汪曉雯，國(guó)立耘

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院植物病理系 農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

致病疫霉組蛋白H2A變異體序列與表達(dá)

汪曉雯，國(guó)立耘

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院植物病理系 農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

汪曉雯, 國(guó)立耘. 致病疫霉組蛋白H2A變異體序列與表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(11): 1564-1575.

Wang XW, Guo LY. Sequence analysis and expression patterns of histone H2A variants in Phytophthora infestans. Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1564-1575.

在真核生物中，DNA纏繞在組蛋白上形成核小體，一個(gè)組蛋白分子包括H2A、H2B、H3和H4各2個(gè)核心組蛋白亞基。在這4種核心組蛋白中，H2A富含多樣化，且在細(xì)胞的生物途徑中起重要作用的變異體，因此，H2A家族一直是研究熱點(diǎn)。致病疫霉是重要的病原菌也是研究卵菌的模式物種之一，目前關(guān)于卵菌表觀遺傳的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究針對(duì)致病疫霉組蛋白H2A變異體，利用基因組信息和基因芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育分析以及基因表達(dá)水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在致病疫霉基因組中存在組蛋白H2A變異體H2A.X.1、H2A.X.2和H2A.Z，它們?cè)诓煌L(zhǎng)發(fā)育階段和侵染過(guò)程呈現(xiàn)特異的表達(dá)譜。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究致病疫霉表觀遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

卵菌，晚疫病菌，H2A.X，H2A.Z，系統(tǒng)發(fā)育，表達(dá)譜

在真核生物細(xì)胞中，組蛋白分子由H2A、H2B、H3和H4四個(gè)亞基組成，2個(gè)組蛋白分子組成1個(gè)八聚體的組蛋白，每147 bp DNA纏繞在1個(gè)組蛋白八聚體上形成核小體，通過(guò)連接組蛋白H1進(jìn)而組裝成染色質(zhì)[1]。組蛋白的成分和它的共價(jià)修飾決定了核小體的狀態(tài)，進(jìn)而決定了染色質(zhì)的狀態(tài)。常規(guī)組蛋白 (Canonical histones) 在基因復(fù)制 (Gene duplication) 的過(guò)程中發(fā)生了個(gè)別位點(diǎn)的變異，進(jìn)而演化為具有特異功能的組蛋白變異體。這些變異體在序列、理化性質(zhì)、以及與核小體結(jié)合能力等方面與常規(guī)組蛋白有差異。因此，組蛋白的成分除了常規(guī)的H2A、H2B、H3和H4，還包括組蛋白變異體 (Histone variants)。真核生物的表觀遺傳機(jī)制包括組蛋白水平和DNA水平的修飾，組蛋白變異體及組蛋白的修飾共同參與維持染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因表達(dá)等過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)，組蛋白H2A和H3的變異體較多，并且廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞中[2]。組蛋白H2A的變體有H2A.X、H2A.Z、MacroH2A、H2A.Bbd等[3]。不同的H2A變異體差異主要在于C端尾巴的長(zhǎng)度和序列，C端序列的變化決定了H2A變異體的功能[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，H2A.X的功能是參與DNA損傷修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定。當(dāng)DNA出現(xiàn)斷裂時(shí)，H2A.X發(fā)生磷酸化修飾，替代常規(guī)H2A，進(jìn)而將斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行非同源末端鏈接(Non-homologous end joining)[4]。H2A.X的磷酸化位點(diǎn)在酵母中是129位的絲氨酸殘基，在哺乳動(dòng)物中是139位的絲氨酸殘基[2]。另外，H2A.X的高磷酸化也是細(xì)胞凋亡的特征之一[5]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)有DNA雙鏈斷裂時(shí)也存在磷酸化的H2A.X，推論染色質(zhì)的變化也能導(dǎo)致H2A.X的磷酸化，H2A.X參與穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[6]。

H2A.Z廣泛分布于真核生物的染色體中，主要參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活，穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)，防止基因沉默蔓延到相鄰的常染色質(zhì)上[7]。研究發(fā)現(xiàn)H2A.Z通常結(jié)合在基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) (TSSs)[8]。H2A.Z-H2B二聚體與DNA的結(jié)合相對(duì)較松，對(duì)轉(zhuǎn)錄激活起到重要的作用[9]。缺失H2A.Z，組蛋白去乙?；窼ir2、Sir3和Sir4將進(jìn)入常染色質(zhì)，基因轉(zhuǎn)錄活性降低[10]。

MacroH2A和H2A-Bbd僅在脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。MacroH2A大量富集在失活的X染色體中，其C端含有很長(zhǎng)的尾巴，形成球狀結(jié)構(gòu)域，抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[2,11]。H2A-Bbd與組蛋白H4乙酰化同時(shí)出現(xiàn)，標(biāo)志著染色體的轉(zhuǎn)錄激活，而在失活的X染色體中缺乏H2A-Bbd[2]。

疫霉Phytophthora屬于卵菌 (Oomycetes)，它和金褐藻、硅藻一并歸屬于茸鞭生物界(Stramenopila)[12]。疫霉是一類能生存于土壤，靠侵染寄主植物進(jìn)行寄生生活的植物病原菌。致病疫霉Phytophthora infestans de Bary可侵染多種茄屬植物，其中包括馬鈴薯和番茄[13]。致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中的重要病害，曾經(jīng)導(dǎo)致著名的愛(ài)爾蘭饑饉。目前，該病害每年仍在世界范圍內(nèi)發(fā)生并造成嚴(yán)重危害。

盡管卵菌中多個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)已釋放，但目前還缺少對(duì)組蛋白變異體的研究。疫霉菌的表觀遺傳機(jī)制也不清楚。依據(jù)已釋放的基因組數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在卵菌基因組中含有保守的組蛋白H2A、H2B、H3和H4，并且H2A和H3存在序列保守的變異體。本研究利用基因組信息，對(duì)致病疫霉組蛋白H2A變異體進(jìn)行序列、系統(tǒng)發(fā)育以及表達(dá)水平的分析，為進(jìn)一步探索致病疫霉組蛋白H2A的功能建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)中選取的供試菌株分別為2007年采自甘肅的致病疫霉A1交配型菌株MX5-1和YZ-6[14]，以及來(lái)自美國(guó)的A2交配型菌株80787-94L[15]。培養(yǎng)致病疫霉菌株的培養(yǎng)基為黑麥番茄固體培養(yǎng)基和碗豆汁液體培養(yǎng)基[16]。RNA提取試劑盒NucleoSpin RNA Plant Kit購(gòu)自MACHEREY-NAGEL公司。反轉(zhuǎn)錄酶和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。引物由北京華大基因科技股份有限公司合成。聚碳酸酯膜購(gòu)自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和基因序列分析

從NCBI、SWISS-PROT和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了模式物種酵母Saccharomyces cerevisiae、人類Homo sapiens和擬南芥Arabidopsis thaliana，以及與卵菌親緣關(guān)系較近的硅藻Phaeodactylum tricornutum和假微型海鏈藻Thalassiosira pseudonana基因組中組蛋白H2A變異體的序列(表1)，依據(jù)這些序列從BROAD INSTITUTE、DOE Joint Genome Institute、Ensembl Genomes和Pythium Genome Database搜索并下載致病疫霉菌Phytophthora infestans、大豆疫霉菌Phytophthora sojae、爍樹(shù)猝死病菌Phytophhtora ramorum、角膜白斑病菌Albugo labachii、終極腐霉菌Pythium ultimum和寄生水霉菌Saprolegnia parasitica[17-20]6個(gè)卵菌基因組中的同源序列 (表1)。用模式物種的序列作為參比進(jìn)行分析。利用SMART、Pfam、NCBI CD (Conserved Domains)-Search和InterProScan等在線程序?qū)┰囆蛄羞M(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與驗(yàn)證[21-23]。利用CPHmodels-3.2在線程序?qū)χ虏∫呙菇M蛋白H2A變異體進(jìn)行了三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[24]。

1.2.2 組蛋白H2A變異體序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)利用在線程序ClusterW2[25]，對(duì)供試物種的組蛋白H2A變異體保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行雙重和多重序列比對(duì)。在雙重序列比對(duì)中，gap的起始和延伸補(bǔ)償值分別為10和0.1，相較而言，在多重序列比對(duì)中，gap的延伸補(bǔ)償值為0.2。利用MEGA 5.22對(duì)序列比對(duì)后的結(jié)果進(jìn)行聚類分析，用最大似然法構(gòu)建聚類樹(shù)[26]。Bootstrap值設(shè)定為1 000。

1.2.3 供試菌株RNA的提取

本試驗(yàn)中選取的供試菌株分別為2007年采自甘肅的致病疫霉A1交配型菌株MX5-1和YZ-6，以及來(lái)自美國(guó)的A2交配型菌株80787-94L[15]。收集菌株的無(wú)性生殖和有性生殖各階段的菌絲體進(jìn)行RNA提取。

表1 組蛋白H2A變異體基因信息表Table 1 Gene information for histone H2A variants

續(xù)表1

對(duì)于無(wú)性階段，將MX5-1接種在黑麥番茄培養(yǎng)基上，共做150皿 (90 mm)，然后置于18 ℃，黑暗培養(yǎng)10 d[15]。用無(wú)菌水沖洗收集游動(dòng)孢子囊，將其中30皿的游動(dòng)孢子囊懸浮液通過(guò)2 000 r/min離心8 min，收集游動(dòng)孢子囊作為游動(dòng)孢子囊階段 (SP) 的試驗(yàn)樣本。將剩余120皿的游動(dòng)孢子囊懸浮液放置于4 ℃低溫處理2-3 h誘導(dǎo)游動(dòng)孢子形成和釋放。2 000 r/min離心8 min收集其中30皿的游動(dòng)孢子作為游動(dòng)孢子階段(ZO) 的試驗(yàn)樣本。將另外30皿游動(dòng)孢子懸浮液渦旋振蕩40 s誘導(dǎo)游動(dòng)孢子成為休止孢，然后再經(jīng)過(guò)2 000 r/min離心8 min收集休止孢作為休止孢時(shí)期 (CY) 的試驗(yàn)樣本。剩余的60皿游動(dòng)孢子懸浮液用豌豆培養(yǎng)汁在120 r/min、18 ℃的條件下培養(yǎng)，其中30皿在培養(yǎng)3 h后用2 000 r/min離心8 min收集萌發(fā)的休止孢作為休止孢萌發(fā)階段 (GC) 的試驗(yàn)樣本，另外的30皿游動(dòng)孢子懸浮液在培養(yǎng)48 h后用2 000 r/min離心8 min收集新鮮菌絲作為菌絲階段 (MY) 的試驗(yàn)樣本。對(duì)于有性階段，用表面鋪有一層孔徑為0.4 μm的聚碳酸酯膜 (Millipore，Ireland，直徑43 mm) 的黑麥番茄固體培養(yǎng)基平板(60 mm) 培養(yǎng)供試菌株，將YZ-6和80787-94L同時(shí)接種于一皿中，兩菌絲塊中間距離2 cm，處于18 ℃黑暗對(duì)峙培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)生有性生殖，培養(yǎng)4 d、10 d和14 d后，分別刮取兩菌絲塊生長(zhǎng)交界處的菌絲體和卵孢子，作為有性生殖過(guò)程中菌絲尖端膨大 (4DM)，卵孢子形成 (10DM) 和卵孢子成熟 (14DM) 階段的試驗(yàn)樣本。同時(shí)，分別收集同樣培養(yǎng)條件下，單獨(dú)培養(yǎng)的菌齡4 d的YZ-6 (4D1) 和80787-94L (4D2) 菌絲體作為對(duì)照。

將這些樣本收集后用吸水紙吸干水分，迅速用液氮研磨，然后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣本的總RNA采用NucleoSpin RNA Plant Kit (740949，MACHEREY-NAGEL，Germany) 試劑盒進(jìn)行提取，提取后用Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì) (Wilmington，USA) 測(cè)量RNA的濃度和純度并且用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA質(zhì)量。整個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)一次。

1.2.4 表達(dá)水平測(cè)定與分析

首先針對(duì)致病疫霉3個(gè)組蛋白H2A變異體基因設(shè)計(jì)了特異性引物 (表2)。其中，PifH2A.X.1和PifH2A.X.2的序列相似度較高，通過(guò)序列比對(duì)，選取位于第70?180 bp序列差異較大的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。利用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行不同生長(zhǎng)階段基因表達(dá)水平測(cè)定。對(duì)于每一個(gè)樣本，吸取1 μg總RNA用oligo (dT18) 作為引物，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (TaKaRa Bio Inc.Shiga，Japan) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系包括10 ng cDNA，引物0.2 μmol/L (終濃度)，0.4 μL ROX Reference Dye II，10 μL SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) (TaKaRa Bio Inc. Shiga，Japan)，加雙蒸水補(bǔ)足到20 μL。利用ABI PRISM 7500 fast實(shí)時(shí)定量PCR儀 (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，SYBR CA，USA) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，Ct值反應(yīng)程序?yàn)榈谝徊?5 30 s℃，第二步共40個(gè)循環(huán)，包括95 5 s℃，60 34 s℃；熔解曲線反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min ，95 ℃ 15 s，用于檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的特異性。結(jié)果顯示4對(duì)用于檢測(cè)基因表達(dá)水平的引物均具有特異性。以延伸因子 (EF1，PITG_06722.1) 為內(nèi)參基因，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，并繪制柱形圖。

從表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)Gene Expression Omnibus DataSets得到Haas等利用基因芯片技術(shù)獲得的致病疫霉侵染馬鈴薯不同時(shí)期的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[20]，據(jù)此分析了致病疫霉組蛋白H2A變異體基因在與寄主馬鈴薯互作過(guò)程中的表達(dá)情況。

表2 研究中使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 2 Realtime qPCR primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉組蛋白H2A變異體的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)在基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行序列查找，以及與模式物種中組蛋白H2A序列比對(duì)分析，在致病疫霉基因組中發(fā)現(xiàn)存在編碼2種組蛋白H2A變異體的基因，共3個(gè)，包括2個(gè)H2A.X (PITG_03881.1和PITG_03882.1) 和1個(gè)H2A.Z (PITG_02527.1)。同時(shí)，我們對(duì)同為卵菌的P. sojae、P. ramorum、Py. ultimum、S. parasitica和A. laibachii進(jìn)行了H2A變異體基因的搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了在S. parasitica中發(fā)現(xiàn)了常規(guī)組蛋白H2A和變異體H2A.Z，其他卵菌基因組中與致病疫霉相似，都只含有組蛋白H2A.X和H2A.Z兩種變異體，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)常規(guī)組蛋白H2A (表1)。在酵母中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)常規(guī)組蛋白H2A[27]，推測(cè)是在進(jìn)化過(guò)程中，組蛋白變異體H2A.X逐漸替代了常規(guī)H2A。

通過(guò)以人組蛋白變異體H2A.Bbd為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括致病疫霉在內(nèi)的卵菌中的組蛋白變異體H2A.X和常規(guī)體H2A，與模式物種酵母、擬南芥、人以及親緣關(guān)系近的硅藻中的組蛋白變異體H2A.X和常規(guī)體H2A聚在一個(gè)大支上，而包括卵菌在內(nèi)的不同物種中組蛋白變異體H2A.Z單獨(dú)聚為一支(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明致病疫霉基因組中含有序列保守的組蛋白變異體H2A.X和H2A.Z，并且相對(duì)于同一物種中不同的組蛋白變異體，不同物種中的同類組蛋白變異體基因的相似性更高，說(shuō)明不同物種中的同類組蛋白變異體有共同的起源。

圖1 致病疫霉組蛋白H2A變異體的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Maximum likelihood phylogenetic tree of histone H2A variants of Phytophthora infestans. Bootstrap values less than 50 were hided.

2.2 致病疫霉組蛋白H2A變異體的序列結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 組蛋白H2A.X序列結(jié)構(gòu)

致病疫霉基因組中含有2個(gè)編碼組蛋白變異體H2A.X的基因：PITG_03881.1和PITG_03882.1。H2A.X.1編碼一條長(zhǎng)139個(gè)氨基酸的序列，H2A.X.2編碼一條長(zhǎng)140個(gè)氨基酸的序列。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)組蛋白H2A.X氨基酸序列相似度高達(dá)97.1%，主要差異位點(diǎn)在第16、19、24、39、47和49位 (圖2)。

通過(guò)在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在已有三維結(jié)構(gòu)解析的H2A.X中致病疫霉H2A.X.1和H2A.X.2與非洲爪蟾的H2A.X (PDB：5f99，chain G) 相似度最高，分別為78.2%和76.9%。以其為模板構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)H2A.X.1和H2A.X.2包含了5個(gè)alpha螺旋，這5個(gè)alpha螺旋在不同物種中十分保守 (圖2)。

通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，致病疫霉組蛋白H2A.X.1和H2A.X.2中C端的絲氨酸 (S) 分別位于第136位和第137位，磷酸化保守位點(diǎn)為SQDY (圖2)，并且與硅藻C端磷酸化保守位點(diǎn)相同。而在酵母、擬南芥和人等的研究中發(fā)現(xiàn)，組蛋白H2A.X中保守的磷酸化位點(diǎn)位于序列C端SQEL/F/Y motif，其中的絲氨酸 (S) 可以發(fā)生磷酸化。盡管卵菌和模式物種中保守的磷酸化位點(diǎn)中有1個(gè)氨基酸不同，但谷氨酸 (E) 和天冬氨酸 (D) 同為酸性氨基酸，結(jié)構(gòu)相似，僅差一個(gè)甲基。

圖2 組蛋白H2A變異體H2A.X的氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Amino acid sequences alignments of histone H2A variants H2A.X. Highly conserved amino acids were showed with dark background. Structure of PiH2A.X.1 was predicted through modeling with H2A.X (PDB: 5f99, chain G) of Xenopus laevis, and illustrated as five alpha helixes. The phosphorylation motifs at C terminus were showed in black boxes.

2.2.2 組蛋白H2A.Z序列結(jié)構(gòu)

致病疫霉基因組中含有1個(gè)編碼組蛋白變異體H2A.Z的基因：PITG_02527.1。H2A.Z編碼一條長(zhǎng)136個(gè)氨基酸的序列。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在已有三維結(jié)構(gòu)解析的H2A.X中，致病疫霉組蛋白H2A.Z與人的H2A.Z (PDB：1f66，chain G)相似度最高 (87.5%)，以其為模板構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)H2A.Z包含了5個(gè)alpha螺旋，序列比對(duì)結(jié)果顯示這5個(gè)alpha螺旋在不同物種中十分保守 (圖3)。

圖3 組蛋白H2A變異體H2A.Z氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Amino acid sequences alignments of histone variants H2A.Z. Highly conserved amino acids were showed with dark background. Structure of PiH2A.Z was predicted through modeling with H2A.Z (PDB: 1f66, chain G) of human, and illustrated as five alpha helix.

2.3 編碼致病疫霉組蛋白H2A變異體的基因表達(dá)譜分析

通過(guò)Realtime qPCR檢測(cè)致病疫霉組蛋白H2A變異體在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)水平，以及致病疫霉侵染馬鈴薯不同階段基因芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：致病疫霉組蛋白H2A.X.1在無(wú)性生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的游動(dòng)孢子和休止孢階段表達(dá)顯著上調(diào)，而在游動(dòng)孢子囊和萌發(fā)的休止孢階段表達(dá)下調(diào)，在有性生殖階段，隨著卵孢子的形成表達(dá)水平逐漸下降，而在與寄主互作的過(guò)程中，表達(dá)水平在接種后2?3 d的時(shí)間段表達(dá)明顯上調(diào)，4?5 d沒(méi)有明顯變化。結(jié)果表明H2A.X.1參與游動(dòng)孢子、休止孢以及侵染早期相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控 (圖4)。

與H2A.X.1相似，H2A.X.2在無(wú)性生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期游動(dòng)孢子和休止孢階段表達(dá)上調(diào)，而在游動(dòng)孢子囊和萌發(fā)的休止孢階段表達(dá)顯著下調(diào)，在有性生殖階段初期和后期表達(dá)水平有所下降，而在與寄主互作的過(guò)程中，在接種后2 d表達(dá)略上調(diào)，其他階段沒(méi)有明顯變化；結(jié)果表明H2A.X.2可能參與游動(dòng)孢子、休止孢，有性生殖中期以及侵染早期相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控(圖4)。

H2A.Z在無(wú)性生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期游動(dòng)孢子囊、游動(dòng)孢子和休止孢階段表達(dá)顯著上調(diào)，而在萌發(fā)的休止孢階段表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，有性生殖階段，與H2A.X不同，隨著卵孢子的形成表達(dá)水平逐漸上升，而在與寄主互作的過(guò)程中，隨著侵染時(shí)間進(jìn)程表達(dá)量逐漸降低；結(jié)果表明H2A.Z可能參與游動(dòng)孢子囊、游動(dòng)孢子、休止孢以及有性生殖后期相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控 (圖4)。

分別針對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)發(fā)育階段 (圖4A和4B) 和與寄主互作階段 (圖4C) 過(guò)程中基因表達(dá)水平進(jìn)行了研究，在Haas等測(cè)試致病疫霉在侵染寄主過(guò)程中的基因表達(dá)時(shí)，是以在不同培養(yǎng)基上的菌絲體作為對(duì)照進(jìn)行分析，這一階段的菌絲體可能包括了菌絲、游動(dòng)孢子囊、游動(dòng)孢子等結(jié)構(gòu)，與圖4A中無(wú)性生長(zhǎng)發(fā)育階段(MY、SP、ZO、CY和GC) 的樣本可能有一定的重疊，但區(qū)別是前者為混合樣本，后者是每一時(shí)期的單獨(dú)測(cè)定結(jié)果，因此兩者不具有可比性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在圖4C中，致病疫霉在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，組蛋白H2A變異體基因的表達(dá)存在差異。相對(duì)于V8和RSA營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基而言，在寡營(yíng)養(yǎng)的Pea培養(yǎng)基中組蛋白H2A變異體基因的表達(dá)相對(duì)較高，說(shuō)明寡營(yíng)養(yǎng)條件可能誘導(dǎo)組蛋白H2A變異體基因的表達(dá)。

研究還發(fā)現(xiàn)組蛋白H2A變異體3個(gè)基因的表達(dá)譜存在差異，說(shuō)明不同的組蛋白H2A變異體可能具有特定的功能。由于mRNA的相對(duì)表達(dá)量，只能說(shuō)明基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)變化，是否在蛋白質(zhì)水平上也發(fā)生了相應(yīng)的變化仍需要進(jìn)一步研究。

圖4 致病疫霉組蛋白H2A變異體基因在無(wú)性生長(zhǎng)發(fā)育階段 (A)、有性生殖階段 (B) 和侵染階段 (C) 的表達(dá)譜Fig. 4 Expression patterns of the histone H2A variants of Phytophthora infestans during asexual development (A), sexual reproduction (B) and infection stages (C). (A-B), The relative expression values were generated by realtime qPCR data from two biological repeats. (C) The relative expression values were generated by microarray expression data of GSE14480 retrieved from GEO DataSets.

3 結(jié)論

本研究通過(guò)基因序列比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育分析和基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)致病疫霉等卵菌基因組中含有序列保守的組蛋白變異體H2A.X和H2A.Z，不存在變異體H2A.Bbd和MacroH2A。致病疫霉基因組中包含2個(gè)組蛋白變異體H2A.X、H2A.X.1和H2A.X.2，蛋白的C端含有保守的磷酸化位點(diǎn)SQDY。表達(dá)數(shù)據(jù)分析顯示致病疫霉變異體H2A.X.1、H2A.X.2和H2A.Z可能參與調(diào)控特定的生長(zhǎng)發(fā)育和侵染相關(guān)基因的表達(dá)。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索致病疫霉組蛋白H2A的功能建立了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Sequence analysis and expression patterns of histone H2A variants in Phytophthora infestans

Xiaowen Wang, and Liyun Guo
The Ministry of Agriculture Key Laboratory for Plant Pathology, Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100193, China

In eukaryotic cells, DNA is packaged inside the nucleus together with histones to form nucleosomes. Each histone molecule contains two of each core histone subunits H2A, H2B, H3 and H4. Among core histones, the H2A family is of great interest due to the high diversity of specialized variants. These variants have shown important role in critical cellular processes. Epigenetic mechanism in oomycetes is barely known. Phytophthora infestans is a severe pathogen and amodel species in oomycetes. In this study, we studied the sequence and expression pattern of H2A variants of P. infestans through genome search, sequences alignment, phylogenetic analysis and realtime qPCR detection. P. infestans contains conserved genes encoding histone variants H2A.X.1, H2A.X.2 and H2A.Z, and these genes have specific expression patterns during development and infection stages. Our datasets provide useful inputs to help explore the epigenetic mechanisms of oomycetes.

March 18, 2016; Accepted: April 28, 2016

Liyun Guo. Tel/Fax: +86-10-62733032; E-mail: ppguo@cau.edu.cn, ppguoly@126.com

oomycetes, late blight pathogen, H2A.X, H2A.Z, phylogeny, expression pattern

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30270862).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30270862) 資助。