武漢大學人民醫(yī)院(武漢 430060) 凌 偉 于紅剛 張海菊

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·論著·基礎研究·

瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性研究*

武漢大學人民醫(yī)院(武漢 430060) 凌 偉 于紅剛 張海菊

目的：探討瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系。方法： 隨機選取89例胃癌患者作為研究對象，97例健康體檢者作為正常對照，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測瘦素受體基因rs1137100 和 rs1137101位點的多態(tài)性，同時運用ELISA法測定血清瘦素水平。結(jié)果：胃癌組瘦素受體基因rs1137100位點的AA基因型和A等位基因明顯降低罹患胃癌的風險(P=0.036, OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987;P=0.008, OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833)。rs1137101位點AA和GA基因型與胃癌發(fā)病風險無明顯相關(guān)性。但是，位點rs1137101的A等位基因可能會降低胃癌的發(fā)病幾率(P=0.006, OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802)。胃癌組血清瘦素水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。結(jié)論：瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性密切相關(guān)，瘦素受體基因rs1137100 和rs1137101的A等位基因可能會降低胃癌發(fā)病風險。

胃癌是常見高病死率及高發(fā)病率的惡性腫瘤。中國是胃癌高發(fā)區(qū), 胃癌發(fā)病率居全球第二位[1]。最近,胃癌的發(fā)生有年輕化趨勢,給家庭和社會帶來沉重負擔。然而迄今為止,胃癌的病因及發(fā)病機制仍不甚清楚。已有研究報道，在人的胃粘膜組織及胃癌細胞中均發(fā)現(xiàn)瘦素(Leptin)和瘦素受體(LEPR)表達[2]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素具有促進胃癌細胞增殖和分化作用[3]。本研究檢測胃癌患者血清瘦素水平，同時采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)來檢測瘦素受體基因rs1137100 及 rs1137101位點變異，探討瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性關(guān)系，為胃癌的防治提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1.1 一般資料：病例來源于2013年3月至2014年9月在武漢大學人民醫(yī)院就醫(yī)的胃癌患者。胃癌患者符合如下條件：沒有其他惡性腫瘤病史,無自身免疫性疾病, 并通過內(nèi)鏡形態(tài)和組織病理學檢查無同時并發(fā)惡性腫瘤,血液采樣之前未接受放療和化療。對照組的人群選擇在同一時期在醫(yī)院接受體檢,并沒有任何的消化系統(tǒng)疾病。隨機選擇了89例胃癌患者，與此同時,募集97例健康人作為對照組。兩組一般情況無顯著差異(P>0.05),具有可比性。

1.2 實驗材料及儀器：瘦素ELISA試劑盒由康肽生物科技(北京)有限公司提供，人全血DNA提取試劑盒購自荷蘭QIAGEN公司，反應引物應用Primer 5.0軟件完成初步設計，再交給上?；?GeneCore)生物技術(shù)有限公司合成，內(nèi)切酶購自美國fermentas公司，PCR擴增儀為美國PE. Applied Biosystems公司產(chǎn)品，生化指標用日本OLYMPUSA U-1000全自動生化分析儀檢測。

2 方 法

2.1 血清瘦素水平及血脂測定：抽取清晨空腹靜脈血液檢測血脂指標，同時留取2ml靜脈血離心后取上清液，采用ELISA法測血清瘦素水平。

2.2 瘦素受體基因多態(tài)性檢測：①DNA提?。喝∪虢M者外周血0.5ml,2% EDTA抗凝，用荷蘭QIAGEN公司DNA試劑盒提取DNA。②LEPR引物設計：參照文獻[4]， rs1137100位點引物序列為：正向: 5' - ACTTTTCTAACTTATCCAA - 3'；反向:5' - ATAAGTTAGAAAAGTGAGTA - 3'， rs1137101位點的引物序列為：正向:5' - AGGCAGTTTTCAGATGGTTC - 3'；反向:5' - GTGAACCATCTGAAAACTGC - 3'。③PCR擴增：PCR反應體系25 μl，其中樣本DNA5.0 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，Tag DNA聚合酶0.3 μl，氯化鎂(MgCl2)2.5 μl ，10倍緩沖溶液2.5 μl，4×dNTPs 0.5 μl ，無菌水13.4 μl。PCR擴增法：95℃預變性5min，95℃變性40s，，56℃退火30s，70℃延伸50s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。④ RFLP分析：用Mspl酶消化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段，紫外透視儀下觀察帯型。rs1137100位點有三種基因型，分別為AA基因型(175 bp)，AG基因型(203 bp、175 bp)、GG基因型(203 bp)。rs1137101位點也包含三種基因型，分別是 AA基因型(416 bp)，AG基因型(416 bp、292 bp、124 bp)， GG基因型(292 bp、124 bp)。

結(jié) 果

1LEPR基因多態(tài)性結(jié)果 兩組間基因型GG、AG、AA的觀察值和預期值Hardy-Weinberg平衡吻合度良好(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示個體間無血緣關(guān)系。

2 胃癌組與健康對照組一般臨床資料比較 兩組的性別、年齡、血脂水平無顯著差異(P>0.05)，胃癌組瘦素水平較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 兩組瘦素受體基因型和等位基因頻率的分布比較LEPRrs1137100位點基因型頻率和等位基因頻率在胃癌組和對照組之間分布有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。rs1137100 、rs1137101中AA的基因型頻率均明顯低于對照組 (P<0.05)。rs1137100 和rs1137101多態(tài)性中的A等位基因與胃癌易感性存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，可能會降低患胃癌的風險(OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833;OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802)。而且，rs1137100序列中的AA基因型能顯著降低胃癌的易感性(OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987)。但是，rs1137101 序列中的AG、AA基因型和胃癌易感性沒有明顯關(guān)聯(lián)，見表2。

表1 LEPR rs1137100基因型頻率和等位基因分布頻率

表2 LEPR rs1137101基因型頻率和等位基因頻率

4LEPR基因型對瘦素水平影響LEPRrs1137100 位點GG基因型攜帶者瘦素水平明顯高于AA和AG基因型攜帶者(11.41±1.35vs8.27±2.13kg/m2, P<0.05 )，差異有統(tǒng)計學意義，rs1137101位點不同基因型攜帶者的瘦素水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05 )。

討 論

瘦素是肥胖基因編碼的一種多靶器官、功能廣泛的蛋白激素，其主要通過與LEPR結(jié)合來調(diào)節(jié)機體能量代謝及脂肪沉積。LEPR彌漫表達于各組織細胞中，其基因存在多種變異。在人的胃粘膜組織及胃癌細胞中研究已發(fā)現(xiàn)有瘦素和LEPR的表達[4]，這提示瘦素及其受體對胃癌發(fā)生可能起到重要作用。趙亮等[5]發(fā)現(xiàn)在胃腺癌細胞中可檢測到LEPR異構(gòu)體mRNA的表達。LEPR基因長度約5.1kb,可以編碼1165個氨基酸[6]。在先前的報道中，LEPR基因中位點rs1137100(Lys109Arg、位于2號外顯子)和位點rs1137101(Gln223Arg、位于4號外顯子)的多態(tài)性是研究熱點。他們都與許多疾病有關(guān)[7],包括胃癌。LEPR基因變異發(fā)生于受體編碼胞外區(qū)第一個細胞因子域內(nèi)，該變異導致配體及受體間的親和力受到影響，從而改變了瘦素的生物學效應。有研究提出LEPR基因多態(tài)性導致胃癌發(fā)病的機制可能是：LEPR基因變異發(fā)生于胞內(nèi)區(qū),通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶-2和STAT等眾多信號通路,從而誘導胃癌細胞增殖。韓國一項研究發(fā)現(xiàn)LEPR基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，國內(nèi)應俊、任曉華等[8]研究也表明LEPR多態(tài)性會增加罹患胃癌風險。

本實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，胃癌組中rs1137100位點是AA基因型明顯減少,表明AA基因型降低了胃癌發(fā)病的風險，而AG基因型和胃癌之間沒有顯著相關(guān)性。位點rs1137100的A等位基因會降低49.3%胃癌發(fā)病風險，這與韓國研究結(jié)果有所不同，他們認為基因型GA與基因型AA相比，罹患胃癌的風險會增加2.926倍。然而,另一個研究表明,G等位基因增加脊髓脊膜突出風險,這與我們結(jié)果相似。我們的結(jié)果還表明，雖然位點rs1137101的AA基因型在病例組中偏低,但與胃癌的發(fā)病風險無明顯統(tǒng)計關(guān)聯(lián)，然而位點rs1137101的A等位基因卻可能會降低罹患胃癌風險。這個結(jié)果與那些認為位點rs1137101與胃癌發(fā)病風險無關(guān)的研究有所不同。另外，我們發(fā)現(xiàn)rs113710位點GG基因型胃癌患者瘦素水平明顯高于AA和AG基因型，提示LEPRrs1137100位點多態(tài)性可能與胃癌患者體內(nèi)高瘦素血癥有關(guān)。推測其機制可能是，胃癌患者體內(nèi)LEPRrs1137100變異，致使瘦素受體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，誘發(fā)瘦素抵抗，進而引起高瘦素血癥，高瘦素血癥則通過細胞信號通路介導促進細胞增殖和血管增生，最終導致胃癌易感性增加。而rs1137101位點多態(tài)性則與瘦素水平無明顯相關(guān)。

本次研究證實了瘦素受體基因位點rs1137100和rs1137101的多態(tài)性與胃癌易感性之間存在關(guān)聯(lián)，并且發(fā)現(xiàn)位點rs1137100 和位點rs1137101的A等位基因都可能會降低胃癌發(fā)病風險。由于瘦素受體基因結(jié)構(gòu)復雜、眾多變異且因地域、人種不同而差異，加之各個研究方法的不同，最后導致研究結(jié)果迥異。并且，胃癌發(fā)生發(fā)展是極其復雜的過程，多因素參與其中，單個基因、位點的突變常僅僅作用于發(fā)病的某個環(huán)節(jié)，并不足以致病。因此對于瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系，尚需擴大研究對象來源和樣本量作進一步廣泛而深入研究。

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(收稿：2016-06-19)

The relationship of leptin receptor gene polymorphisms with the susceptibility of gastric cancer

Ling Wei Yu Honggang Zhang Haiju

Renmin Hospial of Wuhan University(Wuhan 430060)

Objective:To analyze the relationship between the leptin receptor (LEPR) gene polymorphisms (rs1137100 and rs1137101) with gastric cancer (GC) susceptibility. Methods:Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was utilized to analyze the polymorphisms of rs1137100 and rs1137101 in 89 GC patients and 97 healthy controls. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detecte the leptin levels in blood. Results:AA genotype and A allele of LEPR rs1137100 were significantly decreased the GC risk (P=0.036, OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987;P=0.008, OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833). No obvious correlation have existed between LEPR rs1137101 AA and GA genotypes and the risk of GC. But, rs1137101 A allele might reduce the GC risk (P=0.006, OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802). The serum leptin level in GC group was higher than that in the controls (P<0.05). Conclusion :The leptin level and LEPR gene polymorphisms (rs1137100 and rs1137101) is highly correlated with susceptibility of GC,A allele of rs1137100 and A allele of rs1137101 might decrease the GC risk.

Stomach neoplasms Leptin @Gene polymorphism

*國家自然科學基金(81272693)

胃腫瘤 瘦素 @基因多態(tài)性

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.001