余萌，曹帥帥，鄭偉楠，賈瀟瀟，李晶，劉文軍,3

1 中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049

3 安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230039

生物技術與方法

不同亞型流感病毒NS1蛋白的細胞定位差異分析

余萌1,2，曹帥帥1,3，鄭偉楠1，賈瀟瀟1，李晶1，劉文軍1,2,3

1 中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049

3 安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230039

余萌, 曹帥帥, 鄭偉楠, 等. 不同亞型流感病毒NS1蛋白的細胞定位差異分析. 生物工程學報, 2016, 32(11): 1600-1609.

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NS1蛋白是流感病毒編碼的一種小分子多功能蛋白，可在病毒的復制過程中抑制宿主細胞的抗病毒免疫應答。為研究不同亞型流感病毒的NS1蛋白在細胞內(nèi)的定位差異，分別用H1N1亞型WSN、PR8和CA04毒株，H9N2亞型SD毒株及H7N9亞型AH01毒株感染A549、MDCK細胞系以及構(gòu)建的可表達不同亞型流感病毒NS1蛋白的pCMV-Myc-NS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同亞型流感病毒在不同細胞系和時間點的定位差異，感染后24 h時WSN和PR8毒株的NS1主要定位于細胞質(zhì)中，而CA04和SD毒株主要定位于細胞核內(nèi)。另外，觀察過表達的WSN、SD和AH01毒株NS1的細胞定位，轉(zhuǎn)染后24 h時WSN毒株NS1定位于細胞質(zhì)中，而SD和AH01毒株主要定位于細胞核中。經(jīng)氨基酸序列比對，對WSN毒株NS1蛋白進行關鍵氨基酸點突變，結(jié)果顯示單一位點的改變未導致NS1蛋白細胞定位的改變，其細胞定位的差異不是由單一位點決定的。綜上所述，分析不同亞型中的NS1的定位差異，這對進一步了解NS1 蛋白同宿主細胞不同區(qū)域的蛋白的相互作用、流感病毒的調(diào)節(jié)機制以及病毒感染細胞中天然免疫反應具有一定的指導意義。

流感病毒，NS1蛋白，細胞定位，氨基酸位點突變

流感病毒屬于正黏病毒科，其中A型流感病毒基因組由8節(jié)段的負鏈單股RNA組成，編碼17種蛋白。該病毒的感染能夠引起多種宿主因子發(fā)生變化，從而引起宿主細胞的各種生理生化反應，如炎癥反應、細胞形態(tài)變化以及信號轉(zhuǎn)導通路抑制或激活等[1]，最近流行的H7N9和H5N6亞型流感，均由A型流感病毒引起，給人類帶來了嚴重危害[2-3]。在流感病毒感染周期中，許多宿主因子蛋白通過多個途徑抑制病毒復制和調(diào)控細胞凋亡，以減少病毒對宿主的損傷。而流感病毒能夠產(chǎn)生多種機制來應對這種抗病毒免疫反應，NS1蛋白是流感病毒編碼的一個重要毒力蛋白，以抵抗宿主細胞的免疫反應[4-6]。

NS1由病毒基因組第8段RNA編碼，由2個獨立的功能域所組成[7-8]，即N端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (第1?73位氨基酸)，可與多種類型的RNA以低親和力的方式結(jié)合；C端的“效應”區(qū)域 (第87?230位氨基酸)，主要與宿主細胞蛋白質(zhì)相互作用，同時穩(wěn)定與RNA結(jié)構(gòu)域的作用，抑制宿主細胞的免疫反應。

NS1蛋白是一種多功能蛋白，一方面可抑制宿主天然免疫系統(tǒng)對病毒復制的抑制，另一方面又可調(diào)節(jié)病毒RNA的合成及提高病毒mRNA的翻譯水平[9-11]。NS1蛋白在細胞中的不同定位可與不同的宿主蛋白發(fā)生相互作用，從而發(fā)揮不同的功能，NS1蛋白包含有2個入核定位信號NLS和1個出核信號NES。有報道稱NS1在病毒復制的早期定位到細胞核中，在復制的后期出核，主要定位在細胞質(zhì)中[12]。NS1在細胞核內(nèi)主要與CPSF30、PAPB Ⅱ相互作用，抑制宿主自身的mRNA后加工修飾[13]，而在細胞質(zhì)中，NS1可與RIG-I、TRIM25結(jié)合[14-16]，抑制干擾素的產(chǎn)生。

為了探究H1N1亞型流感病毒的復制和傳播機制以及其毒力和致病機理，發(fā)現(xiàn)引起不同流感病毒毒力差異的因素，我們分析了不同亞型流感病毒NS1蛋白的細胞定位情況，旨在研究細胞定位情況是否與不同流感毒株的毒力存在相關性，并且這種細胞定位情況是否與某個關鍵氨基酸位點的作用相關。

1 材料與方法

1.1 細胞株及病毒株

流感病毒A/WSN/33 (H1N1) (以下簡稱為WSN)、A/H1N1/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (以下簡稱為PR8)、A/California/04/2009 (H1N1) (以下簡稱為CA04)、A/Shandong/lx1023/2007 (H9N2) (以下簡稱為SD)，A/Anhui/1/2013 (H7N9) (以下簡稱為AH01)，由本實驗室繁殖、傳代并保存。293T細胞系、A549細胞系及MDCK細胞系，由本實驗室傳代并保存。

1.2 載體及菌株

大腸桿菌TOP10由本實驗室保存；載體pCMV-Myc，不同亞型的pCMV-Myc-NS1質(zhì)粒，表達流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)的4個表達質(zhì)粒Ben9、Ben10、Ben11、Ben13，均由本實驗室構(gòu)建及保存。

1.3 主要試劑

用于構(gòu)建克隆的各種工具酶均購自TaKaRa公司；點突變試劑盒由北京諾派生物科技有限公司惠贈；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；TRITC標記羊抗兔IgG購自康為世紀公司；Trizol購自Invitrogen公司；TritonX-100購自Amreso公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipo-2000、普通胰酶、蛋白酶抑制劑和TPCK處理的胰酶購自羅氏公司；Myc鼠單、抗AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；兔抗NS1多克隆抗體由本實驗室制備保存；多聚甲醛、BSA和DAPI購自Sigma-Aldrich公司。所有引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.4 NS1表達載體及點突變克隆的構(gòu)建

取流感病毒A/WSN/33的十二質(zhì)粒系統(tǒng)中的第8片段為模板，用P1/P2一對引物 (表1)，進行PCR擴增獲得NS1基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切，與酶切后的pCMV-Myc載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測序確認獲得重組質(zhì)粒。

同時，設計特異性的點突變引物 (表1)，以此引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物SDM 37 ℃酶切2 h后轉(zhuǎn)化SDM感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測序確認獲得重組質(zhì)粒。

1.5 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與病毒感染

293T、A549、MDCK細胞在含有10%胎牛血清和加入10 000 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2。將生長密度為80%的細胞傳代至細胞培養(yǎng)皿中，待其生長密度為60%-80%時，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1?2 h，為細胞更換新鮮的OPTI-MEM培養(yǎng)基。采用Lipo-2000為轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)實驗需要，轉(zhuǎn)染不同劑量的質(zhì)粒于293T細胞中。轉(zhuǎn)染后4?6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染并收取細胞。病毒感染實驗在細胞傳代24 h后，將病毒 (MOI=0.01) 加入病毒感染液中 (DMEM、10 000 U/mL經(jīng)青霉素和鏈霉素、1 μg/mL TPCK處理的胰酶)，感染后1 h為細胞換液為病毒感染液，在合適的時間點收取并固定細胞。

表1 克隆NS1基因以及NS1突變體的引物Table 1 Primers for cloning of NS1 and detection of NS1 mutation by PCR

1.6 Western blotting鑒定NS1兔多抗的有效性

293T細胞傳代至6 cm培養(yǎng)皿，分別用以上5種毒株NS片段為模板構(gòu)建的pCMV-Myc-NS1轉(zhuǎn)染細胞，8 μg/皿，轉(zhuǎn)染后24 h用細胞裂解液(150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (Hepes)，1 mmol/L EDTA，1% TritonX-100，10%甘油，蛋白酶抑制劑) 收取細胞，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心15 min，吸取上清中加入10×上樣緩沖液，95 ℃處理樣品10 min，SDS-PAGE電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用TBST配制含1% BSA，5%脫脂牛奶的封閉液，室溫封閉2 h，分別用一抗NS1兔多抗(1∶5 000) 和Myc鼠單抗 (1∶2 000) 對蛋白進行檢測。內(nèi)參β-actin鼠單抗 (1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，15 min/次。二抗羊抗兔，羊抗鼠，稀釋比例均為1∶5 000，室溫孵育1 h，TBST洗3次，15 min/次。使用底物顯色試劑盒進行曝光顯影。

1.7 免疫熒光檢測NS1的細胞定位

傳代293T細胞至鋪有玻片的24孔板中，用MOI=0.01的病毒感染細胞，或?qū)?.8 μg/孔pCMV-Myc-NS1轉(zhuǎn)染細胞，在感染或轉(zhuǎn)染后不同時間點收取細胞。使用4%的多聚甲醛室溫固定細胞30 min，然后利用含有4% BSA的PBST (PBS中加入0.5% TritonX-100) 37 ℃封閉1 h。加入1∶200的兔抗NS1多抗 (實驗室自制) 作為一抗，37 ℃結(jié)合1 h，PBST清洗細胞5次，每次10 min。然后加入1∶200的熒光二抗TRITC標記抗兔IgG抗體，37 ℃結(jié)合1 h；PBST清洗5次，每次10 min。加入DAPI室溫染色10 min，PBST清洗3次。然后用封片液 (50%甘油，50% PBS) 封片，以指甲油固定玻片。激光共聚焦顯微鏡觀察NS1在細胞中的定位情況。

圖1 NS1兔多抗對于不同毒株NS1蛋白的有效性檢測Fig. 1 Identification of anti-NS1 polyclonal antibody on different strains of influenza A virus. 293T cells were transfected by pCMV-Myc-NS1 which came from different strains template. Further the NS1 protein was detected by Western blotting using anti-Myc monoclonal antibody (A) and anti-NS1 polyclonal antibody (B) respectively.

2 結(jié)果與分析

2.1 WSN-NS1兔多抗對于不同亞型NS1蛋白均有檢測效果

不同毒株構(gòu)建的pCMV-Myc-NS1克隆在293T細胞中進行表達，分別用NS1兔多抗和Myc鼠單抗對蛋白進行檢測 (圖1)，Myc鼠單抗檢測組 (圖1A) 在25 kDa左右處均有明顯條帶，與預期NS1大小相符，其中CA04-NS1相較于其他毒株分子量略小，與實驗結(jié)果吻合，未轉(zhuǎn)染對照相應位置無條帶；NS1兔多抗檢測組 (圖1B) 在25 kDa左右處也有明顯條帶，與Myc檢測組一致，但在WSN-NS1及PR8-NS1中各出現(xiàn)一條非特異性條帶，推測與毒株差異相關。結(jié)果顯示本實驗中所用NS1兔多抗對于不同亞型毒株NS1蛋白均有檢測能力。

2.2 不同亞型病毒感染A549細胞系NS1蛋白定位不同

將WSN、PR8、CA04、SD四株流感病毒MOI=0.01感染A549細胞，在感染后的6、12和24 h分別固定樣品，制片后激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果如圖2所示，WSN、PR8毒株在感染后的6 h、12 h，NS1蛋白主要定位于細胞核中，而在感染后的24 h蛋白出核，主要定位于細胞質(zhì)中；而CA04和SD毒株在感染后的3個時間點其NS1蛋白均主要定位于細胞核中，與前兩株毒株存在明顯的差異。

2.3 不同亞型病毒感染MDCK細胞系NS1蛋白定位差異

為了進一步觀察這種定位差異是否也存在于其他細胞系中，我們用WSN、PR8、CA04三株流感病毒以相同MOI (MOI=0.01) 分別感染MDCK細胞，在感染后的6、12和24 h后收樣并制片，后用激光共聚焦顯微鏡觀察。如圖3所示，WSN、PR8感染MDCK后的6 h、12 h，NS1蛋白也主要定位于細胞核中；同樣的感染后24 h NS1蛋白出核，主要定位于細胞質(zhì)中；而CA04在感染后3個時間點NS1蛋白都主要定位于細胞核內(nèi)。

結(jié)果顯示，病毒感染后不同時間點NS1蛋白定位存在差異，這種差異有可能導致了NS1蛋白在不同病毒感染中發(fā)揮了不同的功能，這也可能在一定程度上解釋了不同亞型的流感病毒的毒力、宿主的適應能力和致病性的不同。

圖2 感染不同亞型流感病毒的A549細胞中不同時間點的NS1蛋白定位情況Fig. 2 Location of NS1 of the different subtype influenza A virus in A549 by different time point. A549 cells were infected by influenza virus WSN, PR8, CA04, and SD respectively. At 6, 12, and 24 h, cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and followed by detection with immunofluorescence assay. Bars=10 μm.

圖3 感染不同亞型流感病毒的MDCK細胞中不同時間點的NS1蛋白定位情況Fig. 3 Location of NS1 of the different subtype influenza A virus in MDCK by different time point. MDCK cells were infected by influenza virus WSN, PR8, and CA04 respectively. At 6, 12, and 24 h, cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and followed by detection with immunofluorescence assay. Bars=10 μm.

2.4 pCMV-Myc-NS1轉(zhuǎn)染293T細胞NS1蛋白差異性定位

將質(zhì)粒pCMV-Myc-NS1 (WSN、CA04、PR8、SD、AH01) 0.8 μg/孔，分別轉(zhuǎn)染293T細胞中，轉(zhuǎn)染后6、12和24 h后分別取出玻片固定后制片，后觀察檢測NS1蛋白的細胞定位。如圖4所示，在轉(zhuǎn)染情況下不同毒株NS1定位上的差異仍然存在，轉(zhuǎn)染后24 h WSN、PR8主要位于細胞質(zhì)而CA04、SD主要定位于核內(nèi)，與病毒感染的結(jié)果一致。

同時我們也構(gòu)建了H7N9亞型毒株AH01-NS1的質(zhì)粒，結(jié)果顯示AH01的NS1在轉(zhuǎn)染的后期也主要定位在細胞核中。NS1蛋白定位在細胞核內(nèi)，主要抑制了宿主自身蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工修飾和出核，引起宿主的多種蛋白表達下調(diào)，包括多種參與免疫應答的抗病毒免疫蛋白，這也可能與H7N9流感的致死性有較強關聯(lián)。

圖4 不同亞型流感毒株轉(zhuǎn)染293T細胞后NS1蛋白定位情況Fig. 4 Location of NS1 of the different subtype influenza A virus in 293T by transfection. 293T cells were transfected by pCMV-Myc-WSN-NS1, pCMVMyc-SD-NS1, and pCMV-Myc-AH01-NS1 respectively. At 36 h, cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and followed by detection with immunofluorescence assay. Bars=10 μm.

圖5 不同亞型毒株的NS1蛋白序列比對分析Fig. 5 Analysis of sequence alignment of different subtype strains of NS1 protein.

2.5 不同亞型毒株的NS1蛋白序列比對分析

為了了解這種蛋白定位的差異是否與不同亞型毒株自身的NS1蛋白特性相關，我們比對并分析了上述5種毒株的NS1蛋白序列。圖5結(jié)果顯示，NS1蛋白的氨基酸序列在不同亞型毒株之間的保守性較差。根據(jù)圖5的比對結(jié)果，我們選取了關鍵差異性位點，在WSN-NS1的序列上分別是：V22、M81、A86、D139、T197、S205和N207，根據(jù)這些位點設計引物構(gòu)建點突變克隆 (表1)。具體突變?nèi)缦拢篤22F、M81I、A86S、A86E、D139N、T197N、S205E、S205N和N207D。

2.6 關鍵氨基酸位點突變后NS1蛋白的細胞定位差異

以pCMV-Myc-WSN-NS1為模板，獲得各點突變體的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染293T細胞，在感染后24 h收集細胞固定并制片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察NS1蛋白的細胞定位，結(jié)果如圖6所示。各突變體的NS1蛋白與野生型相比，并未發(fā)生明顯定位差異，轉(zhuǎn)染后24 h均主要定位于細胞質(zhì)中，結(jié)果表明，在所選取的位點中單個氨基酸位點的改變并不能導致NS1定位的明顯差異。NS1是一種重要的毒力因子，受到宿主免疫系統(tǒng)進化的巨大壓力，只有在多個位點的協(xié)調(diào)作用下才有可能發(fā)生某些功能的改變，具體哪些位點可以協(xié)同發(fā)揮作用來改變其蛋白定位，將是我們下一步工作的重點。

圖6 關鍵氨基酸位點突變后NS1蛋白的細胞定位情況Fig. 6 Location of NS1 protein of key amino acid mutation. Bars=10 μm.

3 討論

近年來，A型流感病毒嚴重危害人類健康并造成巨大的經(jīng)濟損失和社會負擔，H1N1亞型流感病毒等變異毒株成為研究人員熱點關注的領域。2013年首次爆發(fā)的H7N9亞型流感病毒為跨種間的傳播，且其重要的獨立因子NS1蛋白的細胞定位與WSN存在明顯的差異，NS1蛋白可能在其跨種間傳播和致病機制上發(fā)揮了重要作用[17-18]。

NS1蛋白的細胞內(nèi)定位方式及NS1的分布很可與多種因素相關，如病毒株、細胞類型等。在病毒感染的細胞內(nèi)NS1優(yōu)先定位于細胞核，但在感染后期也會部分存在于細胞質(zhì)中[19]。

NS1的主要功能為參與病毒與宿主相互作用，包括蛋白與蛋白之間、蛋白與RNA之間的相互作用[20-21]。宿主為了抑制流感病毒的復制，被病毒感染的細胞通常會激活多種抗病毒反應。在進化的壓力下，流感病毒演變出多種機制來應對宿主細胞的抗病毒反應。NS1蛋白被認為是流感病毒抵制宿主細胞免疫反應的重要蛋白，且其主要功能是抑制宿主細胞干擾素的產(chǎn)生。

不同毒株的NS1蛋白序列長度不同，約在230-237氨基酸之間，相對分子量約為26 kDa。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，在20世紀40年代，流行的人H1N1病毒NS1蛋白序列通過單核苷酸的突變，在C末端出現(xiàn)了7個氨基酸的延伸。這些延伸在隨后的人H1N1、H2N2和H3N2病毒都存在；直到20世紀80年代，當H1N1和H3N2病毒通過回復突變，失去了多出來的7個氨基酸，并發(fā)生了共同流行。

在細胞核內(nèi)NS1蛋白可以與CPSF30、PABPⅡ相互作用來抑制宿主細胞mRNA的成熟和出核，在細胞質(zhì)中可以同更多的蛋白發(fā)生相互作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，NS1的C末端的最后幾個氨基酸同NS1與宿主蛋白如 PABPⅠ的相互作用以及NS1蛋白的核仁定位相關[22]。Burgui等[23]研究表明NS1同eIF4GⅠ、PABPⅠ的結(jié)合將翻譯所需的細胞因子募集到病毒mRNA附近，有效地提高了病毒蛋白的翻譯效率，隨后Haller及Kochs等[24-26]報道稱NS1同RIG-I、TRIM25等的相互作用，有效地抑制了IFN信號通路的激活，抑制了宿主免疫系統(tǒng)對病毒復制的免疫應答。這些結(jié)果表明，NS1蛋白是流感病毒抵制宿主細胞免疫反應的重要蛋白，抑制宿主細胞干擾素的產(chǎn)生。因此，NS1表現(xiàn)出多種抑制活性，對于病毒的復制和感染過程中毒力的提高起到了重要的促進作用。

研究表明，流感病毒在感染A549、MDCK細胞系時其NS1定位存在明顯的差異，這種差異不僅存在于不同的亞型病毒間；而且普遍存在于同一種亞型的不同毒株間。我們對NS1序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染的情況下，NS1的定位現(xiàn)象與感染一致。根據(jù)電荷差異和空間位阻的不同，本研究選取了其中的部分差異位點進行關鍵氨基酸位點的突變，其中幾個位點是潛在的磷酸化位點，如S205，除突變?yōu)镹外我們也將它突變?yōu)?E 模擬持續(xù)的磷酸化狀態(tài)[27]，但單獨的點突變都沒有導致WSN-NS1蛋白在細胞內(nèi)的定位發(fā)生明顯改變。分析結(jié)果認為，不同毒株間的NS1蛋白定位差異并不是由單一氨基酸位點所導致的。這些突變體的細胞定位與野生型病毒相比未發(fā)生改變，也許在其他方面能影響NS1蛋白的功能，如是否對干擾素活性存在抑制作用？是否由多位點協(xié)同影響其定位差異？某些宿主蛋白與 NS1的相互作用是否影響了NS1的細胞定位及抗天然免疫功能？這些問題需要下一步探究。

綜上所述，流感病毒的重要毒力因子NS1蛋白參與病毒與宿主相互作用，研究分析在不同亞型中的定位存在差異，這對進一步了解NS1蛋白同宿主細胞不同區(qū)域的蛋白的相互作用、流感病毒的調(diào)節(jié)機制以及病毒感染細胞中天然免疫反應具有一定的指導意義。

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(本文責編 陳宏宇)

January 27, 2016; Accepted: March 11, 2016

s: Jing Li. Tel/Fax: +86-10-64807503; E-mail: lj418@163.com Wenjun Liu. Tel: +86-10-64807497; Fax: +86-10-64807503; E-mail:liuwj@im.ac.com

Comparison of cellular localization of NS1 from different subtypes of influenza A virus

Meng Yu1,2, Shuaishuai Cao1,3, Weinan Zheng1, Xiaoxiao Jia1, Jing Li1, and Wenjun Liu1,2,3
1 Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230039, Anhui, China

The non-structural (NS1) protein is a multifunctional molecular protein encoded by influenza A virus genome. NS1 plays an important role in inhibition of host immune responses. In order to assess the cellular localization of NS1 in different influenza A virus subtypes, we performed the immunofluorescence assay to observe the cellular location of NS1 after infection with influenza A virus WSN (H1N1), PR8 (H1N1), CA04 (H1N1), SD (H9N2) and AH01 (H7N9) in A549 cells and MDCK cells respectively. According to the results, NS1-WSN and NS1-PR8 accumulated mainly in cytoplasm at 24 h post infection, while the NS1-CA04 and NS1-SD appeared major in the nucleus. We also observed localization of NS1 by transfected 293T cells with plasmids which encoding the full-length NS1 from WSN, SD and AH01. The key sites which might determine the different cellular localization of NS1 were chosen by sequence alignment, and seven residues which were different between WSN, PR8 and CA04, SD and AH01 were finally focused. However, we found that single mutation of these residues could not alter the localization of NS1. The data indicated that the difference of location might not be caused by substitution of a single site, which contributes to our understanding of the diverse regulation of host factors during different subtypes of influenza virus infection.

influenza A virus, NS1 protein, cellular location, amino acid mutation

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31100644, 81271849, 81321063).

國家自然科學基金 (Nos. 31100644, 81271849, 81321063) 資助。