徐培翔，侯麗穎，宋華翠，余洋，吳坤*

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

維生素E琥珀酸酯處理人胃癌細(xì)胞過(guò)程中自噬與活性氧蓄積的交互作用

徐培翔，侯麗穎，宋華翠，余洋，吳坤*

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的衍生物中抑制腫瘤活性最強(qiáng)的一種[1]。國(guó)內(nèi)外研究表明，VES具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，而對(duì)正常的組織細(xì)胞卻無(wú)任何毒副作用[2]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，VES對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)分化和誘導(dǎo)凋亡的作用[3]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類活性含氧化合物的總稱，主要由線粒體產(chǎn)生，是指機(jī)體內(nèi)有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性產(chǎn)物。如果細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)不能有效降解ROS，就會(huì)使ROS在細(xì)胞內(nèi)蓄積從而引起氧化應(yīng)激[4]。蓄積的ROS會(huì)氧化損傷胞內(nèi)的DNA、蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞器，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生代謝紊亂[5]。

自噬(autophagy)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的溶酶體依賴性降解途徑，是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境中起到關(guān)鍵作用[6]。本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，VES可以誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬并且導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積[7-8]，但兩者之間是否存在交互作用尚不清楚。本研究中我們用VES處理胃癌SGC-7901細(xì)胞，觀察自噬與ROS的變化以及分別淬滅ROS與阻斷自噬關(guān)鍵基因BECN-1后再觀察兩者的變化，旨在探討VES在胃癌細(xì)胞中引起的自噬和ROS蓄積之間是否存在交互作用，為進(jìn)一步闡明VES抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制及探討腫瘤治療的新方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人胃癌SGC-7901細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室提供；VES、雷帕霉素(rapamycin，RAPA)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine， NAC)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，微管相關(guān)蛋白l輕鏈3(microtubules associated protein 1 light chain 3，LC3)、Beclin-1抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司。β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG以及羅丹明標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)于中杉金橋公司。BCA試劑盒、ROS試劑盒購(gòu)于碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

SGC-7901細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。VES溶于無(wú)水乙醇中，配制成10mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃避光保存，備用。使用時(shí)用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將VES儲(chǔ)備液稀釋至所需終濃度，濃度為0.1%的乙醇作為對(duì)照組，ROS淬滅劑NAC溶于去離子水。試驗(yàn)設(shè)不同劑量VES(0、5、10、15、20μg/mL)處理24h組，100 nmol/L RAPA陽(yáng)性對(duì)照組，另外還設(shè)計(jì)了VES+NAC組(用20mmol/L NAC預(yù)處理2h)以及VES+ BECN-1 siRNA組(阻斷BECN-1基因24h之后再用20μg/mL VES處理24h)。

1.3 免疫熒光染色觀察LC3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按2×105/mL的密度接種至6孔板中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%時(shí)，給予不同濃度(0、5、10、15、20μg/mL)VES處理24h，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(100 nmol/L RAPA)。4%甲醛固定30min，PBS沖洗3次，0.5% Triton X-100透膜，37℃溫育5min，PBS沖洗3次，1% BSA封閉30min，加入LC3抗體(1∶200)，4℃過(guò)夜。1% BSA沖洗3次，加入羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃溫育1h，PBS沖洗3次，加入DAPI染料，使其終濃度為5μg/mL，37℃孵育15min，PBS沖洗3次，封片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集不同處理組的胃癌細(xì)胞，用PBS沖洗3次，收集于EP管中，棄掉上清液并將細(xì)胞懸浮于裂解液中，超聲破碎細(xì)胞，冰上裂解30min后，4℃，15 000 r/min離心10min，提取細(xì)胞總蛋白。取上清，采用BCA法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，并取等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，分別加入相應(yīng)一抗和二抗，經(jīng)顯色，用數(shù)字成像儀對(duì)圖像進(jìn)行拍照和分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化

收集不同處理組的胃癌細(xì)胞至EP管中，3 000 r/min離心5min，用PBS沖洗3次，ROS檢測(cè)探針DCFHDA用無(wú)血清培養(yǎng)液按照1∶1 000 稀釋，37℃孵育20min，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，加少量PBS稀釋，用濾網(wǎng)過(guò)濾到上樣管中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.6 RNA瞬時(shí)干擾阻斷自噬關(guān)鍵基因BECN-1的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按2×105/mL的密度接種至6孔板中，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下溫育過(guò)

夜。待細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)，按照HiperFect轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。將2.5μL siRNA稀釋于100μL無(wú)血清培養(yǎng)基中(siRNA的最終工作濃度為5 nmol/L)。加入3μLhiperFect轉(zhuǎn)染試劑，漩渦震蕩混勻，室溫孵育10min 以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴入細(xì)胞，輕晃培養(yǎng)板使其混勻，以常規(guī)條件培養(yǎng)帶有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞，6h后換含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，24h后用終濃度20μg/mL的VES處理24h，同時(shí)設(shè)置單純BECN-1 siRNA干擾細(xì)胞24h組，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BECN-1m RNA表達(dá)

用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95℃、10min，1個(gè)循環(huán)；95℃、15 s，60℃、60 s，40個(gè)循環(huán)，樣本中目的基因表達(dá)的計(jì)算方法為2-ΔΔCT。各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法-

2 結(jié)果

2.1 VES誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬

結(jié)果如圖1。圖中對(duì)照組未觀察到明顯的LC3點(diǎn)狀分布情況，隨著VES劑量的增加，LC3熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，點(diǎn)狀聚集逐漸增多，20μg/mL VES組能觀察到明顯聚集的LC3點(diǎn)狀熒光，呈現(xiàn)劑量依賴性。隨后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)結(jié)果如圖2，與對(duì)照組相比，隨著VES劑量的增加，Beclin-1蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也呈上升趨勢(shì)，呈現(xiàn)劑量依賴性(P< 0.05)，該結(jié)果提示VES可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖1 免疫熒光染色觀察不同濃度VES處理SGC-7901細(xì)胞24h后LC3的熒光強(qiáng)度(×400)

圖2 VES誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬后LC3和Bedclin-1蛋白的表達(dá)

2.2 VES誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生ROS蓄積

流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果如圖3所示。隨著VES劑量增加，細(xì)胞內(nèi)ROS含量逐漸升高，用NAC預(yù)處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS含量與20μg/mL VES組相比明顯下降(P<0.05)(圖3A和3B)。提示VES可顯著提高胃癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，同時(shí)NAC可有效降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

圖3 VES誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積

2.3 淬滅細(xì)胞內(nèi)ROS后對(duì)細(xì)胞自噬的影響

VES處理前2h用20mmol/L NAC淬滅細(xì)胞內(nèi)ROS，再以20μg/mL的VES處理細(xì)胞24h，試驗(yàn)分為對(duì)照組、

NAC組、VES組、VES+NAC組共4組。共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)LC3熒光強(qiáng)度及分布情況，結(jié)果如圖4A所示，與對(duì)照組相比，NAC組LC3的熒光強(qiáng)度和分布無(wú)明顯變化，而20μg/mL VES組LC3的熒光強(qiáng)度和點(diǎn)狀聚集顯著增強(qiáng)，VES+NAC組LC3的熒光強(qiáng)度和點(diǎn)狀聚集明顯弱于單獨(dú)VES處理組。Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4B所示，與對(duì)照組相比，NAC組的Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，而20μg/mL VES組能明顯上調(diào)Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)，VES+NAC組的Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)低于單獨(dú)VES處理組，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低后，其自噬水平也隨之降低。

圖4 淬滅細(xì)胞內(nèi)ROS后對(duì)細(xì)胞自噬的影響

2.4 RNA瞬時(shí)干擾阻斷自噬關(guān)鍵基因BECN-1的表達(dá)后對(duì)自噬的影響

運(yùn)用RNAi技術(shù)瞬時(shí)阻斷自噬關(guān)鍵基因BECN-1。Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BECN-1mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖5A所示，與VES單獨(dú)處理組相比，BECN-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)BECN-1mRNA水平顯著下降(P<0.05)。提示BECN-1 siRNA有效的阻斷了BECN-1基因的表達(dá)。隨后Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1表達(dá)，結(jié)果如圖5B，BECN-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)Beclin-1表達(dá)與VES單獨(dú)處理組相比明顯下降，提示BECN-1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)自噬水平受到了抑制。

圖5 RNA瞬時(shí)干擾阻斷自噬關(guān)鍵基因BECN-1的表達(dá)后對(duì)自噬的影響

2.5 抑制自噬后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

試驗(yàn)分為對(duì)照組、BECN-1 siRNA組、VES組、VES+BECN-1 siRNA組共4組。流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比，BECN-1 siRNA組的ROS含量無(wú)明顯變化，而20μg/mL VES組ROS含量明顯上升，VES+BECN-1 siRNA組的ROS含量明顯高于單獨(dú)VES處理組(P<0.05)(圖6)。結(jié)果表明，抑制自噬后，細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積增強(qiáng)，提示自噬可能參與了細(xì)胞內(nèi)ROS的清除過(guò)程。

圖6 抑制自噬后細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積增強(qiáng)

3 討 論

自噬是生物體通過(guò)溶酶體或囊泡降解胞內(nèi)成分的總稱，不但在細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程中起重要作用，而且在應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激時(shí)也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。隨著酵母模型的建立和基因技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)自噬分子機(jī)制和形態(tài)特點(diǎn)的了解才逐漸深入，并認(rèn)識(shí)到自噬與人類的多種疾病，尤其是惡性腫瘤存在密切關(guān)系。通過(guò)

對(duì)自噬作用的研究，可進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在機(jī)制，為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的思路。

調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的因素目前發(fā)現(xiàn)有很多種，包括饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物感染、細(xì)胞器損傷、蛋白

質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等。另外，近年來(lái)，ROS誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷在腫瘤細(xì)胞自噬的研究中越來(lái)越受到關(guān)注。本課題組前期研究結(jié)果已證實(shí)，VES可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生由ROS蓄積導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及進(jìn)一步發(fā)生凋亡，又有相關(guān)研究表明ROS可通過(guò)一系列途徑上調(diào)細(xì)胞自噬[10]，故提示我們，在VES處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞過(guò)程中，自噬有可能與氧化應(yīng)激存在某種聯(lián)系，基于上述假設(shè)而產(chǎn)生了本研究思路。

Beclin-1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物中調(diào)控自噬的特異性基因，在自噬泡形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。LC3分為胞質(zhì)型的LC3-Ⅰ及膜結(jié)合型的LC3-Ⅱ，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，自噬體形成增多，不僅僅表現(xiàn)為胞漿內(nèi)LC3蛋白表達(dá)增加，同時(shí)，胞漿內(nèi)的LC3-Ⅰ會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜上的LC3-Ⅱ，使LC3-Ⅱ蛋白的比例增加，提示細(xì)胞自噬的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，不同濃度VES作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞后，隨著VES劑量的增加，用激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)LC3點(diǎn)狀聚集逐漸增多和加強(qiáng)；Western blot結(jié)果顯示，隨著VES劑量的增加，Beclin-1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也呈上升趨勢(shì)，這些結(jié)果表明，VES能夠誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬。

一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的ROS處于較低水平，并不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成過(guò)度損傷。但在一些不利的狀態(tài)下，如劇烈的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化以及各種疾病等，就使得ROS在細(xì)胞內(nèi)蓄積從而引起氧化應(yīng)激。NAC是一種巰醇化合物，作為細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的前體，能促進(jìn)谷胱甘肽合成，增強(qiáng)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferas，GST)的活性，直接作用于氧自由基并促進(jìn)解毒，是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑[11-12]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度VES作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞后，隨著VES劑量的增加，流式細(xì)胞儀結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸增強(qiáng)，因此提示VES可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生ROS的蓄積。20mmol/L NAC預(yù)處理胃癌細(xì)胞2h能顯著抑制ROS的產(chǎn)生，證實(shí)NAC具有清除ROS的作用。

目前相關(guān)研究表明，一些外源物質(zhì)通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。例如檳榔提取物和線粒體電子傳遞鏈抑制劑等能夠引起腫瘤細(xì)胞中ROS水平升高，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生[13-14]；在壞死性小腸結(jié)腸炎疾病中，腫瘤壞死因子TNF-α可以造成線粒體功能異常，進(jìn)而產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)線粒體自噬的產(chǎn)生[15-16]。本研究中，我們?cè)赩ES處理前2h用20mmol/L NAC淬滅細(xì)胞內(nèi)ROS后，比較不同處理組間LC3的熒光強(qiáng)度及Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NAC組LC3的熒光強(qiáng)度、Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化，而20μg/mL VES組的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)并能明顯上調(diào)Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)，VES+NAC組的LC3熒光強(qiáng)度、Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)均明顯低于VES單獨(dú)處理組，提示ROS的蓄積有可能誘導(dǎo)自噬

的發(fā)生。

目前較為普遍的觀點(diǎn)是，如果體內(nèi)固有的ROS系統(tǒng)發(fā)生異常，致使ROS 蓄積，那么機(jī)體會(huì)補(bǔ)償性地提高自噬水平來(lái)降解ROS。例如，在自噬相關(guān)基因突變的酵母菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平會(huì)比野生型酵母菌株的高[17]。本研究中，我們阻斷自噬起始關(guān)鍵基因BECN-1表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BECN-1 siRNA組的ROS水平無(wú)明顯變化，而20μg/mL VES組ROS水平顯著增強(qiáng)，VES+BECN-1 siRNA組的ROS水平明顯高于單獨(dú)VES處理組，因此提示，自噬有可能減輕了細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積。

綜上所述，VES在誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生ROS蓄積的同時(shí)，也誘導(dǎo)了自噬，當(dāng)淬滅胞內(nèi)ROS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的自噬水平會(huì)降低，說(shuō)明ROS是自噬的誘導(dǎo)因素之一。當(dāng)干擾阻斷自噬起始關(guān)鍵基因BECN-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，提示自噬可以緩解ROS的蓄積。值得注意的是，雖然VES誘導(dǎo)的自噬參與了細(xì)胞內(nèi)ROS的清除過(guò)程，但是并未從根本上扭轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)ROS升高的最終結(jié)果，說(shuō)明VES誘導(dǎo)的自噬并不足以完全清除VES誘導(dǎo)的ROS，只能緩解部分ROS的胞內(nèi)蓄積。本研究闡明了VES處理人胃癌細(xì)胞過(guò)程中自噬與ROS水平可以相互調(diào)節(jié)，具有交互作用。這將對(duì)胃癌的臨床治療提供新的思路。

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Inductionof autophagy and reactive oxygen by vitamin E succinate inhuman gastric carcinoma cells

XU Peixiang，HOU Liying，SONGhuacui，YU Yang，WU Kun*
(Departmentof Nutrition and Foodhygiene, School of Publichealth,harbinmedical University,harbin 150081,heilongjiang, China)

目的： 探討維生素E琥珀酸酯(VES)處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞過(guò)程中自噬與活性氧(ROS)蓄積是否存在交互作用。方法：不同劑量(0、5、10、15、20μg/mL)VES處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞24h，采用免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白l輕鏈3(LC3)的熒光強(qiáng)度和分布情況，Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；用ROS淬滅劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理2h后以20μg/mL VES處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞24h，免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)LC3熒光強(qiáng)度和分布情況，Western blot檢測(cè)LC3和Beclin-1的表達(dá)情況；RNA瞬時(shí)干擾阻斷BECN-1基因的表達(dá)后，以20μg/mL VES處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果：與對(duì)照組相比，隨著VES作用劑量的增加，LC3的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)均逐漸升高；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示胞內(nèi)ROS水平逐漸增強(qiáng)；淬滅ROS之后LC3熒光強(qiáng)度以及LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)水平均明顯低于VES單獨(dú)處理組(P<0.05)；阻斷自噬關(guān)鍵基因BECN-1后細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于VES單獨(dú)處理組(P<0.05)。結(jié)論：VES可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬及ROS蓄積，并且VES處理人胃癌細(xì)胞過(guò)程中自噬與ROS水平可以相互調(diào)節(jié)，具有交互作用。

維生素E琥珀酸酯；胃癌細(xì)胞；自噬；活性氧

OBJECTIVE:To investigate the expressionof autophagy and accumulationof reactive oxygen species (ROS) afterhuman gastric cancer SGC-7901 cells were treated with vitamin E succinate (VES).METHODS：Human gastric cancer SGC-7901 cells were treated with VES at different doses (0，5，10，15，20μg/mL) for 24h.Then，laser confocalmicroscopy was used to observe fluorescence intensity and distributionof the autophagymarker protein：microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3).Western blot was used to evaluate the expression levels of LC3 and Beclin-1.Flow cytometry was used to detect the level of intracellular ROS.In addition，cells exposed to 20μg/mL VES for 24h with or withoutantioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC，20mmol/L)，were observed for fluorescence intensity and distributionof LC3.Western blot was used to evaluate levels of LC3 and Beclin-1.Furthermore，cells with BECN-1 knocked-down by RNA interference were treated with 20μg/mL VES for 24h.Then，flow cytometry was used to detect the level of intracellular ROS.RESULTS：Compared with the control group，VES treatment increased the amountof intracellular LC3 punctate fluorescence and the numberof autophagic vacuoles，and increased the expressionof endogenous autophagymarker protein LC3 and Beclin-1.Flow cytometry showed that the level of intracellular ROS was gradually increased.When ROS production was reduced by the antioxidant NAC，the fluorescence intensity of LC3，the expressionof LC3 and Beclin-1 were significantly lower compared with VES-treatmentalone.After the cells were transfected with BECN-1 siRNA，the level of intracellular ROS washigher compared with VES alone.CONCLUSION：VEsinduced autophagy and accumulationof ROsinhuman gastric cancer SGC-7901 cells.In addition，there were

vitamin E succinate；gastric cancer cells；autophagy；reactive oxygen species

R730.2

A

1004-616X(2016)06-0413-07

10.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.001

2016-05-05；

2016-06-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81172651)

作者信息： 徐培翔，E-mail：xupeixiang1234@126.com。*通信作者，吳坤，E-mail：wukun_15000@126.com

interactions between autophagy and ROS level in VES-treated cells.