胡勇軍, 陳家新, 陸 橋

(華南師范大學生物光子學研究院，廣州 510006)

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一種新的生物組織質(zhì)譜成像方法及儀器集成

胡勇軍*, 陳家新, 陸 橋

(華南師范大學生物光子學研究院，廣州 510006)

介紹了一種免標記質(zhì)譜分子成像新技術(shù)，即紅外激光解析/真空紫外激光后電離質(zhì)譜成像方法. 該方法具有樣品前處理簡單，無需人為添加基質(zhì)等優(yōu)點. 同時，這種成像方法還可以通過在時間和空間上獨立優(yōu)化2束激光的波長、強度以及延遲時間來獲得最佳的質(zhì)譜成像探測條件. 首次應用該實驗技術(shù)成功地探測抗癌藥物吖啶黃素在小鼠腎臟組織切片中的空間分布，其空間分辨率低于100 μm，單一成像點檢測靈敏度可達0.1 pmol. 這種新型的質(zhì)譜成像技術(shù)在臨床醫(yī)學和藥物開發(fā)領域具有很好的應用前景.

吖啶黃素； 激光解析電離； 組織成像； 臨床診斷

質(zhì)譜成像是一種新型的原位成像技術(shù)，近年來，此技術(shù)因其能提供高度精確的分子分布信息而在諸多領域受到越來越廣泛的關注. 質(zhì)譜成像具有高靈敏度、高效率以及能夠在復雜的生物體系中同時進行檢測和鑒別多種分子等優(yōu)點，不管是從細胞，還是組織，再到整個活體動物成像，質(zhì)譜成像技術(shù)都可以很好地呈現(xiàn)出被觀察對象的空間分布情況[1-2]. 這種原位分析技術(shù)的原理是利用激光或者離子束使切片表面的分子離子化，然后通過質(zhì)譜測定這種離子化分子的質(zhì)荷比(m/z)，再由軟件重構(gòu)出分析物在組織中分布的圖譜[3]. 常見的質(zhì)譜成像技術(shù)有matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) 成像，電噴霧電離成像等質(zhì)譜成像技術(shù)，但是，這些質(zhì)譜成像技術(shù)有著自身的局限性，對于MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)來說，研究生物大分子有很好的效果，但是對于生物小分子來說，就顯得不是非常方便，尤其是在特定的生物組織這個體系中，這種研究更加的困難. 此外，這種成像技術(shù)需要一種合適的基質(zhì)，這些基質(zhì)在實驗的過程中也會對質(zhì)譜信號產(chǎn)生一定的影響. 對于電噴霧電離質(zhì)譜成像技術(shù)來說，每一個電噴霧的變量(如真空度、電勢、溶劑的揮發(fā)性、溶液的導電性及電解質(zhì)的濃度)都有可能對成像的結(jié)果產(chǎn)生很大的影響,此外，即使在良好的條件下，實驗過程中也存在離子信號的波動[4-5]. 基于這個前提，本文介紹了一種由本研究組提出的質(zhì)譜分子成像新技術(shù)，即紅外激光解析/真空紫外激光后電離質(zhì)譜成像方法. 與其他傳統(tǒng)的質(zhì)譜成像方法相比，該成像方法具有樣品前處理簡單、無需人為添加基質(zhì)等優(yōu)點. 這在某種程度上可以提高實驗的效率以及準確性，同時，這種成像方法還可以在時間和空間上獨立優(yōu)化兩束激光的波長、強度以及延遲時間來獲得最佳的質(zhì)譜成像探測條件.

本文系統(tǒng)介紹了紅外激光解析/真空紫外光電離的實驗原理、實驗室質(zhì)譜成像的儀器集成、實驗室儀器成像的可行性驗證、小鼠腎臟組織切片的制備以及組織成像，并對今后該質(zhì)譜成像技術(shù)在臨床醫(yī)學以及藥物研發(fā)領域的發(fā)展進行了展望.

1 實驗原理及儀器

紅外激光解析/真空紫外光電離飛行時間質(zhì)譜儀的原理如圖1所示，在紅外激光解析/真空紫外激光系統(tǒng)中，解析激光和電離激光在時間和空間上相互獨立，第一束激光一般采用光子能量較小的紅外激光[6-7]，當解析激光照射到承載有樣品的基體上時，被吸收的光在瞬間大部分轉(zhuǎn)換成熱能，并傳遞給待測樣品，使其瞬間氣化/解析[8]. 研究表明，短脈沖激光可以在10 ns時間內(nèi)上升到108K的高溫[9]，如此快的升溫速度，可以避免分子因均勻受熱而發(fā)生裂解，在解析光的照射下，在離靶體表面很近的范圍內(nèi)會形成一個體積約為1 mm3的氣團，包含在該氣團中的大部分為中性離子，其中中性離子所占的比例大約是帶電離子的1 000倍以上[10]. 經(jīng)過一定時間的延遲后，第二束電離激光被聚焦并引入到該氣團，優(yōu)化兩者之間的延遲時間，這樣可以極大地提高電離效率，有助于質(zhì)譜信號的形成，被電離的離子隨后被引入質(zhì)譜儀中進行檢測，第二束激光一般采用真空紫外光，光子的能量大概在10.48 eV，這是一種軟電離技術(shù)，可以有效避免碎片的大量產(chǎn)生[11-12].

圖1 激光解析后電離原理示意圖

Figure 1 The schematic diagram of the principle of laser desorption photoionization

實驗室自主搭建用來進行生物組織質(zhì)譜成像的儀器示意圖分別如圖2、圖3所示，該儀器主要由1個含有多個接口的高真空腔、2臺固體激光器、1個電控三維進樣平臺、1個氣體池、1個電腦操控程序以及1個線性的飛行時間質(zhì)譜儀組成[13].

圖2 激光解析后電離飛行時間質(zhì)譜儀示意圖

Figure 2 The schematic diagram of laser desorption postionization mass spectrometry (LDPI-MS)

圖3 實驗室成像儀器原理示意圖

2臺固體激光器(圖2)中一臺是YAG固體激光器泵浦產(chǎn)生的118 nm 真空紫外激光光源. YAG激光器的工作原理是活性的介質(zhì)3價銣離子受到Xe燈輻射的激發(fā),產(chǎn)生基頻為1 064 nm的激光，該基頻激光經(jīng)過3倍頻得到355 nm的激光，經(jīng)聚焦射入成分比例為1∶10的Xe/Ar氣體池, 產(chǎn)生的118 nm真空紫外光作為電離激光光源. 另外一臺是國產(chǎn)的光泵浦固體激光器，可輸出1 064 nm的激光作為解析激光. 這2臺激光器的工作頻率為10 Hz,通過一臺DG535時間延遲器控制其與記錄設備同步和采集.

三維進樣平臺如圖2所示，是一個與質(zhì)譜真空系統(tǒng)兼容的三維傳動桿實驗裝置，三維平臺的末端固定一個樣品承載平臺，接口處有一個手動的閘板閥將其與外界隔絕開來，在初級的真空接口上通過2個O型的橡膠圈密封，當進樣桿裝置緩緩插入真空系統(tǒng)中時，橡膠圈便通過密封進樣桿將電離室與大氣隔絕. 通過一個前級機械泵對其進行前期的抽取，抽取15 min后關閉前級機械泵. 打開手動的閘板閥,將涂布有樣品的承載平臺送入真空腔中的電離區(qū)[13]. 進樣桿在三維平臺的帶動下運動，進而可以檢測到藥物分子在不同空間位置的信號強度，最后在成像軟件的處理下，獲得藥物分子成像圖. 圖4是實驗室三維平臺進樣系統(tǒng)示意圖.

圖4 三維平臺進樣系統(tǒng)示意圖

2 實驗過程

2.1 實驗樣品

本實驗選擇吖啶類藥物中的吖啶黃素作為實驗的測試樣品，吖啶黃素作為一種吖啶類有機藥物，早期作為處理含有性因子F的大腸桿菌和用于誘變酵母菌產(chǎn)生小菌落的藥物，作用十分有限. 近年來，吖啶黃素其他用途也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，研究表明，吖啶黃素對于某些特殊的腫瘤具有抑制作用，這使人們對吖啶黃素的抗癌研究更加深入[14-15]，本實驗采用一種新型的生物組織質(zhì)譜成像法，對該抗腫瘤藥物進行檢測和研究.

2.2 實驗儀器成像能力的測試實驗

在進行動物組織成像實驗之前，先對這套實驗儀器成像的可行性進行初步的測試實驗. 用亞甲基藍(m/z為320)染料在承載基底(剛玉棒)上描繪出英文字母“SCNU”,即華南師范大學英文名字的首字母縮寫(South China Normal University). 然后送入質(zhì)譜成像系統(tǒng)中進行成像(圖5). 下圖為實物圖,上圖為質(zhì)譜成像圖. 結(jié)果表明：應用所搭建的質(zhì)譜成像系統(tǒng)完全可以開展分子成像相關的實驗.

圖5 “SCNU”的質(zhì)譜成像圖以及實物圖

Figure 5 The LDPI-MS image of “SCNU” and the corresponding digital photo

2.3 組織切片制備及組織成像

在上述實驗的基礎上進行小鼠腎臟的檢測實驗，該實驗中，首先需要制作動物的腎臟組織切片，組織切片的制作過程如下：從廣東省醫(yī)學動物實中心購買3只Balb/c 雄性小鼠，6～7周齡，質(zhì)量約為20 g，通過斷頸法將3只小鼠致死，1 h后，取出小鼠腎臟，放在-80 ℃的冰箱中保存冷凍，約30 min后，取出腎臟組織，放在徠卡冷凍切片機上切片，切片的厚度控制在250 μm左右，將切片轉(zhuǎn)移到樣品桿上，接著向組織切片上均勻滴加10 μL 1 mg/L的吖啶黃素標準溶液，待組織風干后在質(zhì)譜儀中檢測. 探測獲得的成像如圖6所示.

圖6 組織成像圖

3 結(jié)論

通過將探測獲得的質(zhì)譜圖與實物圖進行對比，所提出的分子成像技術(shù)很好地呈現(xiàn)了抗腫瘤藥物吖啶黃素在組織當中的空間分布，分辨率可達100 μm，且單一成像點檢測極限低于0.1 pmol. 與傳統(tǒng)的質(zhì)譜成像方法(如基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜成像、電噴霧解析電離質(zhì)譜成像等)相比，本文的紅外激光解析/真空紫外激光后電離質(zhì)譜成像法具有樣品前處理簡單、耗時短、無基質(zhì)干擾、可重復性好等優(yōu)點. 此外，該方法還可以從時間和空間上進行單獨優(yōu)化，這是其他的方法無法做到的. 在未來幾年，隨著質(zhì)譜成像技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，這種新型的生物組織質(zhì)譜成像方法將在臨床醫(yī)學上具有很大的應用前景，尤其是在腎臟疾病診斷和藥物開發(fā)領域具有不可忽視的作用.

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【中文責編：成文 英文責編：肖菁】

A New Mass Spectrometry Imaging Technique for Biological Tissue and Instruments Integration

HU Yongjun*, CHEN Jiaxin, LU Qiao

(College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A new mass imaging technique for biological tissues using laser desorption postionization mass spectrometry is proposed. This technique does not require multiple sample preparation and avoids the spectra interferences. Moreover, this imaging method can be used to optimize wavelength independently of two laser beams in time and space. It also can adjust the delay time between the desorption laser and the ionization laser. The first application of this experimental technique was applied successfully to detect the spatial distribution of anticancer drug, c14h15n3cl2, in mouse kidney tissues. This helps us get the best mass spectra and images with a resolution of 100 μm and a limit of 0.1 pmol. All the results show that this new imaging technique is promising in the areas of clinical medicine and medicinal development in the future.

acriflavine; laser desorption ionization; tissue imaging; clinical diagnosis

2016-05-27 《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目(21273083, U1332132)

O43

A

1000-5463(2016)06-0063-04

*通訊作者:胡勇軍，教授，Email: yjhu@scnu.edu.cn.