許紀(jì)玲,蔡 杰,陸玉婷,蔡旭兵,楊永林

(南京紅十字血液中心,江蘇 南京210003)

?

RhD和HBsAg雙表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)研究

許紀(jì)玲,蔡 杰,陸玉婷,蔡旭兵,楊永林*

(南京紅十字血液中心,江蘇 南京210003)

人類Rh血型系統(tǒng)是臨床上最重要的血型系統(tǒng)之一，是人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)最具有多態(tài)性的血型系統(tǒng)。到目前為止已發(fā)現(xiàn)了至少49種不同抗原，其中與臨床相關(guān)的主要抗原為D、C、E、c和e等5種。Rh血型抗原定位于人類1號染色體短臂1p34.3-lp36.1，分別編碼2個非糖基化的疏水性跨膜蛋白質(zhì)RhD和RhCE[1]。RhD和RhCE基因同源性高達(dá)96%-97%。其中D抗原具有很強(qiáng)的免疫原性，抗原抗體的不相容能引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血[2,3]，因此RhD基因的研究有著重要的指導(dǎo)意義，將HBsAg和RhD構(gòu)建在同一載體中，可以通過對HBsAg作為表達(dá)檢測指標(biāo)，簡易快捷的了解RhD的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株 大腸桿菌DH5a本實(shí)驗(yàn)保留菌種，真核表達(dá)載體pIRES購自clontech公司，K562細(xì)胞株購自昆明細(xì)胞庫。血液樣本經(jīng)檢測RhD為陽性的獻(xiàn)血者。

1.1.2 試劑 DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI、MluI、XbaI、SalI、聚合酶Pfu均購置于Fermentas公司，DNA Ligation Kit (Takara，D6020A)、Takara Agarose Gel DNA Purification Kit(Takara，DV805A)，pMD18-T VectorT (Takara，D101A)均購自大連寶生物有限公司，TIANpure Midi Plasmid Kit(DP107)購自天根生化科技(北京)有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(，CAT NO.11668-027)購自美國invitrogen公司，QIAamp DNA Mini Kit(CAT NO.51106)購自德國QIAGEN公司，人抗RhD多克隆抗體及HRP標(biāo)記羊抗人球蛋白抗體購自武漢博士德有限公司，HBsAg檢測試劑合購自英科新創(chuàng)生物有限公司。

1.1.3 引物及測序 根據(jù)RhD的基因組DNA選取特異性序列區(qū)域，使用online設(shè)計軟件設(shè)計擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增RhD的9個外顯子，具體序列見表1，并設(shè)計用于拼接RhD的外顯子的引物，具體序列見表2。根據(jù)克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計克隆用引物，將拼接得到的完整RhD基因序列克隆入pIRES載體中，并在下游克隆位點(diǎn)處克隆入HBsAg序列，具體序列見表3。所有引物及測序均上海生工有限工公合成。

表1 RhD的9個外顯子的擴(kuò)增引物序列

表2 RhD的9個外顯子進(jìn)行兩兩拼接的特異性拼接引物序列

表3 RhD和HBsAg克隆入pIRES載體中的克隆引物序列

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增RhD外顯子 取200 ml RhD陽性的全血使用QIAamp DNA Mini kit提取基因組DNA，方法參見試劑使用說明。采用Pfu聚合酶及相應(yīng)九對特異性擴(kuò)增引物分別擴(kuò)增出對應(yīng)的RhD基因的9個外顯子[4]。經(jīng)電泳鑒定后切膠回收分別克隆入PMD18T中，挑選插入目的片段的菌落送交測序，經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對進(jìn)一步挑選出外顯子序列完全正確的克隆。

1.2.2 拼接全長RhD基因 在9個外顯子兩端設(shè)計重疊互補(bǔ)引物，使得相鄰兩個外顯子帶有相互末端的重疊序列。采用重疊延伸拼接法進(jìn)行兩兩拼接，最后拼接成為完整的RhD序列。將拼接完成的外顯子序列克隆入PMD18T中，挑選插入目的基因的菌落送交測序，挑選出與NCBI基因序列上完全一致的陽性克隆。

1.2.3 pIRES雙克隆載體的構(gòu)建 用pIRES的克隆引物擴(kuò)增RhD全基因，將擴(kuò)增得到的目的片段和pIRES載體用EcoRI，MluI限制性DNA內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將雙酶切后的目的基因和pIRES載體進(jìn)行切膠回收后，進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆。得到pIRES-RhD的重組質(zhì)粒，RhD在上游克隆位點(diǎn)上。再用pIRES的克隆引物擴(kuò)增HBsAg基因，將擴(kuò)增得到的目的片段和pIRES-RhD載體用XbaI，SalI限制性DNA內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將雙酶切后的目的基因和pIRES-RhD載體進(jìn)行切膠回收后，進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆?？寺BsAg基因到pIRES-RhD的下游克隆位點(diǎn)上，最終得到pIRES-RhD-HBsAg的雙表達(dá)載體，具體流程圖見圖1。

1.2.4 pIRES-RhD-HBsAg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將K562細(xì)胞接種于6孔板中，每孔3 ml的RPMI1640完全培養(yǎng)基，待生長到1×106/ml時即可用于轉(zhuǎn)染[5]，轉(zhuǎn)染前更換新鮮培養(yǎng)基。取14 μg待轉(zhuǎn)質(zhì)粒溶于150 μl Opti-MEM；取12 μl Lipofectamine 2000稀釋于150 μl Opti-MEM。將稀釋的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑1∶1混合后室溫放置5 min。6孔板中每孔放入250 μl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑混合物。放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，分別檢測HBsAg和RhD抗原的表達(dá)。

圖1 pIRES-RhD-HBsAg載體構(gòu)建示意圖

1.2.5 RhD抗原及HBsAg的檢測 取轉(zhuǎn)染后40小時的細(xì)胞，約5×106，離心去上清，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液200 μl，混均，并煮沸5 min，12000 g離心5 min，保留上清用WB檢測。轉(zhuǎn)膜后常規(guī)BSA封閉1 h，加入抗RhD多克隆抗體(1∶200)，常溫孵育1 h，洗膜后加入HRP標(biāo)記羊抗人球蛋白抗體(1∶10 000)，常溫孵育1 h，最后采用化學(xué)發(fā)光方法曝光。取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測HBsAg，詳細(xì)方法參見試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 RhD9個外顯子的擴(kuò)增片段，電泳結(jié)果見圖2A，條帶大小均正確。RhD片段兩兩拼接產(chǎn)物電泳見圖2B。

2.2 克隆得到的pIRES-RhD-HBsAg雙表達(dá)載體的雙酶切鑒定

限制性內(nèi)切酶EcoRI、MluI37℃對pIRES-RhD-HBsAg進(jìn)行雙酶切，完全消化后進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖3A，結(jié)果表明插入片段大小正確。同樣以限制性內(nèi)切酶XbaI、SalI37℃對pIRES-RhD-HBsAg進(jìn)行雙酶切，完全消化后進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖3B，結(jié)果表明插入片段大小正確。

A：RhD的9個外顯子擴(kuò)增片段。1-9為RhD的9個外顯子擴(kuò)增片段，M：DL2000；B：RhD的兩個相鄰的外顯子片段拼接為一個長片段。1、2：相鄰的兩個外顯子片段，3：兩個外顯子片段拼接而成的長片段，M：DL2000。

圖2 RhD外顯子的擴(kuò)增與拼接

圖A：EcoRI，MluI雙酶切電泳圖。1、2：兩pIRES-RhD-HBsAg克隆，M：DL2000；圖B：XbaI、SalI雙酶切電泳圖。1、2：兩pIRES-RhD-HBsAg克隆，M：DL2000

圖3 質(zhì)粒的酶切與鑒定

2.3 RhD及HBsAg檢測結(jié)果

細(xì)胞用于RhD檢測，WB結(jié)果見圖4，條帶大小約32 Kd，和RhD分子量大小一致。pIRES-RhD-HBsAg轉(zhuǎn)染后的上清用于HBsAg的ELISA檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞有效表達(dá)并分泌HBsAg，結(jié)果見表4。

1、2：均為pIRES-RhD-HBsAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Lane3：pIRES轉(zhuǎn)染細(xì)胞

圖4 RhDWB檢測結(jié)果

3 討論

Rh血型系統(tǒng)的相關(guān)基因序列有著高度的同源性。Rh血型抗原活性是由紅細(xì)胞表面的Rh蛋白和Rh相關(guān)糖蛋白組裝而成的復(fù)合物所決定，它們分別受控于1號染色體上2個緊密連鎖的RhD和RhCE基因，以及6號染色體上的RhAG基因，到2007年5月為止，使用基因分型技術(shù)檢測出的等位基因已超過200個，其中RhCE座位上47個，RhD座位上145個，RhAG座位上13個[5]。

RhD變異體包含3類：弱D，部分D，DEL[6]。雖然這3類變異體的分子機(jī)理尚未完全明了，但是主要是由于RhD上的堿基位點(diǎn)發(fā)生突變，缺失，外顯子的拼接發(fā)生錯誤，以及由于RhD和RhCE基因發(fā)生重組產(chǎn)生的，因此能夠完整的高保真的擴(kuò)增得到RhD的基因?qū)τ谶M(jìn)一步研究RhD的抗原反應(yīng)有著重要的意義。目前國內(nèi)相關(guān)研究多是克隆RhD的部分功能區(qū)域，或者采用反轉(zhuǎn)錄的方法從RNA中獲取RhD的基因，但是由于Rh系統(tǒng)相關(guān)基因的高度同源性并不能擴(kuò)得完全一致的RhD基因，一般經(jīng)序列比對只能達(dá)到97%-98%的匹配度。以這樣的序列進(jìn)行進(jìn)一步的研究不能夠得到非?？煽靠尚诺慕Y(jié)果。

傳統(tǒng)方法從富含網(wǎng)織紅的骨髓中提取RNA模板，進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)直接從普通紅細(xì)胞中提取基因組DNA，采用外顯子直接擴(kuò)增后拼接的方法得到完整的RhD序列。實(shí)驗(yàn)原料更加容易獲得，更適合普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。

本實(shí)驗(yàn)采用pIRES雙表達(dá)載體構(gòu)建雙基因克隆載體。pIRES能在細(xì)胞基因組外擴(kuò)增并表達(dá)目的基因，具有多拷貝、強(qiáng)啟動、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，它在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率較高。具有巨細(xì)胞病毒啟動子、腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entrysite，IRES)，IRES連接兩個開放閱讀框，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在翻譯時，核糖體能同時進(jìn)入并開始翻譯IRES上游及下游的兩個轉(zhuǎn)錄子。兩種基因可同時表達(dá)，表達(dá)的蛋白無需經(jīng)過加工和修飾，具有天然的生物學(xué)活性。pIRES-RhD-HBsAg載體可以同時表達(dá)兩種蛋白，通過檢測上清液HBsAg的基因表達(dá)請況就可以了解膜蛋白RhD的基因轉(zhuǎn)錄情況。在本實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用構(gòu)建的雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞[7]，經(jīng)轉(zhuǎn)染后通過商品化HBsAg的ELISA檢測試劑盒檢測上清可以很明確的檢測到HBsAg的表達(dá)，且檢測到RhD抗原的表達(dá)。

本研究對RhD全序列進(jìn)行了克隆表達(dá)，尚沒有包括RhD基因的其他突變體和剪接體[8]，但是為將來進(jìn)一步進(jìn)行RhD不同基因型的研究起到鋪墊作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明RhD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是成功。但是RhD的抗原活性還和其他一些Rh相關(guān)蛋白有著協(xié)同作用[9-11]，這些作用尚不明確。這些都將是我們進(jìn)一步研究和所要解決的問題。

[1]Vent ND,Reid Me.THe Rh blood group system:a review[J].Blood,2000,95:375.

[2]李翠瑩，穆士杰，鄭 巖.血型不規(guī)則抗體篩選在臨床輸血中的意義[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002,23(24)：2327.

[3]Daniels GL,Anstee DJ,Cartron JP,et al.ISBTworking party on terminology for red cell surface antigens [J ] .Vox Sang,2001,80:193.

[4]蘭炯采，陳 強(qiáng)，孫 倩，等.RhD 基因外顯子多態(tài)性觀察[J].中國免疫學(xué)雜志，2000,16(5)：284.

[5]Blumenfeld OO.Patnaik SK,Allelic genes of blood group antigens:a source of human mutations and cSNPs documented in the Blood Group Antigen Gene Mutation Database[J].Human Mutation,2004,23(1):8.

[6]李翠瑩，穆士杰，鄭 巖.血型不規(guī)則抗體篩選在臨床輸血中的意義[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002,23(24)：2327.

[7]嚴(yán)力行,許先國,朱發(fā)明,等.RhD 基因的克隆及其在K562 細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2005,13(3):492.

[8]許先國,吳俊杰,洪小珍,等.鑒定9個新的RhD基因mRNA可變剪接體[J].遺傳,2006,28(10): 1213.

[9]Mouro-Chanteloup I,D’Ambrosio AM,Gane P,et al.Cell-surface expression of RhD blood group polypeptide is posttranscriptionally regulated by the RhAG glycoproteinl[J].Blood,2002,100:1038.

[10]Beckmann R,Smythe JS,Anstee DJ,et al Coexpression of band 3 mutants and Rh polypeptide:differential effects of band 3 on the expression of the Rh complex containingD polypeptide and the Rh cornplex containing CcEe polypeptide[J].Blood,2001,97:2496.

[11]Mouro-Chanteloup I,Delaunay J,Gane P,et al Evidence that the red ceU skeleton protein 4.2 interacts with tlle Rh membrane complex member CD47[J].Blood,2003,101:338.

1007-4287(2016)11-1836-05

2016-02-19)

*通訊作者