楊 楊，郭 健，李長(zhǎng)田

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118）

基于核糖體基因的灰樹(shù)花分子系統(tǒng)關(guān)系分析*

楊 楊，郭 健，李長(zhǎng)田**

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118）

為探討灰樹(shù)花的分子系統(tǒng)關(guān)系，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得灰樹(shù)花（Grifola frondosa)18S rDNA、ITS rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析灰樹(shù)花屬級(jí)的親緣關(guān)系，以及不同地域灰樹(shù)花菌的種內(nèi)遺傳多樣性。結(jié)果表明，灰樹(shù)花起源于多孔菌科，ITS rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以把來(lái)自亞洲和美國(guó)的菌株區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明灰樹(shù)花的地理距離和遺傳距離存在一定的相關(guān)性，且灰樹(shù)花可能為復(fù)合種群。

18S rDNA；ITS rDNA；系統(tǒng)發(fā)育；遺傳多樣性

灰樹(shù)花 [Grifola frondosa(Dicks．Fr)S．F．Gray]，是一種重要的食（藥）用菌，其味道獨(dú)特鮮美且具有抗腫瘤、提高免疫力、降血壓及抗病毒等多種藥用價(jià)值?；覙?shù)花是木質(zhì)腐生菌類(lèi)，主要生長(zhǎng)在栗樹(shù)根部周?chē)鶾1]，廣泛分布于世界各地，如北美、日本、俄羅斯，中國(guó)的河北、長(zhǎng)白山地區(qū)、浙江、廣西、福建、四川、云南和西藏等地[2]。

依據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，第十版《真菌字典》對(duì)多個(gè)真菌分類(lèi)系統(tǒng)做出了調(diào)整，其中灰樹(shù)花隸屬于擔(dān)子菌門(mén) （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 多孔菌目（Polyporales） 亞灰樹(shù)花菌科（Meripilaceae）樹(shù)花屬（Grifola）[3]。而在此之前，樹(shù)花菌屬被廣泛認(rèn)為屬于多孔菌科（Polyporaceae）[4－5]。目前，國(guó)內(nèi)外還未有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)灰樹(shù)花屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。

在真菌的分子系統(tǒng)發(fā)育研究中，核糖體基因是用于分子關(guān)系構(gòu)建的主要研究序列。其中，RNA編碼區(qū)（18S rRNA、5．8S rRNA、28S rRNA） 高度保守，多用于高級(jí)階元間的比較；而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)化速度最快，可用于區(qū)分種間及種內(nèi)變異[6]。本研究在構(gòu)建灰樹(shù)花核糖體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基礎(chǔ)上，比較分析灰樹(shù)花種屬關(guān)系，為研究灰樹(shù)花屬的系統(tǒng)關(guān)系與遺傳多樣性提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源

本研究收集了全國(guó)各地以及來(lái)自日本和美國(guó)的共計(jì)26個(gè)灰樹(shù)花菌株，見(jiàn)表1。

表1　灰樹(shù)花菌株來(lái)源及編號(hào)Tab.1　Numbers and sources of Grifola frondosa

1.2總DNA的提取及PCR擴(kuò)增

采用試劑盒（TakaraTM Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0） 法提取灰樹(shù)花基因組DNA，選用引物ITS1和ITS4[7]、NS1和NS4[8]擴(kuò)增灰樹(shù)花ITS rDNA、18S rDNA序列。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，DNA模板3 μL，ddH2O補(bǔ)充至50 μL。

擴(kuò)增條件：94℃反應(yīng)5 min；94℃反應(yīng) 30 s，50℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)50 s，循環(huán)35次；72℃反應(yīng)10 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用Clustal X 1.83比對(duì)序列，人工檢查校對(duì)。使用 MEGA 6.06軟件構(gòu)建灰樹(shù)花與其相似屬的18S rDNA ML（最大似然法）和ITS rDNA NJ（鄰位相連法）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，使用jModelTest 2.1.7作為最適替代模型[9]，選擇GTR+I+G作為最佳進(jìn)化模型，Bootstrap自展值分析檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次，見(jiàn)表2、表3。

表2　本研究選用的18S rDNA序列Tab.2　18S rDNA sequences using in the study

2　結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增獲得的灰樹(shù)花18S rDNA基因序列長(zhǎng)度為534 bp（GenBank登錄號(hào)KX098283），與GenBank注冊(cè)序列比對(duì)，平均長(zhǎng)度533 bp，保守位點(diǎn)72個(gè)，變異位點(diǎn)444個(gè)，18S rDNA的G+C平均含量為44.9%。ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1，灰樹(shù)花ITS rDNA序列NJ親緣關(guān)系樹(shù)見(jiàn)圖2。

在ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中（圖1），亞灰樹(shù)花科與來(lái)自多孔菌科的真菌形成了3個(gè)獨(dú)立分支，分支一包括灰樹(shù)花屬、亞灰樹(shù)花菌屬（Meripilus）、Rigidoporus、蜂窩菌屬（Hexagonia）、小孔菌屬（Microporus）和Abortiporus；分支二包括Physisporinus與多孔菌屬（Polyporus），且具有較高的bootstrap支持；Abundisporus單獨(dú)形成一個(gè)分支。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)與灰樹(shù)花菌屬親緣關(guān)系相近的真菌多具有菌蓋平展、孢子透明平滑的相似形態(tài)特征[10]。

表3　灰樹(shù)花ITS rDNA序列Tab．3　ITS rDNA sequences of Grifola frondosa

圖2　灰樹(shù)花ITS rDNA序列NJ親緣關(guān)系樹(shù)Fig．2　NJ phylogenetic tree of Grifola frondosa based on ITS rDNA

本實(shí)驗(yàn)獲得的灰樹(shù)花ITS序列長(zhǎng)度534 bp～544 bp（GenBank登錄號(hào)：KX094522～KX094547），與GenBank注冊(cè)序列比對(duì)，平均長(zhǎng)度543 bp，保守位點(diǎn)315個(gè)，變異位點(diǎn) 208個(gè)，G＋C平均含量為51．4%。從ITS rDNA構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）來(lái)看，來(lái)自美國(guó)的灰樹(shù)花菌株H5和同樣來(lái)自美國(guó)的菌株AY049127、AY049124位于同一分支中；來(lái)自慶元的菌株 H29與來(lái)自美國(guó)的菌株 AY049102、AY049104、AY049098、AY049137、AY049099位于同一分支；菌株H20和菌株H32在較高的支持下形成姐妹群，雖然來(lái)源地點(diǎn)不同，但在該分支中有較高的bootstrap支持。本實(shí)驗(yàn)收集的其他菌株來(lái)自日本和中國(guó)，與Genbank上找到的來(lái)自亞洲的菌株均在同一分支上。

3　結(jié)論與討論

在18S系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，來(lái)自10個(gè)屬的物種形成了3個(gè)獨(dú)立分支，單系群Abundisporus[11]位于單獨(dú)分支；隸屬于亞灰樹(shù)花菌科、多孔菌科、皺孔菌科和紅褐?jǐn)M層菌科（2個(gè)科曾隸屬于多孔菌科[12]）的7個(gè)屬8個(gè)物種位于分枝一中；分支二由亞灰樹(shù)花菌科的Physisporinus和多孔菌科的多孔菌屬構(gòu)成?？梢?jiàn)，亞灰樹(shù)花菌科和多孔菌科在分枝一和分支二上均有分布，且在形態(tài)上具一定相似特征。從18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，亞灰樹(shù)花科起源于多孔菌科，并未與多孔菌科具有明顯的系統(tǒng)發(fā)育分歧，而多孔菌科是一個(gè)具有多元形態(tài)的類(lèi)群[13]，其內(nèi)部種屬具有復(fù)雜的親緣關(guān)系，應(yīng)采用多基因比對(duì)，進(jìn)一步劃分該類(lèi)群。

對(duì)于灰樹(shù)花的種內(nèi)分子關(guān)系，本研究的ITS序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果與Shen[14]的結(jié)果一致，來(lái)自美國(guó)的菌株H5同其他來(lái)自美國(guó)的菌株構(gòu)成單獨(dú)分枝，與其余來(lái)自亞洲的菌株區(qū)分開(kāi)，因此，灰樹(shù)花可能為復(fù)合種群?；覙?shù)花的地理距離和遺傳距離存在一定的相關(guān)性，來(lái)自同一地域的大部分灰樹(shù)花聚在相同或相近的分枝。而由于真菌具有孢子傳播的特性，對(duì)于此兩大來(lái)源的灰樹(shù)花菌株間的遺傳距離分析還應(yīng)參考更多的其他來(lái)源菌株。

綜上所述，對(duì)于灰樹(shù)花的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究還需了解更多地理區(qū)域的基因數(shù)據(jù)，從表型到DNA分子水平多層次的綜合研究。

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《中國(guó)食用菌》聲明

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中國(guó)食用菌雜志編輯部2016年11月10日

Molecular Phylogenetic Relationships of Grifola frondosa Based on Ribosomal Genes

YANG Yang,GUO Jian,LI Chang-tian
(Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi，Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China)

The molecular phylogenetic relationships of Grifola frondosa were analysed by phylogenetic trees which were obtained by 18S rDNA and ITS rDNA sequences amplificated using PCR．The results suggested that G.frondosa originated from Polyporaceae,and the phylogenetic tree based on ITS rDNA could isolate the strains form Asia and the United States．G.frondosa may be composite groups,and there is a certain correlation between the geographical distance and genetic distance．

18S rDNA;ITS rDNA;phylogeny;genetic diversity

S646.9

A

1003-8310（2016）06-0042-04

10．13629/j．cnki．53－1054．2016．06．010

“十二·五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2013BAD16B05）；吉林省財(cái)政廳科研育種項(xiàng)目（201305）。

楊楊（1991－），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)榫锷鷳B(tài)學(xué)。E－mail:keirayang02＠gmail．com

**通信作者：李長(zhǎng)田（1970－），男，博士，教授，主要從事食用菌栽培研究。E－mail:changtianli＠126．com

2016－09－20