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        癌抗原15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立

        2016-12-10 03:01:53程繽雁
        標(biāo)記免疫分析與臨床 2016年11期
        關(guān)鍵詞:溫育包被化學(xué)發(fā)光

        程繽雁

        (北京北方生物技術(shù)研究所有限公司,北京100076)

        癌抗原15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立

        程繽雁

        (北京北方生物技術(shù)研究所有限公司,北京100076)

        目的 建立癌抗原15-3(CA15-3)酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。方法 利用雙抗體夾心法建立CA15-3化學(xué)發(fā)光檢測體系,分別對該體系的最低檢測限、線性、分析特異性、準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行評估,并與進(jìn)口全自動化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果 本方法靈敏度為0.26 U/mL,線性范圍為0~300 U/mL,與CEA和CA125無交叉反應(yīng),添加回收率在97.0%~105.6%之間,分析內(nèi)與分析間CV均小于10%,與進(jìn)口全自動化學(xué)發(fā)光試劑同時檢測160份樣本的CA15-3濃度,檢測結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)為0.987。結(jié)論 成功建立了CA15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。該方法靈敏度高、重復(fù)性好,在臨床應(yīng)用中可替代進(jìn)口化學(xué)發(fā)光檢測試劑。

        腫瘤標(biāo)志物; 癌抗原15-3; 乳腺癌; 酶促化學(xué)發(fā)光法

        癌抗原15-3(CA15-3)是一種粘蛋白型糖蛋白,相對分子質(zhì)量約為400000,是目前應(yīng)用最廣泛的乳腺癌血清標(biāo)志物[1]。CA15-3在乳腺癌早期靈敏度不足,陽性率僅為10.1%,隨著病情進(jìn)展靈敏度有所增加[2];發(fā)生轉(zhuǎn)移時,70%的患者血清CA15-3會顯著增高[3];乳腺癌患者在臨床治療有效的情況下,血清CA15-3測值會降低[4]。檢測血清CA15-3濃度,對乳腺癌患者療效觀察和預(yù)后估計有重要的意義。酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法具有靈敏度高、特異性好、檢測范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。本工作利用雙抗夾心法建立了CA15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法,對國內(nèi)乳腺癌的治療和檢測有重要的意義。

        材料和儀器

        1 主要儀器

        化學(xué)發(fā)光儀:廈門天中達(dá)生物科技有限公司。

        2 主要材料與試劑

        CA15-3單克隆抗體:Hytest公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶(HRP):Sigma公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光板:NUNC公司產(chǎn)品;去激素血清、小牛血清:天津康源生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;血清樣本由北京中同藍(lán)博臨床檢

        驗所提供。

        3 方法

        3.1 固相抗體包被板的制備 用0.02mol/L PB(pH 7.4)稀釋CA15-3單抗至終濃度為4 μg/mL,100μL/孔加入化學(xué)發(fā)光板中,置于4℃過夜。次日甩棄包被液,再加入蔗糖封閉液150μL/孔,置于37℃溫育。2h后,甩棄封閉液,將包被板自然晾干。

        3.2 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的制備 參照郭春祥等[5]簡易高碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的 CA15-3抗體。將0.5 mg HRP溶于0.25 mL蒸餾水中,向其中緩慢滴加100 μL NaIO4(0.1mol/L)溶液,4℃攪拌20min后在HAc-NaAc緩沖液(1 mmol/L,pH 4.4)中透析過夜。次日,將碳酸緩沖液(0.0 5 mol/L,pH 9.6)透析的 CA15-3單抗緩慢滴加到活化的酶溶液中,室溫避光攪拌。2h后,加入50 μL NaBH4中止反應(yīng),將溶液在 4℃靜置2h后轉(zhuǎn)入透析袋,在磷酸緩沖液(0.02mol/L,pH7.4)中透析過夜。次日取出,加入等體積甘油,分裝后在-20℃長期保存。

        3.3 校準(zhǔn)品的制備 用去激素血清將CA15-3純品分別稀釋為5、20、80、160、300 U/mL。用CA 15-3全自動化學(xué)發(fā)光試劑盒測定各點(diǎn)濃度,標(biāo)識為S1~S5,作為CA15-3校準(zhǔn)品。1 mL/瓶分裝,-20℃凍存。

        3.4 分析程序 向CA15-3包被板孔中依次加入150 μL樣本稀釋液、20 μL校準(zhǔn)品或樣品,37℃溫育30min后用洗滌液沖洗3次并拍干;每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體,37℃溫育30min后用洗滌液沖洗3次并拍干;加入100 μL發(fā)光底物液,3~10min后測量每孔光子數(shù)。以光子數(shù)為縱坐標(biāo),校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行雙對數(shù)作圖,擬合校準(zhǔn)品曲線方程。將樣本的發(fā)光計數(shù)代入方程,即可計算出樣本中CA15-3的濃度。樣本稀釋液為含20%小牛血清的磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L,pH 7.4)。

        4 數(shù)據(jù)分析方法

        采用Excel 2003分析。

        結(jié) 果

        1 酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇

        制備酶標(biāo)抗體稀釋比例分別為1∶10000、 1∶20000、1∶40000、1∶80000的溶液,在包被濃度為4 μg/mL時,觀察不同濃度HRP-CA15-3對校準(zhǔn)品曲線的影響,結(jié)果如圖1所示。根據(jù)校準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù),選擇酶標(biāo)抗體的工作濃度為1∶20000。

        2 包被濃度的選擇

        制備包被濃度分別為 2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL的CA15-3固相抗體板,HRP-CA15-3濃度為1∶20000時,觀察不同包被濃度對校準(zhǔn)品曲線的影響,結(jié)果如圖2所示。包被濃度為4 μg/mL和8 μg/ mL時,校準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù)均為0.999,以節(jié)約原料為原則,選擇包被濃度為4 μg/mL。

        3 反應(yīng)條件的確定

        3.1 加樣量 樣本稀釋液加樣體積為150 μL

        時,選取10 μL、20 μL、50 μL校準(zhǔn)品加樣體積進(jìn)行對比分析,結(jié)果如圖3所示??紤]到加樣準(zhǔn)確性和校準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù),本分析方法選用20 μL校準(zhǔn)品,150 μL樣本稀釋液進(jìn)行反應(yīng)。

        3.2 反應(yīng)時間 本分析方法采用兩步法,加入稀釋液和樣本后分別溫育0.5h、1h、2h、3h、4h,在第二步溫育1h時,對比分析第一步反應(yīng)溫育時間對發(fā)光計數(shù)的影響。由圖4可以看出,第一步反應(yīng)0.5h即可達(dá)到平衡,故選取第一步溫育時間為0.5h。在第一步溫育0.5h時,加入酶標(biāo)抗體分別溫育0.5h、1h、2h、3h,對比分析第二步溫育時間對發(fā)光計數(shù)的影響。由圖5可以看出,第二步反應(yīng)0.5h也可達(dá)到平衡。故本分析方法選取0.5h+0.5h的反應(yīng)模式,滿足了市場快速檢測的需求。

        4 方法學(xué)鑒定

        4.1 校準(zhǔn)品曲線及最低檢測限 同時測定20孔S0,計算其發(fā)光計數(shù)(RLU)的均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s,以x±2s為Y值,代入校準(zhǔn)品曲線公式,計算出相對應(yīng)的濃度值為0.26 U/mL,即為本方法的最低檢測限。

        4.2 線性 將一份CA15-3高值樣本用樣本稀釋液倍比稀釋,測定值如表1所示。稀釋度與測定值的相關(guān)方程為 Y=1232.9X+5.8,r=0.998,表明本分析方法在0~300 U/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。樣本稀釋曲線如圖6所示。

        表1 不同稀釋倍數(shù)血樣測定結(jié)果(U/mL)

        4.3 分析特異性 用去激素血清分別配制濃度為1000 ng/mL的CEA和1000 U/mL的CA125溶液,本方法測定結(jié)果分別為0.18 U/mL和0.22 U/mL。

        4.4 準(zhǔn)確度 向兩份含不同濃度CA15-3的血清中加入已知量的校準(zhǔn)品,對其測量并計算添加回收率,即為本分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確度。實驗結(jié)果如表2和表3所示。本方法的回收率為97.0%~105.6%。

        表2 1#樣本添加回收實驗(U/mL)

        表3 2#樣本添加回收實驗(U/mL)

        4.5 分析內(nèi)與分析間精密度 對高、中、低三份樣本,分別在同次實驗中平行測量20孔,計算分析內(nèi)精密度;分別在10次實驗中重復(fù)測量,計算分析間精密度。結(jié)果如表4和表5所示。

        表4 分析內(nèi)精密度結(jié)果(n=20,U/mL)

        表5 分析間精密度結(jié)果(n=10,U/mL)

        4.6 相關(guān)性實驗 使用ADVIA Centaur CA15-3 ReadyPack全自動化學(xué)發(fā)光試劑(西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司,批號:043160)與本方法同時測定160份樣本的CA15-3濃度,相關(guān)性見圖7,相關(guān)性方程為:Y=0.968X+1.538,r=0.987。

        結(jié) 論

        血清CA15-3含量對乳腺癌患者的療效觀察和預(yù)后估計具有重要的意義。本研究利用雙抗體夾心法研制的CA15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒,最低檢測限為0.26 U/mL,在0~300 U/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,與高濃度CEA和CA125無交叉反應(yīng),分析內(nèi)、分析間CV均小于10%,與進(jìn)口全自動化學(xué)發(fā)光試劑檢測結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)為0.987。此外,本試劑盒無需進(jìn)行樣本稀釋,方便臨床檢驗操作;反應(yīng)時間僅需一小時,能夠滿足快速檢測的市場需求。在臨床工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。

        [1]Duffy M J,Evoy D,McDermott E W.CA15-3:Uses and limitation as a biomarker for breast cancer.Clin Chim Acta,2010,411(23-24):1869-1874.

        [2]Sandri M T,Salvatici M,Botteri E,et al.Prognostic role of CA15.3 in 7942 patients with operable breast cancer.Breast Cancer Res Treat,2012,132(1):317-326.

        [3]Ohuchi N,Sato S,Akimoto M,et al.The correlation between the immunohistochemical expression of DF3 antigen and serum CA15-3 in breast cancer patients.Jpn J Surg,1991,21(2):129-137.

        [4]Brouckaert O,Laenen A,Wildiers H,et al.The prognostic role of preoperative and(early)postoperatively change in CA15.3 serum levels in a single hospital cohort of primary operable breast cancers.Breast,2013,22(3):254-262.

        [5]郭春祥,郭錫瓊.介紹一種簡單、快速、高效的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的過碘酸鈉法.上海免疫學(xué)雜志,1983,3(2):97-100.

        (張增武編輯)

        《標(biāo)記免疫分析與臨床》雜志繼續(xù)入選2016版“中國科技期刊(核心版)”目錄

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        《標(biāo)記免疫分析與臨床》雜志社

        2016年10月18日

        Development of a Chemiluminescent Immunoassay for Cancer Antigen 15-3

        CHENG Bin-yan
        (Beijing North Institute of Biological Technology,Beijing100076,China)

        Objective To evaluate using chemiluminescent immunoassay(CLIA)system to detect serum cancer antigen 15-3(CA 15-3).Methods The system was evaluated in its limit of detection,linearity,analytical specificity,accuracy and repetitiveness.A total of 160 clinical specimens were detected and evaluated.Results The limit of detection was 0.26 U/mL and the recovery rate for accuracy was 97.0%-105.6%.The assay had a good linear relationship between 5-300 U/mL and had no cross reaction with CEA and CA125.All samples were detected by two CLIA systems,and the results were consistent and trusted.Conclusion The CLIA system for detecting CA15-3 has been established,which has satisfied sensitivity,repeatability,and will be widely used in clinical testing.

        Tumor marker; Cancer antigen 15-3; Breast cancer; Chemiluminescence enzyme immunoassay

        10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.031

        2016-05-20;

        2016-06-11

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