采 云

（武警北京總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100027）

·方法研究·

HbA1c在不同檢測(cè)系統(tǒng)及不同儲(chǔ)存條件下結(jié)果的比較

采 云

（武警北京總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100027）

目的 探討全血標(biāo)本在不同溫度、存放時(shí)間及不同檢測(cè)系統(tǒng)下檢測(cè)糖化血紅蛋白（HbAlc）結(jié)果和穩(wěn)定性差異。方法 對(duì)采集的30例來(lái)自我院內(nèi)科門(mén)診體檢人群全血標(biāo)本采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝后分裝于A、B、C、D、E五組試管中，A組立即檢測(cè)、B組在4～8℃下冷藏1d后檢測(cè)、C組在4～8℃下冷藏10d后檢測(cè)、D組在-20℃下冷藏1d后檢測(cè)、E組在-20℃下冷藏10d后檢測(cè)，檢測(cè)系統(tǒng)分別為：Bio-Rad variant II Turbo HbAlc檢測(cè)儀、Primus Ultra2HbAlc檢測(cè)儀、Roche Modular PPI全自動(dòng)生化檢測(cè)儀。結(jié)果 在同一種種檢測(cè)系統(tǒng)下，A組立即檢測(cè)結(jié)果與B組全血樣本在4～8℃下冷藏1d后檢測(cè)結(jié)果比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在同一種檢測(cè)系統(tǒng)下，C組樣本在4～8℃下冷藏10d后檢測(cè)、D組樣本在-20℃下冷藏1d后檢測(cè)、E組樣本在-20℃下冷藏10d后檢測(cè)結(jié)果與A組檢測(cè)結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在同一種種檢測(cè)系統(tǒng)下，隨著存放時(shí)間、存放溫度的變化（B、C、D、E組），檢測(cè)結(jié)果的CV值均高于A組。在同一溫度下、存放時(shí)間條件下，Roche Modular PPI檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的CV值最小。結(jié)論 溫度和放置時(shí)間會(huì)對(duì)全血標(biāo)本糖化血紅蛋白（HbAlc）結(jié)果和穩(wěn)定性造成影響，Roche Modular PPI檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性相對(duì)較好。

全血標(biāo)本； 不同溫度； 存放時(shí)間； 檢測(cè)系統(tǒng)； 糖化血紅蛋白

現(xiàn)如今，糖尿病的發(fā)病率日益升高，已成為危害人類(lèi)健康的一大頑疾［1］。在臨床中，常規(guī)評(píng)價(jià)糖尿病診療和并發(fā)癥控制效果的標(biāo)準(zhǔn)為糖化血紅蛋白A1c（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c），通過(guò)降低其血清內(nèi)濃度可顯著減少糖尿病患者出現(xiàn)大血管和微血管類(lèi)疾病的概率［2］，且其表達(dá)水平的變化和患者預(yù)后具有密切相關(guān)性，因此尋找特異性高的HbA1c檢測(cè)方法對(duì)提高糖尿病診斷及評(píng)價(jià)治療效果的準(zhǔn)確率具有極其重要的意義［3］。目前，在我國(guó)醫(yī)院中，尚無(wú)有統(tǒng)一檢測(cè)HbA1c標(biāo)準(zhǔn)及方法，且檢測(cè)方法紛繁復(fù)雜，錯(cuò)誤率較高［4］，同時(shí)溫度、存放時(shí)間及檢測(cè)系統(tǒng)均可致HbA1c檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)差異，本研究通過(guò)利用不同檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定不同溫度及存放時(shí)間下HbAlc，以分析各檢測(cè)結(jié)果和穩(wěn)定性差異，探討標(biāo)準(zhǔn)化HbA1c檢測(cè)方法的可能性。

材料與方法

1 全血樣本采集

選取2016年2月期間來(lái)我院內(nèi)科體檢人群30例。其中男性18例，女性12例；年齡為19～42歲，平均年齡為31.7±12.6歲。患者于清晨空腹及餐后2h各取5份4mL靜脈血樣本，注入乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝試管中。

2 檢測(cè)系統(tǒng)

Bio-Rad variantII Turbo HbAlc檢測(cè)儀，配套試劑批號(hào)：AA00618NU，400次測(cè)試后換防護(hù)柱，2000次測(cè)試后換分析柱，且更換柱子后應(yīng)做活化定標(biāo)。Primus Ultra2HbAlc檢測(cè)儀及配套試劑、分析柱。校準(zhǔn)品及質(zhì)控品購(gòu)自Bio-Rad公司，需按照系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)更換柱子，并定期清洗試劑酶樣品。Roche Modular PPI全自動(dòng)生化檢測(cè)儀及配套測(cè)定試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品均購(gòu)自Roche公司。三種檢測(cè)系統(tǒng)均采用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行校對(duì)后應(yīng)用，檢測(cè)結(jié)果的一致性達(dá)到98%。

3 實(shí)驗(yàn)操作方法

使用Bio-Rad variantⅡTurbo糖化血紅蛋白檢測(cè)儀以陽(yáng)離子交換高效液相色譜法（HPLC）、使用Primus Ultra2HbAlc檢測(cè)儀以親和層析HPLC法及使用Roche Modular PPI全自動(dòng)生化檢測(cè)儀以免疫抑制比濁法測(cè)定5組全血樣本內(nèi)HbAlc。其中A組樣本制備后即檢測(cè)，B組4～8℃冷藏1d后檢測(cè)，C在4～8℃冷藏10d后檢測(cè)，D組-20℃冷藏1d后檢測(cè)，E組-20℃冷藏10d后檢測(cè)。

4 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)美國(guó)糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）儲(chǔ)存校準(zhǔn)品及質(zhì)控品的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行全血樣本的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。NGSP規(guī)定：HbA1c測(cè)定結(jié)果以-70℃或更低溫度±3s為可接受范圍，在±3s范圍內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定，否則為不穩(wěn)定。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)在專(zhuān)業(yè)軟件SAS9.0軟件包中處理，HbAlc檢測(cè)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性采用變異系數(shù)（CV）值表示［5］，CV=s/x。P＜0.05表示兩組指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在不同溫度下、不同存放時(shí)間及不同檢測(cè)系統(tǒng)下檢測(cè)結(jié)果的差異性分析

三種檢測(cè)系統(tǒng)下，A、B、C、D、E五組標(biāo)本檢測(cè)出的HbAlc結(jié)果進(jìn)行比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

在同一種檢測(cè)系統(tǒng)下，A組立即檢測(cè)結(jié)果與B組全血樣本在4～8℃下冷藏1d后檢測(cè)結(jié)果比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

在同一種檢測(cè)系統(tǒng)下，C組樣本在4～8℃下冷藏10d后檢測(cè)、D組樣本在-20℃下冷藏1d后檢測(cè)、E組樣本在-20℃下冷藏10d后檢測(cè)結(jié)果與A組檢測(cè)結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下、不同存放時(shí)間及不同檢測(cè)系統(tǒng)下檢測(cè)結(jié)果的差異性分析（±s）

表1 不同溫度下、不同存放時(shí)間及不同檢測(cè)系統(tǒng)下檢測(cè)結(jié)果的差異性分析（±s）

注：與Bio-Rad variant II Turbo系統(tǒng)結(jié)果比較，*P＜0.05；與Primus Ultra2系統(tǒng)結(jié)果比較，#P＜0.05；與同一檢測(cè)系統(tǒng)下A組結(jié)果比較，▲P＜0.05

檢測(cè)系統(tǒng)A組B組C組D組E組Bio-Rad variant II Turbo5.22±0.155.27±0.185.38±0.21▲5.44±0.25▲5.48±0.26▲Primus Ultra25.32±0.14*5.38±0.16*5.49±0.20*▲5.57±0.23*▲5.60±0.25*▲Roche Modular PPI5.47±0.14*#5.49±0.15*#5.59±0.22*#▲5.68±0.23*#▲5.72±0.23*#▲F值7.0937.4847.8307.7427.096 P值0.0260.0220.0180.0200.025

2 在不同溫度下、不同存放時(shí)間下不同檢測(cè)系統(tǒng)下檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性比較

三種檢測(cè)系統(tǒng)下，A、B、C、D、E五組標(biāo)本檢測(cè)出的HbAlc結(jié)果的變異系數(shù)（CV）見(jiàn)表2、圖1。

在同一種種檢測(cè)系統(tǒng)下，隨著存放時(shí)間、存放溫度的變化（B、C、D、E組），檢測(cè)結(jié)果的CV值均高于A組，見(jiàn)表2。

在同一溫度下、存放時(shí)間條件下，Roche Modular PPI檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的CV值均小于Bio-Rad variant II Turbo系統(tǒng)、Primus Ultra2，Primus Ultra2檢測(cè)結(jié)果的CV值均小于Bio-Rad variant II Turbo系統(tǒng)。見(jiàn)表2。

表2 在不同溫度下、不同存放時(shí)間下不同檢測(cè)系統(tǒng)下檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性比較（%）

討 論

臨床研究顯示［6］，糖化血紅蛋白水平能夠反映人體3個(gè)月內(nèi)血糖狀態(tài)，而且不會(huì)受到短期血糖濃度波動(dòng)影響，因此HbA1c檢測(cè)已成為一些國(guó)家診斷及評(píng)價(jià)糖尿患者病情狀況或發(fā)展的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而在我國(guó)，HbA1c的檢測(cè)方法眾多，且結(jié)果差異性較大，故其仍未被廣大醫(yī)療結(jié)構(gòu)接納為診斷糖尿病標(biāo)準(zhǔn)［7］，僅作為一項(xiàng)輔助檢查指標(biāo)。隨著我國(guó)醫(yī)學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，關(guān)于HbA1c檢測(cè)的統(tǒng)一化標(biāo)準(zhǔn)也在逐步制定中，且呈現(xiàn)檢測(cè)方法及各項(xiàng)指標(biāo)逐一清晰化、制度化的態(tài)勢(shì)，我們認(rèn)為其必將在不久以后成為我國(guó)診斷糖尿病的通行標(biāo)準(zhǔn)之一。

研究顯示，要想樹(shù)立HbA1c檢測(cè)的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，首先要保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，這就需要對(duì)其實(shí)驗(yàn)步驟和檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行充分的掌握和把控［8］。在檢測(cè)系統(tǒng)中，我們分別選取Bio-Rad variant II Turbo HbAlc檢測(cè)儀+HPLC法、Primus Ultra2HbAlc檢測(cè)儀+親和層析HPLC法和Roche Modular PPI全自動(dòng)生化檢測(cè)儀+免疫抑制比濁法等三個(gè)常規(guī)系統(tǒng)聯(lián)合三種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行HbA1c檢測(cè)。研究顯示，抽取的全血標(biāo)本的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性具有密切關(guān)系［9］，因此在對(duì)患者抽血后，應(yīng)將血液樣本及時(shí)進(jìn)行抗凝處理后冷藏，并應(yīng)盡早檢測(cè)以保證樣本的質(zhì)量符合檢測(cè)要求。目前，由于醫(yī)療糾紛的概率較高，多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)為避免日后因檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤而引發(fā)醫(yī)患糾紛，都會(huì)保存每日的檢測(cè)標(biāo)本以待復(fù)查［10］。在研究中，我們分別選取立即檢測(cè)、4～8℃下冷藏1d后檢測(cè)、4～8℃下冷藏10d后檢測(cè)、-20℃下冷藏1d后檢測(cè)和-20℃下冷藏10d后檢測(cè)五種檢測(cè)時(shí)間及冷存溫度組合對(duì)全血標(biāo)本進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以探討不同保存時(shí)間及保存條件與HbA1c檢驗(yàn)結(jié)果間的關(guān)系。

在本研究中，在三種檢測(cè)系統(tǒng)下，A、B、C、D、E五組標(biāo)本檢測(cè)出的HbAlc結(jié)果的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在同一種種檢測(cè)系統(tǒng)下，A組立即檢測(cè)結(jié)果與B組全血樣本在4～8℃下冷藏1d后檢測(cè)結(jié)果比較差異不明顯，且C組樣本在4～8℃下冷藏10d后檢測(cè)、D組樣本在-20℃下冷藏1d后檢測(cè)、E組樣本在-20℃下冷藏10d后檢測(cè)結(jié)果顯著高于A組檢測(cè)結(jié)果（P＜0.05）。結(jié)果顯示，在同等實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)系統(tǒng)下，抽取患者全血樣本抗凝后立即檢測(cè)c和待1d后檢測(cè)HbA1c的結(jié)果具有可比性，前提是將樣本進(jìn)行合理的冷存。有研究建議應(yīng)在獲取血樣應(yīng)先立即檢測(cè)HbAlc，但在實(shí)際條件下，由于部分醫(yī)院患者人數(shù)較多或?qū)嶒?yàn)環(huán)境制約，較難充分實(shí)現(xiàn)全部實(shí)驗(yàn)當(dāng)天抽血即可完成檢測(cè)［11］，因此我們認(rèn)為也可將4～8℃下冷藏1d血樣的HbA1c檢測(cè)結(jié)果作為選擇。在研究中，在同一種種檢測(cè)系統(tǒng)下，隨著存放時(shí)間、存放溫度的變化，B～E組的檢測(cè)結(jié)果的CV值均高于A組，且CV值呈現(xiàn)隨著冷存時(shí)間和冷存溫度升高而逐漸增大的趨勢(shì)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性和冷存時(shí)間及冷存溫度可能存在負(fù)相關(guān)性。同時(shí)，在研究中，我們發(fā)現(xiàn)在同一溫度下、存放時(shí)間條件下Roche Modular PPI系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的CV值最小，其次為 Primus Ultra2系統(tǒng)，Bio-Rad variant II Turbo系統(tǒng)最高。結(jié)果顯示Roche Modular PPI系統(tǒng)檢測(cè)穩(wěn)定性最高，且在-20℃下冷藏10d條件下，其

CV值僅為4.37%。該系統(tǒng)高穩(wěn)定性也可能和免疫抑制比濁法，該方法根據(jù)血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可針對(duì)HbA1c與血液內(nèi)血紅蛋白單抗間的凝集反應(yīng)特性進(jìn)行定性檢測(cè)［12］，穩(wěn)定性較高，研究已證明，其靈敏度可精確到μL數(shù)量級(jí)，應(yīng)作為HbA1c檢測(cè)首選檢測(cè)方法。

本研究中評(píng)價(jià)了三種不同方法、不同儀器、不同濃度樣本和不同存放條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，結(jié)果確實(shí)存在差異。Bio-Rad variant II Turbo測(cè)定樣本常溫可穩(wěn)定7d，4℃可穩(wěn)定

14d，-30℃可穩(wěn)定35d；而親和層析HPLC不受溫度、氨基甲酰糖化血紅蛋白和胎兒血紅蛋白的干擾，結(jié)果可靠。免疫抑制比濁法是依據(jù)血紅蛋白上糖化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)，原理是根據(jù)HbA 1c與相應(yīng)的單抗結(jié)合發(fā)生凝集反應(yīng)的特性，受干擾因素也較小。

綜上所述，我們認(rèn)為全血樣本的冷存溫度和放置時(shí)間與HbAlc檢測(cè)結(jié)果和穩(wěn)定性具有密切關(guān)系，研究顯示應(yīng)選取Roche Modular PPI系統(tǒng)作為檢測(cè)系統(tǒng)首選。

［1］溫冬梅，張秀明，張德才，等.Hb E變異體對(duì)5種糖化血紅蛋白檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果的干擾評(píng)價(jià).中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（12）：921-927.

［2］徐安平，夏勇，紀(jì)玲.血紅蛋白變異體對(duì)不同糖化血紅蛋白檢測(cè)系統(tǒng)的干擾.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（12）：890-892.

［3］曾潔，張傳寶，趙海建，等.應(yīng)用六西格瑪管理方法評(píng)估糖化血紅蛋白檢測(cè)系統(tǒng)性能.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（4）：17-20.

［4］索明環(huán)，溫冬梅，張秀明.HbA1 c在三種檢測(cè)系統(tǒng)及不同儲(chǔ)存條件下結(jié)果的穩(wěn)定性.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014（8）：813-816.

［5］趙芳，張芳，邱玲，等.酶法測(cè)定糖化白蛋白的方法性能驗(yàn)證及其初步臨床應(yīng)用.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（4）：343-347.

［6］沈默宇，石立，葉新華.影響糖化血紅蛋白檢測(cè)系統(tǒng)的因素.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26（9）：1004-1006.

［7］俞葉夫，包國(guó)祥，趙國(guó)民，等.賦值傳遞與方法學(xué)比對(duì)對(duì)提高糖化血紅蛋白可比性的觀察.中國(guó)糖尿病雜志，2013，21（3）：264-266.

［8］He H，Lv R，Li S，et al.Reference intervals and factors contributing to serum glycated albumin levels in West China.Clin lab，2014，60（1）：119-124.

［9］劉慧，王蓓.3種檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定糖化血紅蛋白測(cè)量不確定度的評(píng)估.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2012，40（5）：520-523.

［10］童華誠(chéng)，劉慧，張美，等.三種檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定糖化血紅蛋白相關(guān)性分析及偏倚評(píng)估.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（7）：1156-1158.

［11］Ayyagari R，Wei W，Cheng D，et al.Effect of Adherence and Insulin Delivery System on Clinical and Economic Outcomes among Patients with Type 2 Diabetes Initiating Insulin Treatment.Value Health，2015，18（2）：198-205.

［12］向陽(yáng)，姜艷，張瓊.2種糖化血紅蛋白檢測(cè)方法的比對(duì)和結(jié)果一致性評(píng)價(jià).新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（7）：979-980.

（李 凌編輯）

Comparison of the Results of HbA1c by Different Detection Systems and Under Different Storage Conditions

CAI Yun
（Department of Clinical Laboratory，The Hospital of Wujing Beijing Command，Beijing 100027，China）

Objective To investigate the test results and the stability of glycosylated hemoglobin（HbAlc）in whole blood samples under different temperature，storage time and by different detection systems.Methods We collected 30 cases of whole blood samples with ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium（EDTAK2）anticoagulant packaging.The samples were divided into A，B，C，D，E groups，five samples in each group.Group A was given immediate detection.Group B was refrigerated under 4-8℃ for one day before detection.Group C was stored under 4-8℃ for 10 days.Group D was stored at-20℃ freezer for one day and group E in-20℃ freezer for 10 days before detection.We used the following detection systems：Bio-Rad variant II turbo HbAlc detector，Primus ultra2 HbAlc detector and Roche modular PPI full automatic biochemical analyzer.Results Under the same detection system，the results of group A and group B had no statistical difference（P＜0.05）.Under the same detection system，the results of group C，group D and group E were significantly different than that of group A（P＜0.05）.Under the same detection system，the CV values of groups B，C，D，and E were higher than those of group A.At the same temperature and storage time，the Roche Modular PPI detection system had the minimum of the CV value.Conclusion Temperature and time will have an effect on the stability of HbAlc，Roche Modular PPI system provides relatively reliable testing results.

Whole blood sample； Different temperature； Storage time； Testing system；Glycosylated hemoglobin

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.030

2016-02-23；

2016-10-14