentrations. Cells were incubated with toxin alone or toxin-free medium as negative and positive controls, respectively, for viability.

2.4 LF中和性單抗與PA中和性單抗的協(xié)同作用研究

在50 ng/mL PA 和 20 ng/mL LF下測定炭疽PA單克隆抗體2A6的IC50值是0.05 μg/mL，保持毒素濃度不變情況下，測定1D7、2B9分別與2A6聯(lián)合使用在TNA實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞保護(hù)效果(圖7)，使用藥效學(xué)參數(shù)分級抑制濃度指數(shù) (FIC index) 進(jìn)行評價(jià) (表3)。當(dāng)FIC＜1時(shí)，為協(xié)同作用；FIC=1時(shí)，為相加作用；1＜FIC＜2時(shí)，為無關(guān)作用；FIC>2時(shí)，為拮抗作用。結(jié)果顯示，1D7和2A6的FIC指數(shù)為0.67，2B9和2A6的FIC指數(shù)為0.73。表明兩種抗體存在一定的協(xié)同作用，且1D7和2A6的組合協(xié)同作用更強(qiáng)。

圖7 中和抗體聯(lián)合使用的細(xì)胞保護(hù)效果Fig. 7 Combinatory effects of protective MAbs in TNA. (A) Cell survival assay of 1D7 and 2A6 in combination. Cells were incubated with 50 ng/mL PA and 20 ng/mL LF and 0.05 μg/mL of the 2A6 MAb and titrated 1:2 with the 1D7 starting with 100 μg/mL. (B) Cell survival assay of 2B9 and 2A6 in combination. Cells were incubated with 50 ng/mL PA and 20 ng/mL LF and 0.05 μg/mL of the 2A6 MAb and titrated 1:2 with the 2B9 starting with 100 μg/mL. (C) Cell survival assay of 1D7 and 2A6 in combination. Cells were incubated with 50 ng/mL PA and 20 ng/mL LF and 10 μg/mL of the 1D7 MAb and titrated 1:2 with the 2A6 starting with 1 μg/mL. (D) Cell survival assay of 2B9 and 2A6 in combination. Cells were incubated with 50 ng/mL PA and 20 ng/mL LF and 40 μg/mL of the 2B9 MAb and titrated 1:2 with the 2A6 starting with 1 μg/mL.

表3 中和抗體聯(lián)合使用的FIC指數(shù)Table 3 FIC indices for multiple Mab interactions

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，治療性單抗得到廣泛應(yīng)用。單克隆抗體根據(jù)人源化程度分為鼠源性單克隆抗體、嵌合型單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人單克隆抗體。伴隨PCR技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和抗體庫技術(shù)的發(fā)展，使治療性單克隆抗體最終實(shí)現(xiàn)了全人源抗體的制備。本文將人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠與單細(xì)胞PCR技術(shù)相結(jié)合，用于快速篩選全人源單克隆抗體，此研究內(nèi)容為日后進(jìn)行單克隆抗體的篩選工作提供了新的方法和思路。該方法的優(yōu)勢在于獲得的全人源抗體避免了鼠源抗體免疫原性高等特點(diǎn)、克服了無疫苗免疫和病患血樣的缺點(diǎn)、并且可以快速獲得抗體基因。但轉(zhuǎn)基因小鼠目前也存在一些問題：轉(zhuǎn)基因小鼠對免疫應(yīng)答能力較差，對于一些抗原較難獲得高親和力抗體；未轉(zhuǎn)入人類全部抗體基因座，抗體在體內(nèi)的成熟過程還不太理想[24]。因此，本文對轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫特點(diǎn)進(jìn)行了研究，為獲得較好的免疫效果，可以增加轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫劑量、免疫次數(shù)并延長免疫周期。

雖然兩株抗體親和力不高，但經(jīng)過序列比對，無論1D7還是2B9均為全人源單克隆抗體，避免了鼠源抗體免疫原性高等特點(diǎn)。在下一階段研究中，可以通過人為突變提高抗體親和力，完善抗體在體外親和力的成熟過程。

目前，針對炭疽毒素的單克隆抗體多為炭疽PA抗體，而LF直接導(dǎo)致感染者損傷和死亡。PA本身是沒有毒性的，它主要是將LF帶入細(xì)胞，發(fā)揮毒性作用。一旦PA中和表位人為突變，針對PA單一表位的抗體將不再有效，因此有必要對炭疽LF抗體進(jìn)行篩選與研究。

在炭疽“雞尾酒”療法中提到炭疽PA單抗與LF單抗聯(lián)合使用時(shí)可以發(fā)揮一定的協(xié)同作用。當(dāng)1D7、2B9分別與2A6聯(lián)合使用時(shí)，其FIC指數(shù)均在0.5?1之間。雖然協(xié)同作用較弱，但卻比單獨(dú)使用某一抗體起到的保護(hù)效果更強(qiáng)。單抗在治療和預(yù)防感染性疾病中雖發(fā)揮著重要作用，但當(dāng)病原體抗原突變概率高或毒性機(jī)制較為復(fù)雜時(shí)，單抗混合物可以識別多個(gè)毒素蛋白上的不同表位，發(fā)揮出顯著地治療效果，這也為進(jìn)一步研究單抗“雞尾酒療法”奠定了基礎(chǔ)。

在分選脾淋巴細(xì)胞時(shí)，為了避免分選漿細(xì)胞而增加后期的篩選量?？紤]到記憶B細(xì)胞表面存在BCR受體這一特性，嘗試分選抗原特異的記憶B細(xì)胞，抗原特異的記憶B洗胞在B淋巴細(xì)胞中的比例很少[25]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，記憶B細(xì)胞在最后一次免疫第14天到21天之間，抗原特異的記憶B細(xì)胞數(shù)量相對較多，適合進(jìn)行分選。為提高抗體分選的陽性率，可進(jìn)一步研究B細(xì)胞表面特異BCR隨時(shí)間的表達(dá)情況，進(jìn)而探索記憶B細(xì)胞的最佳分選時(shí)間。

總之，本課題旨在探究一種新的單抗篩選方法，結(jié)合轉(zhuǎn)基因小鼠與單細(xì)胞PCR技術(shù)的優(yōu)勢，為快速獲得全人源單克隆抗體開辟了新的思路與方法。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

January 21, 2016; Accepted: March 23, 2016

s: Changming Yu. Tel: +86-10-66948692; E-mail: yuchangming@126.com

Screening of full human anthrax lethal factor neutralizing antibody in transgenic mice

Xiaolin Wang, Xiangyang Chi, Ju Liu, Weicen Liu, Shuling Liu, Shunfang Qiu, Zhonghua Wen, Pengfei Fan, Kun Liu, Xiaohong Song, Ling Fu, Jun Zhang, and Changming Yu
Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical, Beijing 100071, China

Anthrax is a highly lethal infectious disease caused by the spore-forming bacterium Bacillus anthracis. The major virulence factor of B. anthracis consists of protective antigen (PA), lethal factor (LF) and edema factor (EF). PA binds with LF to form lethal toxin (LT), and PA binds with EF to form edema toxin (ET). Antibiotics is hard to work in advanced anthrax infections, because injuries and deaths of the infected are mainly caused by lethal toxin (LT). Thus, the therapeutic neutralizing antibody is the most effective treatment of anthrax. Currently most of the anthrax toxin antibodies are monoclonal antibodies (MAbs) for PA and US FDA has approved ABTHRAX humanized PA monoclonal antibody for the treatment of inhalational anthrax. Once B. anthracis was artificially reconstructed or PA had mutations within recognized neutralization epitopes, anti-PA MAbs would no longer be effective. Therefore, anti-LF MAbs is an important supplement for anthrax treatment. Most of the anti-LF antibodies are murine or chimeric antibodies. By contrast, fully human MAbs can avoid the high immunogenicity of murine antibodies. First, we used LF to immunize the transgenic mice and used fluorescent cell sorting to get antigen-specific memory B cells from transgenic mice spleen lymphocytes. By single cell PCR method, we quickly found two strains of anti-LF MAbs with binding activity, 1D7 and 2B9. Transiently transfected Expi 293F cells to obtain MAbs protein after purification. Both 1D7 and 2B9 efficiently neutralized LT in vitro, and had good synergistic effect when mixed with anti-PA MAbs. In summary, combining the advantages of transgenic mice, fluorescent cell sorting and single-cell PCR methods, this study shows new ideas and methods for the rapid screening of fully human monoclonal antibodies.

anthrax lethal factor, transgenic mice, fluorescent cell sorting, memory B cells, single cell PCR, fully human MAbs

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81172980), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA021407).

Jun Zhang. Tel: +86-10-66948864; E-mail: justforhere@126.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 81172980)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2014AA021407) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160425.0932.001.html