顧康博，管成，許家慧，李淑蘭，羅遠嬋，沈國敏，張道敬，李元廣

1 華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237 2 上海澤元海洋生物技術有限公司，上海 200237

海洋生物技術

中試規(guī)模純化海洋芽孢桿菌源脂肽類化合物

顧康博1，管成1，許家慧1，李淑蘭2，羅遠嬋1，沈國敏1，張道敬1，李元廣1

1 華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237 2 上海澤元海洋生物技術有限公司，上海 200237

顧康博, 管成, 許家慧, 等. 中試規(guī)模純化海洋芽孢桿菌源脂肽類化合物. 生物工程學報, 2016, 32(11): 1549-1563.

Gu KB, Guan C, Xu JH, et al. Pilot-scale purification of lipopeptide from marine-derived Bacillus marinus. Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1549-1563.

本次研究旨在建立經(jīng)濟可行的海洋芽孢桿菌源脂肽類化合物的中試規(guī)模純化工藝。對包括酸化沉淀、甲醇浸提、溶劑沉淀、鹽析、萃取、硅膠柱層析和HZ806大孔樹脂吸附工藝在內(nèi)的可放大的成熟單元工藝進行反復試驗，考察脂肽類化合物表面活性對單元工藝的影響。嚴格遵循以高收率為前提循序漸進逐步減少雜質(zhì)的原則，組合上述單元工藝對目標產(chǎn)物進行提取和純化，并最終獲得高純度脂肽樣品。新工藝可從1 t海洋芽孢桿菌Bacillus marinus B-9987的發(fā)酵液中，以百克量級的規(guī)模制備87.51%-100%純度的脂肽類化合物樣品，收率>81.73%。本研究首次實現(xiàn)了高純度的海洋芽孢桿菌源脂肽類化合物的百克量級制備；允許發(fā)酵生產(chǎn)階段使用天然培養(yǎng)基，緩解了脂肽中游發(fā)酵生產(chǎn)和下游大規(guī)模純化之間的矛盾；且各單元工藝規(guī)避了脂肽類化合物水溶液的乳化起泡和不經(jīng)濟的大體積水溶液蒸發(fā)濃縮。新工藝實用可行，經(jīng)濟合理。

海洋芽孢桿菌，脂肽，中試規(guī)模純化，百克量級，放大

自Arima等[1]從枯草芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)脂肽類化合物表面活性素 (Surfactin)以來，在過去的半個世紀中已有十多種不同類型的脂肽被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[2]。脂肽類化合物的分子結(jié)構(gòu)同時含有親水基團和親油基團，因此具有顯著的表面活性和生物活性[3]：由于表面活性可降低表面張力提高烴類化合物的溶解性，脂肽類化合物及其產(chǎn)生菌被用于清理石油和烴類化合物所導致的環(huán)境污染[4-5]；脂肽類化合物的表面活性和抗細菌活性等特點在化妝品行業(yè)具有潛在的應用前景[6]；在生物醫(yī)藥領域，脂肽類化合物被證實具有抗真菌[7-9]、抗細菌[8,10-11]、抗癌[8,12-13]等生物活性，其中放線菌源的脂肽類抗生素達托霉素作為萬古霉素的替代品已于2003年在美國批準上市[14]；在農(nóng)業(yè)領域，由于脂肽類化合物具有環(huán)境友好和可降解等優(yōu)點[3,15]，具有開發(fā)成農(nóng)用殺菌劑[8,16-17]、免疫誘導劑[18]以及殺蟲劑[19]等綠色農(nóng)藥的潛力，也是目前可持續(xù)農(nóng)業(yè)的研究熱點之一[15]。

目前脂肽類化合物的研究領域，主要對脂肽產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物進行初步的提取和預處理，再通過薄層色譜法 (TLC)[7-8,20]、凝膠排阻層析[9,21-22]或者高效液相色譜 (HPLC)[7,9,21]等手段，對目標脂肽類化合物進行分離純化，所獲得的純化樣品往往極少，只能進行離體試驗[7-8,22]，或者對離體的葉片和作物等進行規(guī)模較小的生測試驗[9,20]，制備規(guī)模難以滿足諸如田間藥效試驗和毒理學試驗對純品的大量需求。脂肽產(chǎn)業(yè)的進一步開發(fā)，亟待高純度脂肽類化合物的規(guī)模制備工藝的建立。

然而，由于脂肽類化合物的表面活性顯著，混合物中的脂肽所表現(xiàn)出的溶解性、極性和膠束狀態(tài) (影響凝膠排阻層析和超濾的截留分子量的選擇)，會隨著樣品濃度、雜質(zhì)種類和雜質(zhì)數(shù)量的變化而變化，對下游分離純化工藝的建立構(gòu)成嚴重的干擾。目前，脂肽類化合物僅放線菌源的達托霉素的開發(fā)較為成功，主要得益于該脂肽分子的電離特性，可采用離子交換法實現(xiàn)其分離純化[23-24]。而芽孢桿菌源脂肽類化合物，比如常見的表面活性素、芬薺素 (Fengycin)和伊枯草菌素 (Iturin)[25]，均難以復制這個成功的先例。為了克服脂肽類化合物表面活性對分離純化工藝的干擾，往往需要從源頭減少雜質(zhì)數(shù)量，降低下游分離純化的難度。合成培養(yǎng)基組分明確而穩(wěn)定，不易引入過多的雜質(zhì)，適合于脂肽類化合物的分離純化研究[25-27]。得益于合成培養(yǎng)基這一優(yōu)點，Dhanarajan等[25]研究了大孔樹脂吸附工藝，可毫克量級制備68.3%純度伊枯草菌素、77.6%純度芬薺素和91.6%純度表面活性素；Zhang等[26]建立了絮凝-過濾工藝，可克量級制備79.5%純度表面活性素；Chen等[27]研究了超濾法制備工藝，可克量級制備83%純度表面活性素。然而，合成培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，成本較高，多用于代謝研究以及疫苗生產(chǎn)，并不適用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)[28]。因此上述純化工藝的規(guī)模不過克量級和毫克量級，尚不能滿足脂肽類化合物開發(fā)對純化樣品較大的需求量。

本次研究，以海洋芽孢桿菌Bacillus marinus B-9987所產(chǎn)新結(jié)構(gòu)脂肽類化合物為研究對象，建立經(jīng)濟可行的高純度脂肽類化合物的中試規(guī)模制備工藝。該工藝不但不限制中游大規(guī)模發(fā)酵對天然培養(yǎng)基的需求，還能從發(fā)酵產(chǎn)品中高效地提取和純化目標脂肽類化合物，而且其中的單元工藝也需盡量規(guī)避脂肽水溶液的乳化起泡和不經(jīng)濟的大體積水溶液蒸發(fā)濃縮，保證該工藝經(jīng)濟實用，易于向其他芽孢桿菌源脂肽類化合物的開發(fā)領域推廣。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵生產(chǎn)菌、目標脂肽類化合物及發(fā)酵生產(chǎn)

本次研究對象為海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987所產(chǎn)的marihysin A、maribasin A和maribasin B新結(jié)構(gòu)脂肽類化合物[16-17,29]，統(tǒng)稱為BM脂肽類化合物。B. marinus B-9987產(chǎn)BM脂肽類化合物的發(fā)酵液，由上海澤元海洋生物技術有限公司生產(chǎn)提供。BM脂肽類化合物的發(fā)酵生產(chǎn)采用營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基[30]，取代文獻[25-27]中所報道的有利于脂肽分離純化而不利于發(fā)酵生產(chǎn)的合成培養(yǎng)基。本次發(fā)酵規(guī)模達到2.5 t發(fā)酵液/批次 (裝液系數(shù)：0.5)，BM發(fā)酵水平達到120 mg/L。

1.2 BM脂肽類化合物定量檢測方法

采用HPLC檢測樣品中BM脂肽類化合物的含量。液相系統(tǒng)：Waters 1525高壓液相色譜系統(tǒng)和Waters 2487紫外檢測器。液相條件：分析柱為Cosmoil 5C18-MS-Ⅱ (粒徑5 μm，規(guī)格4.6 mm×250 mm)；柱溫25 ℃；進液量20 μL；以70%甲醇為流動相，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm。根據(jù)HPLC圖譜中BM目標化合物的峰面積之和，代入線性回歸方程Y=23 140X-17 741 (R2=0.999 7) 計算HPLC檢測樣品中BM物質(zhì)的含量。其中，Y為BM圖譜中BM目標化合物的峰面積之和，單位μV·s；X為檢測樣品的BM含量，單位μg/mL；該回歸方程在15.62-1 000 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

基于精確的HPLC檢測方法，結(jié)合檢測樣品的濃縮/稀釋比例，計算出原待測樣品溶液中BM物質(zhì)的濃度和總量；結(jié)合干重數(shù)據(jù)，確定BM物質(zhì)的純度；同理，可以測定單元工藝前后BM物質(zhì)總量的變化，計算該單元工藝的收率(得率)。

1.3 中試規(guī)模純化工藝的研究

1.3.1 中試規(guī)模純化工藝所需儀器、材料、填料及試劑

儀器為管式離心機 (上海章泉離心機技術有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海青浦滬西儀器廠)、循環(huán)水式真空泵 (上海亞榮生化儀器廠)、電熱恒溫鼓風干燥箱 (上海齊欣科學儀器有限公司)、層析用玻璃柱 (聚四氟乙烯活塞)、布氏漏斗；耗材及填料分別為定性濾紙 (杭州特種紙業(yè)有限公司)、硅膠 (200-300 目，上海天蓮化工科技有限公司)、HZ806、HZ807、HZ816、HZ818大孔樹脂 (上海華震科技有限公司)、XAD 7HP大孔樹脂 (美國羅門哈斯公司，Rohm & Haas)；工藝所需的試劑為濃鹽酸 (AR)、甲醇 (工業(yè)級和AR)、乙醚 (AR)、乙酸乙酯 (AR)、氯仿 (AR)、苯 (AR)、二氯甲烷 (AR)、正丁醇(AR)、無水硫酸鎂 (AR)、NaOH (AR)、硫酸銨(CP)、工業(yè)乙醇 (工業(yè)級，含量95%)。

1.3.2 單元工藝研究及中試規(guī)模純化工藝的建立

本次工藝研究，分別對酸化沉淀[9,25]、溶劑浸提[9,31]、溶劑沉淀[32]、鹽析[13,22]、萃取[20-21]、

硅膠柱層析[31,33]和大孔樹脂吸附[25]等可放大的常用單元工藝進行比較，對不同純化階段的脂肽類樣品進行反復試驗，根據(jù)各個單元工藝的特點加以整合，建立中試規(guī)模純化工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單元工藝的純化效果研究

BM脂肽類化合物為胞外產(chǎn)物，B. marinus B-9987發(fā)酵液經(jīng)管式離心機 (16 000 r/min) 菌液分離后，棄菌體取發(fā)酵上清液。此時，BM脂肽類化合物在發(fā)酵上清液中的含量＜0.011%，去除水分后其在溶質(zhì)中的含量也僅為0.15%，需要后續(xù)的下游工藝進行提取和純化。

2.1.1 酸化沉淀工藝

使用12 mol/L濃鹽酸將B. marinus B-9987發(fā)酵上清液 (BM脂肽純度為0.15%) 的pH值降至2.5-3.5之間，BM脂肽類化合物均被完全沉淀，未發(fā)現(xiàn)類似蛋白質(zhì)沉淀的等電點。然而，當BM脂肽樣品的純度為40.01%、75.53%和87.51%時 (BM脂肽水溶液的濃度同發(fā)酵上清液的120 mg/L)，酸化沉淀的收率出現(xiàn)明顯的下降，其中87.51%純度BM脂肽樣品，超過94%的BM物質(zhì)酸化后未被沉淀，這個結(jié)果與發(fā)酵上清液中的實驗結(jié)果完全不同，詳見表1。

酸化沉淀的試驗結(jié)果表明，脂肽分子中雖然有肽環(huán)，但其分子量遠遠小于蛋白質(zhì)，不足以像蛋白質(zhì)一樣發(fā)生等電點沉淀；再者，酸化沉淀的過程，可能是酸化條件下多糖和胞外蛋白等物質(zhì)形成沉淀，并將BM脂肽類化合物從上清液中完全轉(zhuǎn)移至沉淀中；然而，隨著脂肽類化合物樣品純度的不斷提升，可以被酸化沉淀的雜質(zhì)也越來越少，因此酸化沉淀的效果開始明顯下降。這也從一個方面體現(xiàn)了混合物中脂肽類化合物理化性質(zhì)的多變。

根據(jù)上述試驗結(jié)果，酸化沉淀可用于發(fā)酵液中BM脂肽類化合物的提取。將1 t發(fā)酵液的pH值降至2.80-3.20，僅需8 L 12 mol/L濃鹽酸，形成28 kg沉淀物 (干重)，前后體積濃縮了60-70倍，而且發(fā)酵上清液中的BM脂肽被完全轉(zhuǎn)移至沉淀中，收率為100%，純度也從0.011%提升至0.43%，明顯高于直接蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液所獲得的0.15%含量的BM樣品，有利于后續(xù)的進一步純化工作。但是，較高純度BM脂肽樣品的水溶液的酸化沉淀效果不佳，酸化沉淀工藝不能用于規(guī)避純化階段中后期的脂肽類樣品水溶液的蒸發(fā)濃縮和起泡問題。

2.1.2 甲醇浸提工藝

甲醇溶解性較好、易于濃縮、可回收再利用，且蒸發(fā)過程中不存在乳化起泡等問題，作為提取BM脂肽的溶劑較為合適。為了提升浸提的收率，進行了8批次的甲醇浸提，每批次采用110-120 L甲醇浸提25-28 kg的沉淀物。浸提過程中甲醇浸提的平均分配系數(shù)僅為0.11 L/kg。除加熱外，機械攪拌和超聲波促進溶解均不能提升分配系數(shù)，可見BM脂肽和酸化沉淀中的甲醇不溶物有較好的親和性，不受傳質(zhì)等動力學因素影響，這和發(fā)酵液酸化沉淀中表現(xiàn)的高收率相符合。且酸化沉淀的甲醇浸提過程先難后易，BM浸膏樣品的純度也在不斷提升，從第1、 2批次的2.22%純度和16.67%收率，上升至第3-5批次的6.45%純度和65.30%收率，及至最高的第6-8批次的9.10%純度和13.33%收率。這一現(xiàn)象對脂肽類化合物進一步的純化較為有利。

甲醇浸提工藝的總收率為95.30%，浸膏平均純度為4.99%。經(jīng)酸化沉淀、甲醇浸提、合并與濃縮，1 t發(fā)酵液中的BM脂肽被完全轉(zhuǎn)移至10-20 L易于濃縮不易起泡的甲醇溶液中，體積濃縮了50-100倍，便于后續(xù)單元工藝的操作。隨后的研究采用純度最低 (純化難度最高)的第1、2批次甲醇浸提的2.22%純度樣品進行試驗，以保證新工藝適用于不同批次的浸提樣品。

表1 酸化沉淀工藝效果Table 1 Recovery rate of acid precipitation

2.1.3 溶劑沉淀工藝

根據(jù)介電常數(shù)衡量混合溶液的極性，以5 g/L純度2.22%的BM脂肽類化合物的甲醇溶液為試驗對象，按照極性由低到高的順序與不同的低極性的有機溶劑快速混合，藉由溶劑極性和溶解性的顯著變化析出目標化合物，收集沉淀并進行比較?；旌先軇┙殡姵?shù)按照立方根相加律進行計算[34]，試驗結(jié)果詳見表2。

根據(jù)表2所示結(jié)果，直接采用液固提取法效率低下。液液混合沉淀因傳質(zhì)速度快，較為合理。再者，除了介電常數(shù)，溶劑種類對沉淀效果有明顯的影響。甲醇/乙醚以體積比1∶6混合時，其介電常數(shù)為6.4，取其沉淀進行檢測，BM脂肽樣品的純度從2.22%提升至6.90%。而同樣體積比的甲醇/苯混合后，介電常數(shù)更低，僅為4.0，但卻沒有BM物質(zhì)被沉淀，毫無提升效果。氯仿和二氯甲烷也有類似現(xiàn)象。此外，采用甲醇/乙酸乙酯直接沉淀BM脂肽甲醇浸提溶液也毫無效果，但是用于沉淀甲醇/乙醚沉淀樣品的甲醇溶液卻有明顯效果，純度從6.90%升至9.08%。甲醇/甲酸甲酯沉淀時也有類似現(xiàn)象。

由此得出結(jié)論：沉淀溶劑的選擇不僅要考慮極性，還要考慮溶劑的種類；在確定溶劑種類的情況下，以逐步提升極性漸進除雜的方式進行，才能獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。

溶劑沉淀法可應用于酸化沉淀和甲醇浸提之后，先濃縮甲醇溶液至相對較小的體積以減少沉淀溶劑用量。BM脂肽甲醇溶液的濃度在5-20 g/L之間均有效，但要避免過度濃縮導致甲醇溶液過于黏稠，不利于分散、傳質(zhì)和沉淀。然后將6倍體積的乙醚溶劑快速傾倒和沖散甲醇溶液，并形成沉淀；之后抽濾收集沉淀、甲醇溶解、濃縮、6倍體積乙酸乙酯沉淀、抽濾收集沉淀。樣品純度從2.22%提升至9.08%，收率為99.80%。甲酸甲酯因其較高的成本和較大的毒性不予采用。溶劑沉淀法作為酸化沉淀和甲醇浸提之后，精制步驟之前提升樣品純度和質(zhì)量的預處理工藝，簡單、快速、有效，期間所用溶劑均可回收再利用。

表2 溶劑沉淀法試驗結(jié)果Table 2 Result of solvent precipitation test

表3 鹽析試驗結(jié)果Table 3 Recovery rate of salting out

2.1.4 鹽析工藝

選擇工業(yè)應用中常用的硫酸銨進行鹽析試驗[35]。配制120 mg/L純度分別為0.15%、40.01%、75.53%和87.51%的BM脂肽的水溶液 (試驗對象同2.1.1)，按照243、390和561 g/L的添加量，使硫酸銨的飽和度分別達到40%、60%和80% (室溫，25 ℃)。不同于酸化沉淀，硫酸銨鹽析工藝不受樣品純度的影響，可以在飽和度40%-80%之間將BM脂肽類化合物完全從水溶液中析出并沉淀。結(jié)果詳見表3。

但是經(jīng)由鹽析法獲得的BM脂肽類化合物的沉淀物，會被難揮發(fā)的硫酸銨嚴重污染，結(jié)合脂肽類化合物的表面活性，很難采用有機溶劑浸提的方法使脂肽與硫酸銨簡單分開，需要后續(xù)步驟進行分離和處理 (2.1.6硅膠柱層析及2.1.7大孔樹脂吸附工藝)。此外，雖然工業(yè)級硫酸銨價格低廉，但要使1 t發(fā)酵液的飽和度提升至40%仍需使用243 kg硫酸銨，而且發(fā)酵液的體積有所上升，增加了后續(xù)處理的難度，經(jīng)濟性遠不及酸化沉淀。

根據(jù)上述試驗結(jié)果，鹽析法可在BM脂肽類化合物純度>40%的純化過程中間階段，從水溶液中高效提取BM脂肽類化合物。此時酸化沉淀法無法有效地將BM脂肽類化合物從水溶液中分離和提取，而水溶液的處理量遠小于發(fā)酵液體積，于是硫酸銨鹽析法較為經(jīng)濟可行，并規(guī)避了易于起泡且耗時耗能的水溶液蒸發(fā)濃縮。但鹽析法需要后續(xù)步驟除去硫酸銨污染物，因此在BM脂肽純化階段后期，慎用鹽析法。

2.1.5 萃取工藝

萃取工藝試驗中，極性較低的溶劑，如乙酸乙酯和二氯甲烷，均不能萃取BM脂肽，而正丁醇萃取BM脂肽的分配系數(shù)僅為1.20，同體積正丁醇需要萃取3次才能保證收率>90%。而當BM脂肽的水溶液濃度大于1.0 g/L時，正丁醇和水呈現(xiàn)互溶的情況而無法分層和萃取。如直接稀釋BM脂肽的水溶液 (BM濃度＜300 mg/L) 進行正丁醇萃取，減壓蒸發(fā)正丁醇的工作量較大。因此使用正丁醇直接萃取BM脂肽類化合物，并不可行。

在實際生產(chǎn)中，萃取法多與鹽析法相結(jié)合，從水溶液中完全提取BM脂肽。在處理含有有機溶劑的BM脂肽的水溶液時，如2.1.7中含有BM脂肽的50%乙醇洗脫液，其中的乙醇經(jīng)減壓蒸發(fā)回收之后仍難以完全除盡，此時使用鹽析法，會在液面析出較薄的“乙醇油層”，BM脂肽沉淀析出后完全溶解于該油層之中，無法通過離心和過濾獲得，且該油層體積小而粘度大，直接使用分液漏斗收集油層，操作過程中的物料損失難以避免。此時添加正丁醇使油層變厚、粘度變低，操作大為簡便，再經(jīng)分液漏斗收集及多次正丁醇萃取與洗滌器皿，獲得鹽析沉淀物的正丁醇溶液，如此鹽析法經(jīng)由萃取工藝變得可行，BM脂肽的收率可達100%，且此時正丁醇用量較少，其不易起泡的特性便于蒸發(fā)和濃縮。但由于脂肽的表面活性，正丁醇萃取劑中會含有大量水分和硫酸銨，因此依靠萃取法分離脂肽和硫酸銨污染物 (詳見2.1.4) 并不可行。

2.1.6 硅膠柱層析工藝

硅膠柱層析是常用的精制工藝。受到表面活性的干擾，脂肽類化合物、填料、試劑和雜質(zhì)之間相互的選擇性和分子間作用力較為復雜，難以明確。因此，硅膠填料和流動相溶劑的選擇，需從具有代表性的候選材料中進行篩選。硅膠柱填料選擇分離純化效果較好的200-300目硅膠。溶劑選擇方面，Snyder[36]根據(jù)質(zhì)子受體參數(shù)、質(zhì)子給予參數(shù)和強偶極參數(shù)的比例，將常用的80多種溶劑分成9個大類：Ⅰ-Ⅴ、Ⅵa、Ⅵb、Ⅶ和Ⅷ。洗脫劑選擇常用的甲醇 (Ⅱ)，排除成本較高毒性過大的乙腈 (Ⅲ)和四氫呋喃(Ⅵb)。而稀釋洗脫劑所用的底劑，則選擇5種不同類別的代表性溶劑進行試驗和篩選：氯仿(Ⅷ)、二氯甲烷 (Ⅴ)、乙酸乙酯 (Ⅵa)、乙醚 (Ⅰ)和苯 (Ⅶ)。并且，比較不同純化階段的BM脂肽樣品對硅膠柱層析和流動相選擇的影響，建立可行的硅膠柱層析單元工藝。

硅膠柱層析試驗的結(jié)果表明：硅膠柱無論使用何種流動相均不能使2.22%純度的甲醇浸提樣品的純度有所提升，試驗中的硅膠填料無法吸附脂肽樣品致使BM脂肽被過早洗脫，因此從脂肽樣品中除去部分低極性雜質(zhì)的溶劑沉淀法的預處理步驟是必要的；但當樣品純度有所提升，如經(jīng)過溶劑沉淀處理的9.08%純度的樣品，甲醇/乙酸乙酯 (Ⅱ/Ⅵa) 和甲醇/乙醚 (Ⅱ/Ⅰ)流動相可有效提升BM脂肽樣品的純度至20.86%和20.92%，而氯仿 (Ⅷ)、二氯甲烷 (Ⅴ)和苯 (Ⅶ) 仍不能有效提升樣品純度，該結(jié)果和2.1.3溶劑沉淀法的試驗結(jié)果類似；當原料的純度提升至40%之后，各類底劑均可有效提升脂肽類化合物的純度至70%，如之前無效的氯仿(Ⅷ)、二氯甲烷 (Ⅴ) 和苯 (Ⅶ)，在50%-70%梯度之間可完全洗脫BM脂肽類化合物，并將樣品純度分別提升至75.53%、75.49%和70.43%，且純化效果優(yōu)于或相當于乙酸乙酯 (Ⅵa) 的69.68%，但遜色于乙醚 (Ⅰ) 的78.36%。硅膠柱層析工藝的試驗結(jié)果詳見表4。

結(jié)合2.1.3溶劑沉淀工藝中沉淀劑的篩選結(jié)果和2.1.6硅膠柱層析工藝中底劑的篩選結(jié)果，可得出初步結(jié)論：使用有機溶劑處理BM脂肽樣品，在甲醇 (Ⅱ) 作為BM脂肽主要溶解試劑和洗脫劑的前提下，Ⅰ類和Ⅵa類試劑適合于提升粗提物的純度；而Ⅰ類、Ⅴ類和Ⅷ類試劑適合于純化階段中后期進一步提升脂肽類化合物的純度。Ⅶ類試劑效果不佳，而Ⅲ類、Ⅳ類和Ⅵb類中的大多數(shù)常用試劑極性較大，不適合作為底劑，而作為溶解試劑和洗脫劑，經(jīng)濟性和實用性均不及甲醇 (Ⅱ)。

乙醚 (Ⅰ) 是所用試驗溶劑中純化效果最好的底劑，但因沸點過低、易于揮發(fā)和爆炸性等問題而不能實際應用；二氯甲烷 (Ⅴ) 因其過低的沸點以及過于易揮發(fā)的缺點，實際應用和溶劑回收較為困難；苯 (Ⅶ) 的效果不佳，而且考慮到毒性不予應用。

表4 硅膠柱層析效果Table 4 Purification effect of silica gel column chromatography

綜合上述結(jié)果和因素，硅膠柱層析工藝可用于BM脂肽類化合物預處理之后的精制工作，處理9.08%純度的有機溶劑沉淀樣品時，按2.4 g BM/kg硅膠填料的處理能力裝柱，甲醇/乙酸乙酯為流動相，在35%-80%梯度之間洗脫全部BM脂肽，提升BM脂肽的純度至20.86%，收率96.30%；純化40.01%純度的大孔樹脂處理樣品時，使用甲醇/氯仿流動相，按7.2 g BM/kg硅膠填料的處理能力裝柱，在50%-70%梯度之間洗脫全部BM脂肽，BM脂肽的純度提升至75.53%，收率95.50%。

2.1.7 大孔樹脂吸附工藝

近年來大孔樹脂在工業(yè)應用領域有較快的發(fā)展，有多種不同骨架種類的大孔樹脂填料可供選擇[35]。本次研究選擇極性相對較低而且較為常用的聚苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔樹脂和聚甲基丙烯酸酯骨架大孔樹脂作為研究對象，使用BM脂肽的硅膠柱純化樣品 (純度20.86%)，對包括XAD 7HP、HZ806、HZ807、HZ816和HZ818在內(nèi)的5種大孔樹脂的吸附能力、解吸能力和穩(wěn)定性進行比較，流動相為乙醇/水。聚甲基丙烯酸酯骨架的XAD 7HP、HZ806和HZ807具有良好的吸附能力、解吸能力以及穩(wěn)定性，優(yōu)于聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的HZ816和HZ818 (圖1)。結(jié)合成本因素，本次工藝選擇的填料為HZ806大孔樹脂。

脂肽的水溶液在濃縮時存在乳化和起泡問題，因此要盡量減小大孔樹脂吸附處理之后水溶液的體積。HZ806大孔樹脂處理不同純化階段的BM脂肽樣品的工藝均表現(xiàn)一致：純水上樣、25%乙醇除雜，及50%乙醇洗脫BM脂肽。50%乙醇完全洗脫BM脂肽需要4.0 BV (床層體積) 的流動相，而開始的0.9 BV的“死體積”流動相中未檢測出BM脂肽類化合物，其后的3.1 BV的50%乙醇流動相洗脫全部的BM脂肽，因此有1.55 BV的水分需要后續(xù)處理。由此可知，大孔樹脂單位床層體積的吸附量越大，同樣1.55 BV水分中所含的BM脂肽就越多，則單位數(shù)量的BM脂肽所產(chǎn)生的水分就越少，后續(xù)處理就越容易。

HZ806大孔樹脂處理不同純度BM脂肽樣品的結(jié)果詳見圖2。當BM脂肽樣品純度僅為2.22%時 (酸化沉淀的甲醇浸膏)，雖然大孔樹脂將樣品的純度提升至17.50%，但吸附能力僅為0.33 g BM/L床層體積，后續(xù)需要處理的水分高達4.70 L/g BM，不利于生產(chǎn)；而當BM脂肽樣品純度上升至20.86%時 (硅膠柱處理樣品)，大孔樹脂處理效果有了顯著改善，純度上升至40.01%，吸附能力上升至4.58 g BM/L床層體積，所需處理的水分減少至0.34 L/g BM，減壓蒸發(fā)回收大部分乙醇之后，將2.1.4鹽析法和2.1.5萃取法相結(jié)合，規(guī)避脂肽水溶液的蒸發(fā)濃縮和起泡問題的同時提取BM脂肽，收率96.02% (污染樣品的硫酸銨由后續(xù)硅膠柱層析和大孔樹脂吸附法去除)；而當樣品純度上升至75.53%時 (第二次硅膠柱處理的樣品)，大孔樹脂吸附法可將樣品純度提升至87.51%，吸附能力高達12.1 g BM/L床層體積，所需處理的水分僅為0.13 L/g BM，收率97.31%。

最后0.13 L/g BM的水溶液，可使用HZ806大孔樹脂再次吸附樣品，使用水溶液上樣，再用95%工業(yè)乙醇洗脫BM脂肽，乙醇洗脫階段棄去先流出的0.9 BV的水溶液，再收集2.0 BV乙醇即可，對乙醇的減壓濃縮過程可回避BM脂肽水溶液的起泡問題；如水溶液體積較小，也可以與正丁醇混合，正丁醇能抑制起泡，且與水共沸方便減壓濃縮；如連續(xù)生產(chǎn)過程中，也可以保證BM脂肽不被降解的前提下，使用電熱恒溫鼓風干燥箱60 ℃緩慢烘干，也無乳化起泡問題。通過上述方法，在獲得最終純化樣品的同時，完全規(guī)避脂肽水溶液的蒸發(fā)濃縮過程中嚴重的乳化起泡等問題。

圖1 大孔樹脂吸附能力、解吸能力和穩(wěn)定性比較Fig. 1 Absorption capacities, desorption ratios and reproducibilities of macroporous absorption resins.

圖2 HZ806大孔樹脂吸附工藝的吸附能力、待處理水溶液體積和純化效果Fig. 2 Absorption capacities, water evaporation volumes, and purification effects of different BM samples treated with HZ806 macroporous absorption resin.

2.2 單元工藝的組合及中試規(guī)模純化工藝的建立

以保持目標脂肽類化合物高收率為前提，嚴格履行循序漸進減少雜質(zhì)的原則方針，選擇成熟的可放大單元工藝進行研究和組合 (詳見2.1)，并最終建立一套經(jīng)濟、實用，可放大的海洋芽孢桿菌源脂肽類化合物的中試規(guī)模純化工藝。工藝流程詳見圖3。

圖3 BM脂肽類化合物中試規(guī)模純化工藝Fig. 3 Production process for pilot-scale purification of BM series lipopeptides.

圖3所示的BM脂肽類化合物中試規(guī)模純化工藝流程，其中的數(shù)據(jù)為處理原料純度最低的第1、2批次甲醇浸提的2.22%純度樣品的過程數(shù)據(jù)，最終獲得純度87.51%的脂肽樣品 (樣品的HPLC檢測圖譜詳見圖4)，總收率81.73%；如采用第3-5批次的甲醇浸提樣品，其純度優(yōu)于之前第1、2批次的樣品，該批次樣品經(jīng)中試規(guī)模純化工藝處理后的純度達到100% (樣品的HPLC檢測圖譜詳見圖5)；至第6-8批次，雖然浸提量僅占總數(shù)的13.33%，但在硅膠柱第二次處理階段即已形成純品，且由于步驟減少，總收率也有一定的提升，為83.99%。

新工藝可從1 t海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987的發(fā)酵液 (BM發(fā)酵水平120 mg/L)中提取并制備87.51%-100%純度的脂肽類化合物樣品 (平均純度97.57%)，收率>81.73% (平均82.04%)，產(chǎn)量為百克量級 (純化樣品干重100.90 g，BM凈含量98.45 g)。

圖4 87.51%純度的BM脂肽樣品的HPLC檢測圖譜Fig. 4 HPLC spectrum of BM series lipopeptides with 87.51% purity.

圖5 100%純度的BM脂肽樣品的HPLC檢測圖譜Fig. 5 HPLC spectrum of BM series lipopeptides with 100% purity.

3 討論

本次研究，首次實現(xiàn)了高純度海洋芽孢桿菌源脂肽類化合物的百克量級的中試規(guī)模制備，可滿足樣品純度和數(shù)量要求較高的研究項目，如農(nóng)藥登記毒理學試驗[37]。無論是百克量級制備規(guī)模還是97.57%的平均樣品純度，均高于目前文獻所報道的最高水平：絮凝-過濾工藝的克量級制備79.5%純度表面活性素[26]，超濾法的克量級制備83%純度表面活性素[27]，以及大孔樹脂吸附法的毫克量級制備68.3%純度伊枯草菌素、77.6%純度芬薺素和91.6%純度表面活性素[25]。

新工藝采取循序漸進去除雜質(zhì)的穩(wěn)健路線，對原料要求較低，允許天然培養(yǎng)基應用于中游大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，且不影響后續(xù)中游發(fā)酵的優(yōu)化等研究，解決了芽孢桿菌源脂肽類化合物中游發(fā)酵生產(chǎn)和下游大規(guī)模純化之間的矛盾，具有實際應用和生產(chǎn)價值。而且工藝過程中規(guī)避不經(jīng)濟的大體積水溶液蒸發(fā)濃縮，解決了脂肽類化合物水溶液濃縮過程中的乳化起泡的難題，具有更好的實用性，易于向其他芽孢桿菌源脂肽類化合物的開發(fā)領域推廣。

雜質(zhì)的多寡對脂肽類化合物下游純化的難易有很大的影響。選擇發(fā)酵培養(yǎng)基時，排除諸如玉米漿、花生餅粉、菜籽餅粉等農(nóng)副產(chǎn)品原料，選擇基于農(nóng)副產(chǎn)品為原材料精制加工后的天然培養(yǎng)基，如蛋白胨和酵母提取物，并與組分明確的合成培養(yǎng)基組成復合培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基營養(yǎng)較寡營養(yǎng)的合成培養(yǎng)基更為豐富，而且雜質(zhì)的種類和數(shù)量都明顯少于粗糙的農(nóng)副產(chǎn)品原料。此外，可對有益于脂肽合成的微量金屬離子進行篩選[38-39]，提高脂肽產(chǎn)量同時對雜質(zhì)數(shù)量的影響相對較小，更有利于下游工藝的純化效果。

再者，2.2中同一批次培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)品的不同批次甲醇浸提樣品，由于雜質(zhì)數(shù)量和種類的不同，最終的純化效果也會有較大的差異。2.1.6中未經(jīng)有機溶劑沉淀法去除油性雜質(zhì) (較低極性的雜質(zhì)) 的2.22%純度的第1、2批次甲醇浸提樣品，不能被硅膠填料所吸附，是BM脂肽與油性雜質(zhì)親和性較好的體現(xiàn)。因而油性雜質(zhì)的分離較為困難，是BM脂肽分離純化最大的難點，經(jīng)過多個單元工藝的分離純化仍然難以完全除盡。2.1.2中甲醇浸提時的平均分配系數(shù)僅為0.11 L/kg，是脂肽與酸化沉淀中的甲醇不溶物具有親和性的表現(xiàn)。然而，油性雜質(zhì)和酸化沉淀中的甲醇不溶物之間并無親和性。這就意味著需要大量甲醇浸提多次才能從酸化沉淀中的甲醇不溶物中浸提出全部BM，而只要少量甲醇浸提1-2次即可將酸化沉淀中的油性雜質(zhì)溶解去除。利用BM脂肽和這兩類雜質(zhì)彼此親和性不同的特點，通過第1、2批次甲醇浸提，以16.67%的BM脂肽被浸提的代價，將酸化沉淀中的油性雜質(zhì)浸提、溶解并除去，此時浸提樣品的餾分呈現(xiàn)油膏狀。之后甲醇浸提酸化沉淀中其余83.33%的BM脂肽時，不利于脂肽分離純化的油性雜質(zhì)明顯減少，因此第3批次之后的甲醇浸提濃縮后的餾分為“干燥”的固體物，且第1、2批次甲醇浸提也溶解并去除了大量的其他雜質(zhì)，因此第3-8批次甲醇浸提物的純度也明顯高于第1、2批次甲醇浸提物。這是同樣純化工藝，第1、2批次甲醇浸提的原料可獲得87.51%純度樣品，而第3-8批次甲醇浸提的原料能夠最終制成100%純度樣品的重要原因。酸化沉淀中的甲醇不溶物與BM脂肽的親和性，對于甲醇浸提較為不利，但是對BM脂肽的純化卻非常有利。

如未來連續(xù)發(fā)酵技術突破瓶頸，在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中獲得廣泛應用，并且適用于脂肽類化合物的發(fā)酵生產(chǎn)，則高成本寡營養(yǎng)但外源雜質(zhì)較少的合成培養(yǎng)基將變得相對經(jīng)濟可行，為可放大的絮凝-過濾工藝、超濾法和大孔樹脂吸附工藝[25-27]提供足夠的脂肽原料，規(guī)模制備脂肽類化合物純化樣品的工藝將變得更為簡單而高效。

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(本文責編 郝麗芳)

March 29, 2016; Accepted: September 12, 2016

Pilot-scale purification of lipopeptide from marine-derived Bacillus marinus

Kangbo Gu1, Cheng Guan1, Jiahui Xu1, Shulan Li2, Yuanchan Luo1, Guomin Shen1, Daojing Zhang1, and Yuanguang Li1
1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Shanghai Zeyuan Marine Biotechnology Co. Ltd., Shanghai 200237, China

This research was aimed at establishing the pilot-scale purification technology of lipopeptide from marine-derived Bacillus marinus. We studied lipopeptide surfactivity interferences on scale-up unit technologies including acid precipitation, methanol extraction, solvent precipitation, salting out, extraction, silica gel column chromatography and HZ806 macroporous absorption resin column chromatography. Then, the unit technologies were combined in a certain order, to remove the impurities gradually, and to gain purified lipopeptide finally, with high recovery rate throughout the whole process. The novel pilot-scale purification technology could effectively isolate and purify lipopeptide with 87.51% to 100% purity in hectograms from 1 ton of Bacillus marinus B-9987 fermentation broth with more than 81.73% recovery rate. The first practical hectogram production of highly purified lipopeptide derived from Bacillus marinus was achieved. With this new purification method, using complex media became possible in fermentation process to reduce the fermentation cost and scale-up the purification for lipopeptide production. For practicability and economy, foaming problem resulting from massive water evaporation was avoided in this technology.

Bacillus marinus, lipopeptide, pilot-scale purification, hectogram, scale-up

Supported by: Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2011BAE06B04-16).

s: Yuanguang Li. Tel/Fax: +86-21-64250964; E-mail: ygli@ecust.edu.cn

Daojing Zhang. Tel/Fax: +86-21-64252104; E-mail: djz@ecust.edu.cn

國家科技支撐計劃 (No. 2011BAE06B04-16) 資助。

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