劉麗桃，劉文蘭，萬麗麗，朱 婷，王國民，阮海英，謝 妮，*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 511436；2.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518037；3.深圳肖傳國醫(yī)院，廣東 深圳 518129）

三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞低氧模型的建立及作用研究

劉麗桃1，2，劉文蘭2，萬麗麗2，朱 婷1，2，王國民3，阮海英2，謝 妮2，*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 511436；2.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518037；3.深圳肖傳國醫(yī)院，廣東 深圳 518129）

乳腺癌是女性最常見的癌癥[1]，我國雖不是乳腺癌的高發(fā)國家，但我國乳腺癌發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，且發(fā)病年齡日益年輕化?；蚍治霰砻魅橄侔┦且环N異質(zhì)性疾病，其雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progestrone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growthfactor receptor-2，

HER2)表達(dá)均為陰性的三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)約占乳腺癌總量的15%～20%，是侵襲轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)的亞型。侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后不良或死亡的主要原因。研究表明，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌的5年生存率分別為98.6%和84.9%，而對于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的乳腺癌來說，其5年生存率僅為25.9%[2]。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移一個由多基因參與的多步驟、多階段、體內(nèi)外因素相互影響的復(fù)雜過程，雖然具體機(jī)制尚不明確，但細(xì)胞遷移作為腫瘤播散的基礎(chǔ)已引起了廣泛關(guān)注[3]。

缺氧是包括乳腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的微環(huán)境特征。缺氧會導(dǎo)致一部分腫瘤細(xì)胞死亡形成壞死灶，但大部分腫瘤細(xì)胞仍然可以生長。為了克服缺氧環(huán)境，細(xì)胞會發(fā)生一些適應(yīng)性的改變，稱之為缺氧反應(yīng)，如無氧代謝增加、促進(jìn)腫瘤血管生成、基因突變等[4-5]。腫瘤細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)主要受低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)家族調(diào)控的，其中HIF-1起主導(dǎo)作用。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞基構(gòu)成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄活性取決于HIF-1α的穩(wěn)定性和活性。氧濃度正常時，HIFa-1被泛素蛋白酶解系統(tǒng)迅速降解，而低氧可抑制脯氨酸羥化酶的活性，使HIF-1α能穩(wěn)定表達(dá)。研究表明，HIF-1α穩(wěn)定性和活性增強(qiáng)后，間葉細(xì)胞的分子標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)表達(dá)上調(diào)[3，6]。Vimentin是細(xì)胞骨架蛋白—中間絲蛋白家族成員，在胚胎發(fā)育時期它就已經(jīng)參與了胚胎細(xì)胞的遷移與器官分化，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中它與細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞間黏附力減弱、運(yùn)動性及遷移能力增強(qiáng)密切相關(guān)，并在腫瘤遷移相關(guān)信號通路中起著重要的作用[7]。然而，不同低氧環(huán)境對細(xì)胞遷移影響，及其HIF-1α及波形蛋白的表達(dá)改變情況需進(jìn)一步研究。

低氧在腫瘤組織中廣泛存在，在不同的腫瘤組織中低氧的持續(xù)時間各不相同，即使在同一腫塊的不同區(qū)域其低氧的持續(xù)時間也不相同。以此分為兩種不同的低氧模式，即持續(xù)低氧和間歇低氧。持續(xù)低氧是由于腫瘤血管的新生速度慢于腫瘤細(xì)胞的繁殖速度，距離脈管系統(tǒng)較遠(yuǎn)的區(qū)域氧彌散受限所致。間歇低氧是腫瘤新生血管結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致不規(guī)律的血流動力學(xué)改變所致[8]。組織切片提示，腫瘤新生血管的基底膜厚薄不一，血管壁內(nèi)皮細(xì)胞連接松散，或缺乏內(nèi)皮細(xì)胞，血管不具收縮功能，且被腫瘤細(xì)胞壓迫而走行迂曲、擴(kuò)張且伴有過度分支和許多的盲端。腫瘤組織中，間歇低氧的循環(huán)周期取決于新生血管網(wǎng)的復(fù)雜程度和成熟水平，從幾分鐘一個循環(huán)到數(shù)小時、數(shù)天一個循環(huán)不等。目前有關(guān)低氧與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究主要集中在持續(xù)低氧上，并且其結(jié)果仍具爭議性。雖然研究者們已在肺癌、胃癌、卵巢癌、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞中成功建立了間歇低氧模型[9-11]，但未見針對乳腺癌在間歇性低氧環(huán)境中遷移機(jī)制的研究報(bào)道。本研究建立了間歇低氧、持續(xù)低氧、常氧3種細(xì)胞生長環(huán)境模型，比較這三種環(huán)境下，人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的遷移與增殖改變，并對其潛在的機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、青-鏈霉素購自美國Gibco公司。澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，項(xiàng)FBS)購自澳大利亞MRC公司，CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma 公司。Trizol(總RNA提取試劑)購自Life公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)試劑盒購自大連TaKaRa公司，HIF-1α引物由上海生工公司合成。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司，RIPA 蛋白裂解液購自索萊寶公司，兔抗人HIF- 1α多克隆抗體購自美國Novus 公司，兔抗人β-tublin多克隆抗體購自英國Abcam公司，vimentin抗體購自美國CST公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自上海依科賽生物公司，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司，siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒購自Santa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%FBS和0.5%雙抗(青-鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中。對數(shù)生長期細(xì)胞傳代后，實(shí)驗(yàn)分為3組：A組為常氧組細(xì)胞，置于恒定濕度的常氧孵育箱中培養(yǎng)；B組為持續(xù)低氧組細(xì)胞，置于可控氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48h；C組為間歇低氧組細(xì)胞，置于常氧箱中培養(yǎng)12h后置低氧箱中培養(yǎng)12h為一個循環(huán)，如此培養(yǎng)特定的10個循環(huán)。設(shè)定常氧環(huán)境為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、O2體積分?jǐn)?shù)為21%；設(shè)定低氧環(huán)境為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、N2體積分?jǐn)?shù)為94%、O2體積分?jǐn)?shù)為1%。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 用Marker筆在6孔板背后均勻劃橫線，每道間隔約0.5～1.0 cm，然后在每個孔中鋪大約5×105個細(xì)胞。第2天當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～100%時，用槍頭垂直背后的橫線劃痕。PBS洗滌3次，去除劃下細(xì)胞，在每孔加入2mL無血清DMEM培養(yǎng)基，設(shè)定此時為0h。萊卡顯微鏡下采用相差模式拍照記錄劃

痕后0和48h的細(xì)胞圖像。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量0和48h的劃痕面積和高度，并按下式計(jì)算各組細(xì)胞遷移率：

遷移寬度=遷移面積/圖像高度，細(xì)胞遷移率=(0h劃痕寬度-48h劃痕寬度)/0h劃痕寬度

1.2.3 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期MDAMB-231細(xì)胞，常規(guī)消化離心，用無血清的DMEM的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1× 105/mL，小室內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液，小室下部24孔板內(nèi)加入500μL DMEM全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后取出小室，棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15min，1%結(jié)晶紫染色20min，單蒸水洗掉染色液后風(fēng)干，在倒置顯微鏡下觀察，100倍視野下取上中下左右5個視野比較各組穿膜至下室的細(xì)胞數(shù)目。隨后用10%冰醋酸洗脫下室的細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其在570 nm處的吸光度D(570)，以吸光度的大小代表穿過膜的細(xì)胞相對數(shù)目，并以此來評估其遷移能力。

1.2.4 CCK8法檢測細(xì)胞增殖 MDA-MB-231細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液至1 500/mL，按每孔100μL懸液接種在96孔板中。以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基組為空白對照孔。4～6h細(xì)胞貼壁后，去除舊培養(yǎng)基加入CCK8培養(yǎng)基混合液(CCK8與培養(yǎng)基之比為1∶10)，37℃孵育2h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度D(450)值作為0天細(xì)胞吸光值。分別在第1、2、3、4天記錄細(xì)胞吸光值。

1.2.5 qPCR檢測HIF-1α和vimentinmRNA表達(dá) 采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA并測濃度后，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄cDNA。使用TaKaRa公司QIAGEN SYBR?Green PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HIF-1α上游引物為5'-CTGCCACCACTGATGAAta-3'，下游引物為5'-GTATGTGGGTAGGAGATGGA-3'，擴(kuò)增片段長度為90 bp；vimentin上游引為5'-CCTT GAACGCAAAGTGGAATC-3'，下游引物為5'-GACATG CTGTTCCTGAATCTGAG-3'，擴(kuò)增片段長度106 bp； 以β-actin作為內(nèi)參，上游引物為5'-GATCATTGCTCCTCC TGAGC-3'，下游引物為5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCA C-3'， 擴(kuò)增片段長度101 bp。20μL反應(yīng)體系中含SYBR Greenmix 16.4μL，cDNA 2μL，正反向引物(10μmol/L)各0.8μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸34 s，共40個循環(huán)。靶基因的相對表達(dá)用2-??CT表示，?C=C-C，??C= ?CTT，靶基因T，β-actinTT，對照?CT，處理。

1.2.6 免疫印跡驗(yàn)證HIF-1α和vimentin蛋白表達(dá) 收集各組MDA-MB-231細(xì)胞，每106個細(xì)胞加入500μL細(xì)胞裂解液(含RIPA 100μL，PMSF 1 μL)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，取40μg蛋白樣品進(jìn)行8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗人HIF-1α多克隆抗體(1∶2 000稀釋)、鼠抗人vimentin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人β-tublin多克隆抗體(1∶5 000 稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3 次每次10min，加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG)室溫孵育1h，最后化學(xué)發(fā)光顯影。采用Photoshop軟件測量條帶的灰度值，其中目的條帶的相對含量值為目的條帶的灰度值/內(nèi)參的灰度值。

1.2.7 siRNA轉(zhuǎn)染干擾HIF-1α表達(dá) 取間歇低氧處理10個循環(huán)后的MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)并接種于6孔板中，在含10% FBS但不含雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24h后匯合度達(dá)50%～60%時按Santa 公司的轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，提取其RNA和蛋白，檢測細(xì)胞遷移和增殖情況。細(xì)胞分組：設(shè)置未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞為空白對照組；僅加入亂碼序列siRNA的細(xì)胞為陰性對照組；轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA細(xì)胞為干擾組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分-析，所有實(shí)驗(yàn)均至少進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)以(±s)表示，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，兩個樣本間比較采用t檢驗(yàn)。細(xì)胞生長曲線變化采用一般線性模型的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同低氧模式對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和增殖的影響

研究表明，間歇低氧是一種比持續(xù)低氧更強(qiáng)更有效的低氧刺激[8-10]。我們比較了間歇低氧、持續(xù)低氧、常氧條件下細(xì)胞的遷移能力。如圖1A所示，劃痕48h后，間歇低氧組細(xì)胞劃痕傷口兩邊相互匯合，而在持續(xù)低氧、常氧條件下劃痕傷口兩邊的細(xì)胞均未匯合。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量其遷移面積并計(jì)算各組平均遷移率，間歇低氧、持續(xù)低氧、常氧條件下細(xì)胞平均遷移率分別為76.1%、34.1%、31.7%。間歇低氧細(xì)胞的遷移水平顯著高于持續(xù)低氧組和常氧組(P<0.01)，而常氧組和持續(xù)低氧組細(xì)胞的遷移水平間無明顯差異(圖1B)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們進(jìn)行了Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)。如圖1C所示間歇低氧組遷移進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于持續(xù)低氧組和常氧組。

醋酸洗脫遷移細(xì)胞測其吸光值，間歇低氧、持續(xù)低氧、常氧組分別為1.135、0.861、0.909，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)與劃痕法實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性(P<0.05)(圖1D)。

在細(xì)胞遷移的過程中伴隨著細(xì)胞增殖，為了探索間歇低氧條件下細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)是否與細(xì)胞增殖能力有關(guān)，接下來我們進(jìn)行了CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。如圖1E示，間歇低氧組細(xì)胞的增殖能力較常氧組減弱(P< 0.05)。持續(xù)低氧組細(xì)胞的增殖能力在48h內(nèi)與常氧組無明顯差異，2 d后其增殖能力明顯減弱，且隨時間的延長減弱愈加明顯(P<0.5)。以上結(jié)果表明，間歇低氧環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞遷移與細(xì)胞增殖力增強(qiáng)無關(guān)。

圖1 不同低氧模式對細(xì)胞遷移及增殖的影響

2.2 不同低氧模式下MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α及vimentinm RNA和蛋白表達(dá)

為探索間歇低氧條件下細(xì)胞的遷移機(jī)制，我們分別檢測了間歇低氧10個循環(huán)和持續(xù)低氧48h時，低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和細(xì)胞粘附相關(guān)分子vimentin在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。如圖2A所示，在HIF-1αmRNA在常氧組、持續(xù)低氧、間歇低氧組間無明顯差異(P>0.05)。如圖2B所示，HIF-1α蛋白在常氧組不表達(dá)，結(jié)果支持HIF-1α蛋白在常氧條件下被降解的理論。低氧上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)，且其在間歇低氧組中的表達(dá)高于持續(xù)低氧組(P<0.05)。VimentinmRNA在間歇低氧組和持續(xù)低氧組中表達(dá)均高于常氧組細(xì)胞(P<0.05，圖2C)。Vimentin的蛋白表達(dá)在間歇性低氧組中顯著高于持續(xù)低氧組和常氧組，但持續(xù)低氧組表達(dá)

較常氧組下調(diào)(P<0.05，圖2D)。以上結(jié)果說明，低氧上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)，且間歇低氧對HIF-1α蛋白的上調(diào)作用較持續(xù)低氧顯著增強(qiáng)；vimentin的mRNA和蛋白在間歇低氧細(xì)胞均被上調(diào)，持續(xù)低氧雖上調(diào)vimentinmRNA，但vimentin蛋白表達(dá)卻未增加。

圖2 不同低氧模式下MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和vimentinmRNA和蛋白表達(dá)

2.3 HIF-1αsiRNA干擾細(xì)胞后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移改變

采用HIF-1αsiRNA阻斷了HIF-1α基因活性后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，劃痕48h后，未轉(zhuǎn)染空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異siRNA 組劃痕傷口兩邊細(xì)胞相互匯合，而HIF-1α干擾組劃痕傷口細(xì)胞匯合度顯著下降(圖3A)。HIF-1α沉默后，細(xì)胞遷移率降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。未轉(zhuǎn)染空白對照組、亂序siRNA陰性對照組、HIF-1α沉默組平均遷移率分別為75%、71.7%、49.2%。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)論。圖3C示，HIF-1αsiRNA干擾后，48h遷移進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量明顯低于空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異亂序siRNA的陰性對照組。醋酸洗脫各組遷移細(xì)胞后，酶聯(lián)檢測儀測其平均吸光值，空白對照組、陰性對照組、HIF-1α沉默組分別為1.215、1.110、0.744。結(jié)果表明，干擾HIF-1α表達(dá)顯著降低間歇低氧MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移水平(P<0.05，圖3D)。但沉默HIF-1α后細(xì)胞的增殖曲線并未發(fā)生明顯改變(P>0.05，圖3D)。以上結(jié)果說明，HIF-1α穩(wěn)定性和活性增強(qiáng)及vimentin表達(dá)上調(diào)是間歇低氧環(huán)境下細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)的原因，但與其細(xì)胞增殖水平下降無直接相關(guān)性。

圖3 siRNA干擾HIF-1α后細(xì)胞遷移及增殖改變

2.4 HIF-1αsiRNA干擾IH細(xì)胞后HIF-1α和vimentinmRNA及蛋白改變

HIF-1α已被認(rèn)是腫瘤靶向治療最重要的靶點(diǎn)之一。為探索低氧條件下HIF-1α表達(dá)增加與vimentin表達(dá)上調(diào)的相關(guān)性，及其與間歇性低氧條件下MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)的相關(guān)性，我們將MDA-MB-231細(xì)胞間歇低氧培養(yǎng)10個循環(huán)后，采用HIF-1αsiRNA阻斷了HIF-1α基因活性。如圖4A所示，干擾后hIF-1αmRNA表達(dá)顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。干擾后HIF-1αmRNA表達(dá)后，其蛋白表達(dá)也顯著下降(P<0.05，圖4B)。隨后，我們檢測了vimentinmRNA及蛋白的變化。如圖4C、4D示，vimentinmRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)也顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。以上研究結(jié)果表明，間歇低氧條件下vimentin表達(dá)上調(diào)與HIF-1α表達(dá)增加呈正相關(guān)。

圖4 HIF-1αsiRNA下調(diào)細(xì)胞HIF-1α及vimentinmRNA和蛋白表達(dá)

3 討 論

人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231屬于間質(zhì)來源細(xì)胞，本身就具有較高的侵襲性。間歇低氧環(huán)境使其發(fā)生一系列適應(yīng)性改變，演變成侵襲力更強(qiáng)的細(xì)胞，使其遷移率顯著高于持續(xù)低氧組和常氧組。另一方面，細(xì)胞具有表型異質(zhì)性，反復(fù)低氧、復(fù)氧可對高侵襲性癌細(xì)胞進(jìn)行特異性篩選[8]。而持續(xù)暴露于低氧環(huán)境可造成細(xì)胞DNA損傷和下調(diào)DNA修復(fù)信號通路，最終導(dǎo)致DNA雙鏈解鏈造成細(xì)胞永久性損傷[12]，本研究中持續(xù)低氧組細(xì)胞的遷移能力無增強(qiáng)，可能與持續(xù)低氧造成的損傷超出了細(xì)胞耐受性有關(guān)。此外，低氧壓力會對細(xì)胞造成基因毒性并抑制細(xì)胞增殖，并且長時間處于低氧環(huán)境中，會導(dǎo)致細(xì)胞以氧濃度依賴性形式凋亡[4，8]。圖1C示間歇低氧和持續(xù)低氧對細(xì)胞增殖均表現(xiàn)為抑制，持續(xù)低氧48h后其增殖效應(yīng)隨時間的推移愈加明顯，這可能是長時間的持續(xù)低氧環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加所致。其他一些有關(guān)持續(xù)低氧的研究中，持續(xù)低氧比常氧表現(xiàn)出更高的遷移率，而本研究持續(xù)低氧未使細(xì)胞的遷移率明顯升高。這與不同實(shí)驗(yàn)條件下其氧濃度、低氧持續(xù)時間和不同細(xì)胞系對低氧的耐受性不同有關(guān)。此外，間歇低氧還與治療抵抗、腫瘤干細(xì)胞、自噬、細(xì)胞形態(tài)改變等腫瘤生物學(xué)特性相關(guān)[9，13-14]。研究表明，在腫瘤微環(huán)境中持續(xù)性低氧很少見，由于缺血再灌注所導(dǎo)致的不規(guī)則血流波動使得間歇性低氧更為常見，它對腫瘤生物學(xué)功能的影響比慢性持續(xù)性低氧更顯著[15]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。

HIF-1α是調(diào)控腫瘤對低氧反應(yīng)的主要因子，是乳腺腫瘤預(yù)后不良的因素之一。HIF-1α是由氧依賴表達(dá)的a亞基和恒定表達(dá)的β亞基構(gòu)成的二聚體結(jié)構(gòu)。常氧條件下，HIF-1α被脯氨酸羥化酶和天冬氨酸羥化酶羥基化后，分別被泛素蛋白酶解系統(tǒng)降解和抑制其轉(zhuǎn)錄活性。而在低氧環(huán)境下，脯氨酸羥化酶和天冬氨酸羥化酶活性降低，HIF-1α降解途徑被抑制，HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核與β亞基二聚化后再與靶基因啟動子區(qū)域的低氧誘導(dǎo)元件區(qū)結(jié)合從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。由此可見，低氧對HIF-1α的調(diào)節(jié)主要是翻譯后調(diào)節(jié)，對其基因水平的影響較小。故HIF-1α基因表達(dá)在間歇低氧、持續(xù)低氧、常氧條件下無明顯差異。持續(xù)低氧和間歇性低氧是兩種不同的生理過程。持續(xù)低氧常見于大腫塊，是氧彌散受限所致；間歇性低氧是由于腫瘤新生血管異常所致的血流波動而形成。這使它們參與調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)不同。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和PI3K信號通路不參與短循環(huán)間歇低氧條件下HIF-1α的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)，但在持續(xù)低氧環(huán)境中它們起著重要的作用。而PKA信號通路參與短循環(huán)間歇低氧環(huán)境調(diào)節(jié)HIF-1α穩(wěn)定性，卻不在持續(xù)低氧環(huán)境中起作用[17-19]。另一方面，已有研究表明HIF-1α半衰期與低氧持續(xù)時間呈反比[14]。因此，HIF-1α蛋白在間歇低氧環(huán)境中比持續(xù)低氧環(huán)境更穩(wěn)定。HIF-1α受氧濃度調(diào)節(jié)，間歇低氧復(fù)氧5min后，HIF-1α亞基很快被泛素蛋白酶解系統(tǒng)降解[18-19]。奇怪的是，即使復(fù)氧后HIF-1α幾乎完全降解，仍能激活HIF-1信號，增加HIF-1靶基因轉(zhuǎn)錄。對此，研究者們解釋是，在低氧階段大量HIF-1靶基因的轉(zhuǎn)錄本未被編碼翻譯，而是與HIF-1α蛋白形成mRNA-蛋白復(fù)合物保存在應(yīng)激顆粒中。復(fù)氧階段，通過解聚應(yīng)激顆粒繼續(xù)激活HIF-1下游信號通路上調(diào)靶基因水平[20-21]。

HIF-1是一個轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)超過200個與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。我們的研究中，間歇低氧誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)后，vimentin蛋白表達(dá)也增強(qiáng)；同時，阻遏HIF-1α表達(dá)，伴隨vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)(圖2，圖3)。這說明vimentin表達(dá)受HIF-1調(diào)控。但HIF-1不是直接上調(diào)vimentin表達(dá)的，而是通過誘導(dǎo)Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)間接調(diào)控vimentin的表達(dá)[22]。間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等也稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)子，它們直接作用于vimentin啟動子區(qū)上調(diào)其表達(dá)。另一方面，持續(xù)低氧誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)后，雖然vimentinmRNA水平上調(diào)，但其蛋白水平反而較常氧組減少。這可能跟vimentin蛋白易被各種蛋白酶裂解有關(guān)。Calpains和Caspases參與了vimentin蛋白的裂解，并且低氧會上調(diào)它們的表 達(dá)[23]。我們推測持續(xù)低氧組vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，與隨低氧持續(xù)時間的延長calpains和Caspases表達(dá)增加或活性增強(qiáng)裂解vimentin蛋白有關(guān)。另外，持續(xù)的低氧壓力造成的細(xì)胞損傷和無氧代謝產(chǎn)生的大量有毒物質(zhì)均可能影響細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯過程。

我們的研究表明，間歇低氧可篩選出高侵襲力的MDA-MB-231細(xì)胞株，其對細(xì)胞遷移的影響比持續(xù)低

氧更顯著，其侵襲力增高與HIF-1α穩(wěn)定性增強(qiáng)，上調(diào)vimentin蛋白表達(dá)有關(guān)。HIF-1α作為調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在靶點(diǎn)，目前已有一些HIF-1α抑制劑進(jìn)入臨床I/Ⅱ期實(shí)驗(yàn)研究階段。然而，低氧調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定性和活性的分子機(jī)制，HIF-1α對靶基因的調(diào)控機(jī)制，及其在不同低氧環(huán)境中差異表達(dá)的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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Impactof differenthypoxia conditions on themDA-MB-231 triple-negativehuman breast cancer cells

LIU Litao1，2，LIU Wenlan2，WAN Lili2，ZHU Ting1，2，WANG Guomin3，RUANhaiying2，XIE Ni2，*
(1.Graduate School of Guangzhoumedical University, Guangzhou 511436; 2.Second People’shospital, Shenzhen 518037; 3.Shenzhen C.G.Xiaohospital, Shenzhen 518129, Guangdong, China)

目的： 研究不同的低氧環(huán)境對三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖和侵襲遷移能力的影響。方法：將MDA-MB-231細(xì)胞分為間歇低氧組、持續(xù)低氧組和常氧組，采用劃痕法和Transwell小室法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)；CCK8法檢測細(xì)胞增殖；熒光定量PCR和Western blot 分別檢測低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和波形蛋白(vimentin)的mRNA和蛋白表達(dá)；siRNA干擾間歇低氧組細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測低氧細(xì)胞的遷移、增殖及vimentin蛋白改變。結(jié)果：間歇低氧促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞遷移，且其促進(jìn)作用顯著高于持續(xù)低氧組(P<0.05)；間歇低氧和持續(xù)低氧均抑制細(xì)胞增殖，但持續(xù)低氧對細(xì)胞增殖抑制的作用在低氧48h后才較為明顯(P<0.05)；間歇性低氧組細(xì)胞HIF-1α和vimentin蛋白表達(dá)均顯著高于持續(xù)低氧細(xì)胞。siRNA干擾間歇低氧組細(xì)胞HIF-1α表達(dá)后，其vimentin蛋白下調(diào)，細(xì)胞遷移能力下降(P<0.05)，但增殖水平未受到明顯影響(P>0.05)。結(jié)論：間歇低氧可誘導(dǎo)高侵襲表型的MDA-MB-231細(xì)胞株，其侵襲力增強(qiáng)與HIF-1α表達(dá)增加進(jìn)而上調(diào)vimentin有關(guān)。

低氧；HIF-1α；三陰性乳腺癌；細(xì)胞遷移

OBJECTIVE:To study the influence ofhypoxia onmetastatic potential of themDA-MB-231 triple-negativehuman breast cancer cells.METHODS：MDA-MB-231 cells were divided into threehypoxia groups：intermittenthypoxia (IH)，continuoushypoxia (CH) and normoxic (N).Cellmigration and invasion ability were analyzed by woundhealing and the Boyden chamber assay.Cell proliferation was analyzed by the CCK-8 assay.Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α) and vimentin expression in response to differenthypoxic environments were analyzed by Western blotand real-time PCR assays.HIF-1αexpression v ia siRNA k nockout wasinvestigated.R ESULTS：IH-treated c ells e xhibitedh igher Invasiveness than the Ch-treated cells ( P<0.05).O n the o therh and，IH significantly Inhibited c ell p roliferation while Ch did not show s uch e ffect u ntil 4 8h l ater (P<0.05).IH induced a greater effectonhIF-1αprotein accumulation and vimentin upregulation.KnockdownofhIF-1αby siRNA abolished IH-induced cellmigration and vimentin upregulation (P<0.05).However， knockdownofhIF-1αhad no effecton proliferationofmDA-MB-231 cells (P>0.05).CONCLUSION：IHhad amore pronounced effecton enhancing the invasive phenotype ofmDA-MB-231 cells than CH，andhIF-1αactivation together with increased vimentin upregulationmight b e r esponsible f or the phenotypic change.

hypoxia；HIF-1α；triple-negative breast cancers；cellmigration

R73-37

A

1004-616X(2016)06-0420-08

10.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.002

2016-04-13；

2016-08-16

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800097；2014A020212038)；深圳市知識創(chuàng)新計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20150330102720122)；廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313029)

作者信息： 劉麗桃，E-mail：liulitao1985@yeah.net。

*通信作者，謝 妮，E-mail：kejiaoke100@163.com