刁非非 趙永峰 姜常青 韓鎧懌 謝之景

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水貂抗貂細(xì)小病毒中和抗體滴度的測(cè)定

刁非非①②趙永峰①②姜常青①②韓鎧懌①②謝之景①②*

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東泰安 271018 ②山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東泰安）

為了解當(dāng)前水貂病毒性腸炎疫苗及免疫程序的在水貂的免疫效果，該研究在6個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)對(duì)MEV疫苗免疫接種后55~60d的水貂進(jìn)行心臟采血，共采集、制備84份血清。采用血清微量中和試驗(yàn)，測(cè)定84份水貂血清中抗MEV的中和抗體滴度。結(jié)果表明，抗MEV中和抗體滴度大于10的共10份血清，僅占11.9%，其中1份效價(jià)為56，1份效價(jià)為28，1份效價(jià)為21，6份效價(jià)為14，1份效價(jià)為12，其余74份水貂血清中的抗MEV中和抗體滴度均小于10，達(dá)88.1%。當(dāng)前水貂MEV疫苗免疫程序的免疫效果很差，是造成在水貂養(yǎng)殖過程中MEV流行的重要因素，因此有必要加強(qiáng)研究制定科學(xué)水貂MEV疫苗免疫接種程序。

水貂 貂細(xì)小病毒 中和抗體

水貂病毒性腸炎(Mink viral enteritis)又稱貂泛白細(xì)胞減少癥(Mink panleucopenia)或貂傳染性腸炎(Mink infectious enteritis)是由貂腸炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)，又稱貂細(xì)小病毒(Mink parvovirus)，感染引起的一種急性傳染病，主要特征為急性出血性腸炎和白細(xì)胞減少[1-5]。本病多發(fā)生于貂，各種品種和不同年齡的貂都有易感性，但以當(dāng)年生水貂更易感，而50~60日齡的仔貂最為易感，發(fā)病率50%~60%。病貂的年齡越小病死率越高，最高可達(dá)90%。病貂、痊愈帶毒貂和患泛白細(xì)胞減少癥的貓是主要傳染源。它們從糞、尿、唾液中排毒，通過污染的飲水、飼料、飼具等，經(jīng)消化道和呼吸道傳染給易感健康貂。此外，鳥類、鼠類和昆蟲等也可成為傳播媒介。本病常呈地方流行性。一旦引入貂場(chǎng)，如沒有良好的獸醫(yī)防疫衛(wèi)生措施，常常導(dǎo)致長(zhǎng)期存在和周期性發(fā)生流行。潛伏期4~9d，病貂體溫升高到40~40.5℃。減食或拒食，但渴欲明顯增加。有的患病貂于12~24h迅速死亡；有的病貂發(fā)生急性腸炎，腹瀉，糞便稀軟，或呈水樣，顏色呈粉紅色、褐色、灰白色或綠色，糞便含有脫落的腸粘膜、粘液或血液。白細(xì)胞明顯減少，由正常的9500下降到5000以下。病貂可視黏膜蒼白，消瘦、虛弱、脫水，常常伸展四肢平臥，最后衰竭而死，或逐漸恢復(fù)健康，長(zhǎng)期帶毒，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。病死率因貂的品種和流行情況而異，一般10%~80%，高的可達(dá)90%以上。病程12h~14d不等。

所有養(yǎng)水貂的國(guó)家均有該病的發(fā)生，MEV疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了MEV的流行。山東省是我國(guó)水貂養(yǎng)殖第一大省，在省水貂養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)常有MEV感染的病例出現(xiàn)，給養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。造成免疫失敗的原因較多，但其確切原因尚不清楚，其中疫苗免疫效果不好是造成免疫失敗的一個(gè)重要原因。目前，有關(guān)MEV疫苗免疫接種的效果尚不清楚，為此該研究對(duì)水貂血清中抗MEV中和抗體滴度進(jìn)行了測(cè)定，為進(jìn)一步研究科學(xué)的水貂MEV疫苗接種程序提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

1 材料和方法

1.1 毒株與細(xì)胞 MEV-SD-1本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，CRFK細(xì)胞由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局胡傳偉研究員惠贈(zèng)。

1.2 血清樣品 在諸城、東平、文登三地6個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，這6個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)均對(duì)水貂進(jìn)行了1次MEV疫苗免疫接種，隨機(jī)對(duì)MEV疫苗免疫接種后55~60d的水貂進(jìn)行心臟采血，制備血清，共84份，置-20℃凍存，待檢。

1.3 中和抗體效價(jià)的測(cè)定 采用血清微量中和試驗(yàn)測(cè)定水貂血清抗MEV中和抗體效價(jià)。采用固定病毒—稀釋血清法[6]，在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行。首先將血清樣品置56℃水浴30min，滅活血清中非特異性病毒抑制成分，隨后將血清樣品中加入終濃度為0.025%恩諾沙星，10000ｒ/min離心10min，去除可能的細(xì)菌污染物。先將血清稀釋成1:10，再作2倍連續(xù)稀釋(共8個(gè)稀釋度)。隨后分別加入等量含100TCID50的病毒懸液。經(jīng)25℃、2h感作后，分別加入96孔板，每個(gè)稀釋度加4孔，每孔加100ul。然后將分散并稀釋成2.5~3.0×106個(gè)/ml的CRFK細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔加50μl，置5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃，60%~80%濕度)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)血清毒性對(duì)照，陰陽性血清對(duì)照，病毒對(duì)照及正常細(xì)胞對(duì)照。4d判定結(jié)果，以每孔完全不出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、破碎、脫落的細(xì)胞病變作為中和陽性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)中和陽性的血清最高稀釋滴度為中和終點(diǎn)，按Reed-Muench法計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)，以其倒數(shù)作為水貂血清中抗MEV中和抗體滴度。

2 結(jié)果

在84份水貂血清中，抗MEV中和抗體滴度大于10的共10份血清，僅占11.9%，其中1份效價(jià)為56，1份效價(jià)為28，1份效價(jià)為21，6份效價(jià)為14，1份效價(jià)為12，其余74份水貂血清中的抗MEV中和抗體滴度均小于10，達(dá)88.1%，見附表。這表明水貂血清中抗MEV的中和抗體滴度很低，水貂養(yǎng)殖企業(yè)所采用的MEV免疫程序不合理，不能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生很好的抗體水平。

附表 水貂抗MEV中和抗體滴度 （%）

地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)只數(shù)滴度<10 滴度>10只數(shù) 只數(shù)比例只數(shù)比例 諸城1131292.31(56)7.7 2171588.22(14,12)11.8 3171694.11(21)5.9 東平11512803(14)20 2121083.32(14)16.7 文登1109901(28)10 合計(jì)6847488.11011.9

3 討論

（1）山東省是水貂養(yǎng)殖大省，盡管MEV疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制MEV在水貂的流行，但是近年來，在實(shí)際生產(chǎn)過程中仍有許多MEV感染的水貂病例，給本省水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫程序不合理是造成免疫失敗的重要原因，但其確切原因尚不清楚。但是疫苗免疫效果不好是造成免疫失敗的一個(gè)重要原因。中和抗體是抗病毒免疫的主要因素,也是疫苗免疫效果的重要檢測(cè)指標(biāo)之一?？筂EV中和抗體對(duì)于水貂抵抗MEV的感染是十分重要的。為了了解水貂MEV疫苗的免疫效果，該研究對(duì)水貂血清中的抗MEV的中和抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)。（2）在84份水貂血清中，有74份水貂血清中的抗MEV中和抗體滴度均小于10，高達(dá)88.1%，只有10份水貂血清中抗MEV中和抗體滴度大于10，僅占11.9%。這表明水貂養(yǎng)殖企業(yè)所采用的MEV免疫程序不合理，不能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生很好的抗體水平，這是造成MEV流行的重要因素。為此，應(yīng)加強(qiáng)水貂MEV疫苗免疫程序的研究，減少因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。

[1] Sun JZ, Wang J, Wang S, Yuan D, Birame BM, Li Z, Yi B, Liu W. MicroRNA profile analysis of a feline kidney cell line before and after infection with minkenteritis virus. Gene. 2014, 539(2): 224-9.

[2] Zuo J, Rao J, Xu H, Ma L, Li B, Wang Y, Cai X, Han W, Lei L, Liu B. Analysis of the vp2 gene sequence of a new mutated mink enteritis parvovirus strain in PR China. Virol J. 2010.7:124.

[3] Park GS, Best SM, Bloom ME. Two mink parvoviruses use different cellular receptors for entry into CRFK cells. Virology. 2005, 340(1):1-9.

[4] Uttenthal A, Lund E, Hansen M.Mink enteritis parvovirus. Stability of virus kept under outdoor conditions. APMIS. 1999, 107(3):353-8.

[5] Zhang DL. Studies on isolation, serum-free cultivation and manufacture of mink enteritis virus optimized for vaccine preparation. Biologicals. 1997, 25(1): 103-11.

[6] 扈榮良. 現(xiàn)代動(dòng)物病毒學(xué)第1版[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 2014 (12).

（2016–05–18）

S852.65+9.2

A

1007-1733(2016)09-0001-02

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-21-07）。