曹 雨， 陳章輝， 區(qū)丁文， 張盛春， 陽(yáng)成偉,2*

(1. 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631; 2. 連州市東籬種養(yǎng)實(shí)業(yè)有限公司， 連州 513400)

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墨西哥玉米草組培體系的建立及愈傷組織切片觀察

曹 雨1， 陳章輝1， 區(qū)丁文1， 張盛春1， 陽(yáng)成偉1,2*

(1. 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631; 2. 連州市東籬種養(yǎng)實(shí)業(yè)有限公司， 連州 513400)

采用墨西哥玉米草 “8493” 種子為實(shí)驗(yàn)材料，在含有2，4-D和6-BA的MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)幼苗基部的膨大節(jié)間，以膨大節(jié)間為外植體在黑暗條件下兩周誘導(dǎo)出胚性愈傷組織．將愈傷組織移到含有6-BA 、KIN和NAA分化培養(yǎng)基中，于光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗，25±2 ℃)培養(yǎng)得到分化苗，生根后移栽獲得健壯的墨西哥玉米草植株；對(duì)誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織采用石蠟切片法進(jìn)行鑒定，通過(guò)切片中愈傷組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，細(xì)胞核大，染色較濃，細(xì)胞規(guī)則且連接緊密，可判定此體系誘導(dǎo)的愈傷組織為胚性愈傷組織．

墨西哥玉米草； 膨大節(jié)間； 組織培養(yǎng)； 胚性愈傷組織

墨西哥玉米草(Zeamaysspp.mexicanaL)，又名大芻草，是玉米(Z.mays)的野生近緣種，墨西哥玉米草原產(chǎn)于中美洲的墨西哥，我國(guó)于1979從國(guó)外引進(jìn)，現(xiàn)在我國(guó)河南、河北、山西和廣東等地種植．禾本科墨西哥玉米草屬一年生多茬高產(chǎn)飼料作物，飼草產(chǎn)量與多種因素相關(guān)，馮云超等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，種植密度、施氮量、主莖粗、分蘗數(shù)、葉寬、單株鮮質(zhì)量等與飼草產(chǎn)量呈正相關(guān)，單株鮮質(zhì)量與密度、草長(zhǎng)、主莖粗、分蘗數(shù)、葉寬、葉面積顯著相關(guān)． 墨西哥玉米草葉片寬大，對(duì)地面形成長(zhǎng)期郁蔽，使得雜草不容易生長(zhǎng)，易于種植[2]． 墨西哥玉米草有良好的再生性，可延長(zhǎng)青草的供應(yīng)時(shí)期，作為牛、羊、豬、魚、兔等的青飼料，墨西哥玉米草的干草又可作為良好的貯存飼料．

墨西哥玉米草是短日照植物，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，耐熱，因此墨西哥玉米草主要在南方種植，在北方不易正常開(kāi)花結(jié)實(shí)[3]，蔣安等[4]研究了墨西哥玉米草幼苗對(duì)低溫的脅迫響應(yīng)，選育出了較抗寒的墨西哥玉米草品種，可在一定程度上解決墨西哥玉米草不耐寒這一問(wèn)題． 種植墨西哥玉米草可有效提高土壤中石油烴的降解[5]，在石油烴等有機(jī)物污染的環(huán)境修復(fù)中具有重要的意義． 氮、磷、鉀和鋅肥配施能顯著提高墨西哥玉米草產(chǎn)量, 并改善其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[6].

玉米是我國(guó)重要的糧食作物之一，但由于玉米主要是有人工馴養(yǎng)，在抗逆性及抗病性方面都有很大不足，墨西哥玉米草是玉米的野生近緣種，在野生環(huán)境中形成了多種優(yōu)良的品質(zhì)，因此可為玉米改良提供重要的基因資源． 同時(shí)也可以通過(guò)雜交將墨西哥玉米草中的基因引入到玉米基因組中[7]，但是雜交過(guò)程中也容易將墨西哥玉米草中不利的基因帶到玉米當(dāng)中，所以組培及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在優(yōu)良玉米草作物遺傳育種當(dāng)中也勢(shì)在必行[8],而得到具有胚性的墨西哥玉米草愈傷組織是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

墨西哥玉米草“8493”(Zeamaysspp.mexicanaL)種子，來(lái)自華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物器官發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室．

1.2 方法

1.2.1 種子消毒處理 選擇實(shí)驗(yàn)室已有的墨西哥玉米草“8493”種子，將種子置于錐形瓶中，加水后將浮在表面的種子撇除，留下籽粒飽滿的種子，加少量洗潔精浸泡半天，使其易于剝殼，半天后將水倒掉，把種子倒在濾紙上，吸干水分，去掉墨西哥玉米草種子外殼，將剝出的種子置于干凈的錐形瓶中，用滅菌水清洗1～2次后，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗2 min，再用滅菌水沖洗1～2次，然后分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)2% NaClO和4% NaClO消毒30 min和60 min，最后轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，用滅菌水洗滌6～8次后，將種子鋪在濾紙上，吸干種子表面水分，將洗好的種子鋪在種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS+5 mg/L 2,4-D+3 mg/L 6-BA+質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)3%蔗糖，pH 5.8)上． 比較不同質(zhì)量濃度的消毒液及不同的消毒時(shí)間對(duì)滅菌的效果及種子萌發(fā)情況的影響． 每天記錄種子的萌發(fā)情況及污染情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．

1.2.2 種子萌發(fā)處理 將鋪有4個(gè)不同消毒程度的種子的培養(yǎng)皿置于(25±2)℃光照培養(yǎng)箱中光照條件下培養(yǎng)，每天觀察種子萌發(fā)生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率及種子萌發(fā)最佳時(shí)間，同時(shí)觀察膨大節(jié)間的形成情況，并統(tǒng)計(jì)膨大節(jié)間的形成率． 1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo) 選取獲得的墨西哥玉米草膨大節(jié)間，去除莖部和種子，將膨大節(jié)間縱向切成兩半，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L KIN+0.5 mg/L NAA+1.5%蔗糖，pH 5.8)上，剖面貼近培養(yǎng)基，然后置于(25±2)℃黑暗培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～3周，統(tǒng)計(jì)將膨大節(jié)間的愈傷組織誘導(dǎo)率，然后將誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織從膨大節(jié)間上剝離下來(lái)，置于新配制的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，繼續(xù)置于(25±2)℃黑暗培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)和繼代．

1.2.4 愈傷組織分化培養(yǎng) 將培養(yǎng)出的嫩黃色的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上(MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L KIN+0.5 mg/L NAA+1.5%蔗糖，pH 5.8)，置于光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗，25±2 °C)培養(yǎng)3～4周，待分化芽長(zhǎng)出后進(jìn)行移栽．

1.2.5 植株生根培養(yǎng) 將分化芽取出，置于未添加激素的生根培養(yǎng)基(MS，pH 5.8)上，光照培養(yǎng)箱(25±2)℃光照培養(yǎng)，1～2周后生根．

1.2.6 植株移栽 將生根的墨西哥玉米草移栽到泥炭土：蛭石(3∶1)的盆土中，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)．

1.2.7 石蠟切片 方法參照李丹等[9]的整體染色切片法進(jìn)行切片． 主要流程為：固定→染色→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片貼片展片→脫蠟→封片觀察．

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析，利用Adobe Photoshop CS3對(duì)圖片進(jìn)行處理．

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的獲得

2.1.1 種子滅菌條件的確定 4% NaClO消毒效果明顯比2% NaClO更好(表1)，可顯著降低墨西哥玉米草種子的染菌率. 不同的消毒時(shí)間也對(duì)墨西哥玉米草種子的染菌率有影響，當(dāng)用4% NaClO消毒60 min時(shí)，染菌率幾乎為0，此時(shí)種子的發(fā)芽率與4% NaClO消毒30 min的發(fā)芽率相近，因此，選取4% NaClO消毒60 min進(jìn)行種植滅菌處理．

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaClO及不同處理時(shí)間對(duì)墨西哥玉米草種子滅菌效果的影響

2.1.2 膨大節(jié)間的獲得 種子消毒處理后在培養(yǎng)基上(25±2) ℃光照1～2周后，長(zhǎng)出幼苗，在幼苗基部有顏色較深的節(jié)間膨大部位(圖1A、B)，在無(wú)菌條件下切取膨大節(jié)間，在濾紙上用解剖刀將膨大節(jié)間縱向切開(kāi)，切面貼于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(圖1C)，(25±2) ℃黑暗培養(yǎng)2～3周后，膨大節(jié)間上開(kāi)始形成愈傷組織，同時(shí)膨大節(jié)間褐化.

A：墨西哥玉米草種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后發(fā)芽形成的帶有膨大節(jié)間的無(wú)菌苗；B：縱向切開(kāi)的膨大節(jié)間，剖面貼于培養(yǎng)基；C：玉米草幼苗基部膨大節(jié)間放大圖.

圖1 墨西哥玉米草的種子萌發(fā)及膨大節(jié)間的形成

Figure 1 Germination and swelled internodes ofZeamaysspp.mexicanaL

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞學(xué)觀察

2.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 墨西哥玉米草組培體系的關(guān)鍵在于獲得幼苗基部的膨大節(jié)間，當(dāng)種子直接播種在土壤中時(shí)，萌發(fā)速率快，萌發(fā)率很高，但是幼苗基部節(jié)間處無(wú)膨大結(jié)構(gòu)，而在含有2,4-D和6-BA的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上時(shí)，萌發(fā)速率慢，且萌發(fā)率很低，可得到有膨大節(jié)間的幼苗． 膨大節(jié)間在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出愈傷組織，隨著愈傷組織的誘導(dǎo)，節(jié)間也會(huì)隨之褐化，在3周左右須將愈傷組織從褐化的膨大節(jié)間上剝離下來(lái)，移到新的胚性愈傷組織培養(yǎng)基上(圖2A). 剛開(kāi)始誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織表面具有透明的黏液包裹，使愈傷組織不易分散，但黏液會(huì)隨著繼代的次數(shù)增多而減少，其具體作用有待研究.

2.2.2 愈傷組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu) 胚性愈傷組織具有完整的胚胎發(fā)生能力，生長(zhǎng)速度較快，愈傷組織剝離出來(lái)容易擴(kuò)大培養(yǎng)，具有更大的應(yīng)用價(jià)值，而非胚性愈傷組織生長(zhǎng)速度緩慢，易褐化，不適于通過(guò)生物學(xué)手段進(jìn)行個(gè)體的改良應(yīng)用[10-11]． 墨西哥玉米草愈傷組織呈嫩黃色致密狀態(tài)，表面有一層粘液包裹(圖2A、B)，易擴(kuò)大培養(yǎng)，初步鑒定為胚性愈傷組織. 對(duì)墨西哥玉米草愈傷組織石蠟切片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞呈規(guī)則的圓形，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核較大，著色較深，符合胚性愈傷組織特征(圖2C)，而非胚性愈傷細(xì)胞較大，胞質(zhì)稀薄，無(wú)體細(xì)胞胚發(fā)生能力[11].

A: 膨大節(jié)間在黑暗條件下(25±2) ℃暗培養(yǎng)18 d形成的愈傷組織；B:愈傷組織放大結(jié)構(gòu)，外表呈嫩黃色，結(jié)構(gòu)致密，有黏液包裹；C：愈傷組織石蠟切片下細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，連接致密，細(xì)胞核大.

圖2 墨西哥玉米草愈傷組織及其細(xì)胞形態(tài)

Figure 2 Callus tissue and cell morphological characters ofZeamaysspp.mexicanaL

植物的胚胎發(fā)生過(guò)程主要包括3步：原胚形成、胚的分化和胚的成熟. 愈傷組織主要的活動(dòng)發(fā)生在胚的分化這一階段，與母體相連，從母體上逐漸分化出來(lái)，在同一時(shí)期的胚性愈傷組織中，發(fā)現(xiàn)了分化程度不同的胚型，有早期球型胚，細(xì)胞致密，增殖分化能力很強(qiáng)(圖3A)；有后期球型胚，增殖分化能力旺盛的細(xì)胞主要集中在球型胚的頂端及周圍，與母體相連的部分細(xì)胞逐漸變長(zhǎng)變大(圖3B)；有類心型胚(圖3C)，不同于雙子葉的心型胚，它的增殖旺盛的細(xì)胞并不呈對(duì)稱分布，而是偏向于一端頂部；還有子葉成熟胚(圖3D)，在頂端集中了分裂分化旺盛的細(xì)胞群.

綜上所述，通過(guò)墨西哥玉米草無(wú)菌幼苗基部膨大節(jié)間所誘導(dǎo)出的愈傷組織為胚性愈傷組織.

2.3 胚性愈傷組織的分化鑒定

墨西哥玉米草幼苗基部膨大節(jié)間所誘導(dǎo)的愈傷組織為胚性愈傷組織后，對(duì)愈傷組織進(jìn)行分化處理，將所誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到光照條件下培養(yǎng)，4 d愈傷組織開(kāi)始變綠，2周后已經(jīng)長(zhǎng)出絲狀幼葉(圖4A)，幼葉呈透明嫩綠狀，還不具有成型的玉米草結(jié)構(gòu)(圖4B). 4～5周愈傷組織可分化出成型的幼苗，將其移到不帶激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根(圖4C)，生根的過(guò)程中，開(kāi)始是白色的較短的須狀根，再過(guò)段時(shí)間變成紅色的很長(zhǎng)的須狀根. 在長(zhǎng)出白色短根時(shí)即可移栽到土壤中培養(yǎng)，但成活率稍低于紅色長(zhǎng)根時(shí)的移栽成活率(圖4D)．

A:早期球型胚；B：晚期球型胚；C：類心型胚；D：成熟子葉胚．

圖3 同時(shí)期墨西哥玉米草愈傷組織切片觀察

Figure 3 Callus tissue sections ofZeamaysspp.mexicanaL

A：愈傷組織轉(zhuǎn)移到光照條件下(25±2) ℃光照培養(yǎng)后分化成苗； B：?jiǎn)蝹€(gè)分化愈傷組織放大圖；C：將分化苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的生根情況；D：生根的墨西哥玉米草轉(zhuǎn)移至土壤中的生長(zhǎng)情況．

圖4 墨西哥玉米草愈傷組織分化培養(yǎng)

Figure 4 Differentiation plantlet from callus ofZeamaysspp.mexicanaL

3 討論

墨西哥玉米草作為新型高產(chǎn)飼料而廣泛被種植研究，關(guān)于墨西哥玉米草的栽培技術(shù)研究較多,如日照、溫度、光周期及氮磷鉀肥等不同條件對(duì)墨西哥玉米草的栽培與刈割情況的影響等[4,6-7,12-13]，生物有機(jī)肥等對(duì)墨西哥玉米草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響[14-17]，墨西哥玉米草及其近緣種雜交選育[3,18]和墨西哥玉米草核型分析[19]等方面. 王靈芝等[8]對(duì)玉米與墨西哥玉米草雜交后代進(jìn)行了組織培養(yǎng)，然而對(duì)墨西哥玉米草的組培體系還未見(jiàn)報(bào)道．

墨西哥玉米草組培體系的建立對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要. 建立組培體系的第一步就是外植體的選取，多數(shù)報(bào)道選擇成熟胚作為外植體來(lái)誘導(dǎo)胚性愈傷[20-21]，短芒大麥草利用幼穗為外植體[22]，白羊草以成熟種子為外植體[23]，苜蓿以真葉為外植體[24]． 本研究中借鑒玉米組培體系[25]，將墨西哥玉米草“8493”的種子消毒后，在添加有6-BA和2,4-D激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后發(fā)芽形成的帶有膨大節(jié)間的無(wú)菌苗，選取膨大節(jié)間在27℃黑暗條件下可誘導(dǎo)出愈傷組織．

遺傳轉(zhuǎn)化并獲取轉(zhuǎn)基因植株的前提是具有分化能力較好的，具有胚發(fā)生能力的胚性愈傷組織，便于目的基因的插入[26]． 對(duì)于胚性愈傷組織的觀察，其描述各不相同，李紅等[11]研究中的苜蓿胚性愈傷組織是呈致密的淡綠色，且表面粗糙，有顆粒狀凸起，林慶良等[27]研究中的甘蔗胚性愈傷組織是呈淺黃色的致密組織，尤培雷等[10]研究中的黃秋葵胚性愈傷組織為黃白色或淺綠色的米狀致密組織，但胚性愈傷組織都有愈傷組織致密，生長(zhǎng)繁殖速度快，不易褐化等特點(diǎn)． 觀察發(fā)現(xiàn)墨西哥玉米草愈傷組織呈嫩黃色致密狀態(tài)，表面有一層粘液包裹，易擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)一步通過(guò)石蠟切片細(xì)胞學(xué)觀察所誘導(dǎo)的愈傷組織符合胚性愈傷組織特征，為深入研究墨西哥玉米草的基因功能和遺傳改良奠定了基礎(chǔ).

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【中文責(zé)編：成文 英文責(zé)編：李海航】

The Establishment of Teosinte Tissue Culture and Callus Section Observation

CAO Yu1, CHEN Zhanghui1, OU Dingwen1, ZHANG Shengchun1, YANG Chengwei1,2*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science， South China Normal University，Guangzhou 510631， China； 2. Dongli Planting and Farming Industrial Co., LTD of LianZhou City, Lianzhou 510631， China)

Zeamaysspp.mexicanaLplays an important role in animal husbandry, in-depth study of teosinte has important scientific value and economic benefits. Though many studies on the hybridization between teosinte and closely related species of maize have been reported, little research on the tissue culture of teosinte is reported. Here, establishment of technique system of tissue culture for teosinte was made using the variety ‘8493’ ofZeamaysspp.MexicanaLas explants. The high totipotency swelling of the cultured internode was induced from teosinte seeds in the MS culture medium added 2,4-D and 6-BA and subcultured in the dark for induction of callus of teosinte about 2 weeks. The callus are authenticated to embryonic callus by paraffin section observation.

Zeamaysspp.mexicanaL； swelled internodes； tissue culture； embryonic callus

2016-06-21 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

廣東省農(nóng)村科技領(lǐng)域公益研究與建設(shè)項(xiàng)目(2015A020209155, 2016A020208014 )；“揚(yáng)帆計(jì)劃”引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)(2015YT02H032)

Q943.1

A

1000-5463(2016)06-0019-06

*通訊作者:陽(yáng)成偉，教授，珠江學(xué)者，Email: Yangchw@scnu.edu.cn.