許紀(jì)玲,蔡 杰,陸玉婷,蔡旭兵,楊永林
(南京紅十字血液中心,江蘇 南京210003)
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RhD和HBsAg雙表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)研究
許紀(jì)玲,蔡 杰,陸玉婷,蔡旭兵,楊永林*
(南京紅十字血液中心,江蘇 南京210003)
人類Rh血型系統(tǒng)是臨床上最重要的血型系統(tǒng)之一,是人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)最具有多態(tài)性的血型系統(tǒng)。到目前為止已發(fā)現(xiàn)了至少49種不同抗原,其中與臨床相關(guān)的主要抗原為D、C、E、c和e等5種。Rh血型抗原定位于人類1號染色體短臂1p34.3-lp36.1,分別編碼2個非糖基化的疏水性跨膜蛋白質(zhì)RhD和RhCE[1]。RhD和RhCE基因同源性高達(dá)96%-97%。其中D抗原具有很強(qiáng)的免疫原性,抗原抗體的不相容能引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血[2,3],因此RhD基因的研究有著重要的指導(dǎo)意義,將HBsAg和RhD構(gòu)建在同一載體中,可以通過對HBsAg作為表達(dá)檢測指標(biāo),簡易快捷的了解RhD的表達(dá)情況。
1.1 材料
1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株 大腸桿菌DH5a本實(shí)驗(yàn)保留菌種,真核表達(dá)載體pIRES購自clontech公司,K562細(xì)胞株購自昆明細(xì)胞庫。血液樣本經(jīng)檢測RhD為陽性的獻(xiàn)血者。
1.1.2 試劑 DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI、MluI、XbaI、SalI、聚合酶Pfu均購置于Fermentas公司,DNA Ligation Kit (Takara,D6020A)、Takara Agarose Gel DNA Purification Kit(Takara,DV805A),pMD18-T VectorT (Takara,D101A)均購自大連寶生物有限公司,TIANpure Midi Plasmid Kit(DP107)購自天根生化科技(北京)有限公司,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(,CAT NO.11668-027)購自美國invitrogen公司,QIAamp DNA Mini Kit(CAT NO.51106)購自德國QIAGEN公司,人抗RhD多克隆抗體及HRP標(biāo)記羊抗人球蛋白抗體購自武漢博士德有限公司,HBsAg檢測試劑合購自英科新創(chuàng)生物有限公司。
1.1.3 引物及測序 根據(jù)RhD的基因組DNA選取特異性序列區(qū)域,使用online設(shè)計軟件設(shè)計擴(kuò)增引物,用于擴(kuò)增RhD的9個外顯子,具體序列見表1,并設(shè)計用于拼接RhD的外顯子的引物,具體序列見表2。根據(jù)克隆位點(diǎn)序列,設(shè)計克隆用引物,將拼接得到的完整RhD基因序列克隆入pIRES載體中,并在下游克隆位點(diǎn)處克隆入HBsAg序列,具體序列見表3。所有引物及測序均上海生工有限工公合成。
表1 RhD的9個外顯子的擴(kuò)增引物序列
表2 RhD的9個外顯子進(jìn)行兩兩拼接的特異性拼接引物序列
表3 RhD和HBsAg克隆入pIRES載體中的克隆引物序列
1.2 方法
1.2.1 擴(kuò)增RhD外顯子 取200 ml RhD陽性的全血使用QIAamp DNA Mini kit提取基因組DNA,方法參見試劑使用說明。采用Pfu聚合酶及相應(yīng)九對特異性擴(kuò)增引物分別擴(kuò)增出對應(yīng)的RhD基因的9個外顯子[4]。經(jīng)電泳鑒定后切膠回收分別克隆入PMD18T中,挑選插入目的片段的菌落送交測序,經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對進(jìn)一步挑選出外顯子序列完全正確的克隆。
1.2.2 拼接全長RhD基因 在9個外顯子兩端設(shè)計重疊互補(bǔ)引物,使得相鄰兩個外顯子帶有相互末端的重疊序列。采用重疊延伸拼接法進(jìn)行兩兩拼接,最后拼接成為完整的RhD序列。將拼接完成的外顯子序列克隆入PMD18T中,挑選插入目的基因的菌落送交測序,挑選出與NCBI基因序列上完全一致的陽性克隆。
1.2.3 pIRES雙克隆載體的構(gòu)建 用pIRES的克隆引物擴(kuò)增RhD全基因,將擴(kuò)增得到的目的片段和pIRES載體用EcoRI,MluI限制性DNA內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,將雙酶切后的目的基因和pIRES載體進(jìn)行切膠回收后,進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化,挑選陽性克隆。得到pIRES-RhD的重組質(zhì)粒,RhD在上游克隆位點(diǎn)上。再用pIRES的克隆引物擴(kuò)增HBsAg基因,將擴(kuò)增得到的目的片段和pIRES-RhD載體用XbaI,SalI限制性DNA內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,將雙酶切后的目的基因和pIRES-RhD載體進(jìn)行切膠回收后,進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化,挑選陽性克隆??寺BsAg基因到pIRES-RhD的下游克隆位點(diǎn)上,最終得到pIRES-RhD-HBsAg的雙表達(dá)載體,具體流程圖見圖1。
1.2.4 pIRES-RhD-HBsAg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將K562細(xì)胞接種于6孔板中,每孔3 ml的RPMI1640完全培養(yǎng)基,待生長到1×106/ml時即可用于轉(zhuǎn)染[5],轉(zhuǎn)染前更換新鮮培養(yǎng)基。取14 μg待轉(zhuǎn)質(zhì)粒溶于150 μl Opti-MEM;取12 μl Lipofectamine 2000稀釋于150 μl Opti-MEM。將稀釋的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑1∶1混合后室溫放置5 min。6孔板中每孔放入250 μl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑混合物。放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天,收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清,分別檢測HBsAg和RhD抗原的表達(dá)。
圖1 pIRES-RhD-HBsAg載體構(gòu)建示意圖
1.2.5 RhD抗原及HBsAg的檢測 取轉(zhuǎn)染后40小時的細(xì)胞,約5×106,離心去上清,PBS洗3次,加入細(xì)胞裂解液200 μl,混均,并煮沸5 min,12000 g離心5 min,保留上清用WB檢測。轉(zhuǎn)膜后常規(guī)BSA封閉1 h,加入抗RhD多克隆抗體(1∶200),常溫孵育1 h,洗膜后加入HRP標(biāo)記羊抗人球蛋白抗體(1∶10 000),常溫孵育1 h,最后采用化學(xué)發(fā)光方法曝光。取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測HBsAg,詳細(xì)方法參見試劑盒說明書。
2.1 RhD9個外顯子的擴(kuò)增片段,電泳結(jié)果見圖2A,條帶大小均正確。RhD片段兩兩拼接產(chǎn)物電泳見圖2B。
2.2 克隆得到的pIRES-RhD-HBsAg雙表達(dá)載體的雙酶切鑒定
限制性內(nèi)切酶EcoRI、MluI37℃對pIRES-RhD-HBsAg進(jìn)行雙酶切,完全消化后進(jìn)行電泳,結(jié)果見圖3A,結(jié)果表明插入片段大小正確。同樣以限制性內(nèi)切酶XbaI、SalI37℃對pIRES-RhD-HBsAg進(jìn)行雙酶切,完全消化后進(jìn)行電泳,結(jié)果見圖3B,結(jié)果表明插入片段大小正確。
A:RhD的9個外顯子擴(kuò)增片段。1-9為RhD的9個外顯子擴(kuò)增片段,M:DL2000;B:RhD的兩個相鄰的外顯子片段拼接為一個長片段。1、2:相鄰的兩個外顯子片段,3:兩個外顯子片段拼接而成的長片段,M:DL2000。
圖2 RhD外顯子的擴(kuò)增與拼接
圖A:EcoRI,MluI雙酶切電泳圖。1、2:兩pIRES-RhD-HBsAg克隆,M:DL2000;圖B:XbaI、SalI雙酶切電泳圖。1、2:兩pIRES-RhD-HBsAg克隆,M:DL2000
圖3 質(zhì)粒的酶切與鑒定
2.3 RhD及HBsAg檢測結(jié)果
細(xì)胞用于RhD檢測,WB結(jié)果見圖4,條帶大小約32 Kd,和RhD分子量大小一致。pIRES-RhD-HBsAg轉(zhuǎn)染后的上清用于HBsAg的ELISA檢測,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞有效表達(dá)并分泌HBsAg,結(jié)果見表4。
1、2:均為pIRES-RhD-HBsAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞,Lane3:pIRES轉(zhuǎn)染細(xì)胞
圖4 RhDWB檢測結(jié)果
Rh血型系統(tǒng)的相關(guān)基因序列有著高度的同源性。Rh血型抗原活性是由紅細(xì)胞表面的Rh蛋白和Rh相關(guān)糖蛋白組裝而成的復(fù)合物所決定,它們分別受控于1號染色體上2個緊密連鎖的RhD和RhCE基因,以及6號染色體上的RhAG基因,到2007年5月為止,使用基因分型技術(shù)檢測出的等位基因已超過200個,其中RhCE座位上47個,RhD座位上145個,RhAG座位上13個[5]。
RhD變異體包含3類:弱D,部分D,DEL[6]。雖然這3類變異體的分子機(jī)理尚未完全明了,但是主要是由于RhD上的堿基位點(diǎn)發(fā)生突變,缺失,外顯子的拼接發(fā)生錯誤,以及由于RhD和RhCE基因發(fā)生重組產(chǎn)生的,因此能夠完整的高保真的擴(kuò)增得到RhD的基因?qū)τ谶M(jìn)一步研究RhD的抗原反應(yīng)有著重要的意義。目前國內(nèi)相關(guān)研究多是克隆RhD的部分功能區(qū)域,或者采用反轉(zhuǎn)錄的方法從RNA中獲取RhD的基因,但是由于Rh系統(tǒng)相關(guān)基因的高度同源性并不能擴(kuò)得完全一致的RhD基因,一般經(jīng)序列比對只能達(dá)到97%-98%的匹配度。以這樣的序列進(jìn)行進(jìn)一步的研究不能夠得到非??煽靠尚诺慕Y(jié)果。
傳統(tǒng)方法從富含網(wǎng)織紅的骨髓中提取RNA模板,進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)直接從普通紅細(xì)胞中提取基因組DNA,采用外顯子直接擴(kuò)增后拼接的方法得到完整的RhD序列。實(shí)驗(yàn)原料更加容易獲得,更適合普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。
本實(shí)驗(yàn)采用pIRES雙表達(dá)載體構(gòu)建雙基因克隆載體。pIRES能在細(xì)胞基因組外擴(kuò)增并表達(dá)目的基因,具有多拷貝、強(qiáng)啟動、操作方便等優(yōu)點(diǎn),它在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率較高。具有巨細(xì)胞病毒啟動子、腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entrysite,IRES),IRES連接兩個開放閱讀框,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在翻譯時,核糖體能同時進(jìn)入并開始翻譯IRES上游及下游的兩個轉(zhuǎn)錄子。兩種基因可同時表達(dá),表達(dá)的蛋白無需經(jīng)過加工和修飾,具有天然的生物學(xué)活性。pIRES-RhD-HBsAg載體可以同時表達(dá)兩種蛋白,通過檢測上清液HBsAg的基因表達(dá)請況就可以了解膜蛋白RhD的基因轉(zhuǎn)錄情況。在本實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),用構(gòu)建的雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞[7],經(jīng)轉(zhuǎn)染后通過商品化HBsAg的ELISA檢測試劑盒檢測上清可以很明確的檢測到HBsAg的表達(dá),且檢測到RhD抗原的表達(dá)。
本研究對RhD全序列進(jìn)行了克隆表達(dá),尚沒有包括RhD基因的其他突變體和剪接體[8],但是為將來進(jìn)一步進(jìn)行RhD不同基因型的研究起到鋪墊作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明RhD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是成功。但是RhD的抗原活性還和其他一些Rh相關(guān)蛋白有著協(xié)同作用[9-11],這些作用尚不明確。這些都將是我們進(jìn)一步研究和所要解決的問題。
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1007-4287(2016)11-1836-05
2016-02-19)
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