楊 楊，郭 健，李長田

（吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

基于核糖體基因的灰樹花分子系統(tǒng)關系分析*

楊 楊，郭 健，李長田**

（吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

為探討灰樹花的分子系統(tǒng)關系，通過PCR擴增獲得灰樹花（Grifola frondosa)18S rDNA、ITS rDNA序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析灰樹花屬級的親緣關系，以及不同地域灰樹花菌的種內(nèi)遺傳多樣性。結果表明，灰樹花起源于多孔菌科，ITS rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以把來自亞洲和美國的菌株區(qū)分開，說明灰樹花的地理距離和遺傳距離存在一定的相關性，且灰樹花可能為復合種群。

18S rDNA；ITS rDNA；系統(tǒng)發(fā)育；遺傳多樣性

灰樹花 [Grifola frondosa(Dicks．Fr)S．F．Gray]，是一種重要的食（藥）用菌，其味道獨特鮮美且具有抗腫瘤、提高免疫力、降血壓及抗病毒等多種藥用價值?；覙浠ㄊ悄举|(zhì)腐生菌類，主要生長在栗樹根部周圍[1]，廣泛分布于世界各地，如北美、日本、俄羅斯，中國的河北、長白山地區(qū)、浙江、廣西、福建、四川、云南和西藏等地[2]。

依據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育關系，第十版《真菌字典》對多個真菌分類系統(tǒng)做出了調(diào)整，其中灰樹花隸屬于擔子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 多孔菌目（Polyporales） 亞灰樹花菌科（Meripilaceae）樹花屬（Grifola）[3]。而在此之前，樹花菌屬被廣泛認為屬于多孔菌科（Polyporaceae）[4－5]。目前，國內(nèi)外還未有文獻報道過灰樹花屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。

在真菌的分子系統(tǒng)發(fā)育研究中，核糖體基因是用于分子關系構建的主要研究序列。其中，RNA編碼區(qū)（18S rRNA、5．8S rRNA、28S rRNA） 高度保守，多用于高級階元間的比較；而內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）進化速度最快，可用于區(qū)分種間及種內(nèi)變異[6]。本研究在構建灰樹花核糖體系統(tǒng)發(fā)育樹基礎上，比較分析灰樹花種屬關系，為研究灰樹花屬的系統(tǒng)關系與遺傳多樣性提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來源

本研究收集了全國各地以及來自日本和美國的共計26個灰樹花菌株，見表1。

表1　灰樹花菌株來源及編號Tab.1　Numbers and sources of Grifola frondosa

1.2總DNA的提取及PCR擴增

采用試劑盒（TakaraTM Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0） 法提取灰樹花基因組DNA，選用引物ITS1和ITS4[7]、NS1和NS4[8]擴增灰樹花ITS rDNA、18S rDNA序列。

PCR反應體系（50 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，DNA模板3 μL，ddH2O補充至50 μL。

擴增條件：94℃反應5 min；94℃反應 30 s，50℃反應30 s，72℃反應50 s，循環(huán)35次；72℃反應10 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，由上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

使用Clustal X 1.83比對序列，人工檢查校對。使用 MEGA 6.06軟件構建灰樹花與其相似屬的18S rDNA ML（最大似然法）和ITS rDNA NJ（鄰位相連法）系統(tǒng)發(fā)育樹，使用jModelTest 2.1.7作為最適替代模型[9]，選擇GTR+I+G作為最佳進化模型，Bootstrap自展值分析檢驗，重復1 000次，見表2、表3。

表2　本研究選用的18S rDNA序列Tab.2　18S rDNA sequences using in the study

2　結果與分析

本實驗PCR擴增獲得的灰樹花18S rDNA基因序列長度為534 bp（GenBank登錄號KX098283），與GenBank注冊序列比對，平均長度533 bp，保守位點72個，變異位點444個，18S rDNA的G+C平均含量為44.9%。ML系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，灰樹花ITS rDNA序列NJ親緣關系樹見圖2。

在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖1），亞灰樹花科與來自多孔菌科的真菌形成了3個獨立分支，分支一包括灰樹花屬、亞灰樹花菌屬（Meripilus）、Rigidoporus、蜂窩菌屬（Hexagonia）、小孔菌屬（Microporus）和Abortiporus；分支二包括Physisporinus與多孔菌屬（Polyporus），且具有較高的bootstrap支持；Abundisporus單獨形成一個分支。結合子實體形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)與灰樹花菌屬親緣關系相近的真菌多具有菌蓋平展、孢子透明平滑的相似形態(tài)特征[10]。

表3　灰樹花ITS rDNA序列Tab．3　ITS rDNA sequences of Grifola frondosa

圖2　灰樹花ITS rDNA序列NJ親緣關系樹Fig．2　NJ phylogenetic tree of Grifola frondosa based on ITS rDNA

本實驗獲得的灰樹花ITS序列長度534 bp～544 bp（GenBank登錄號：KX094522～KX094547），與GenBank注冊序列比對，平均長度543 bp，保守位點315個，變異位點 208個，G＋C平均含量為51．4%。從ITS rDNA構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）來看，來自美國的灰樹花菌株H5和同樣來自美國的菌株AY049127、AY049124位于同一分支中；來自慶元的菌株 H29與來自美國的菌株 AY049102、AY049104、AY049098、AY049137、AY049099位于同一分支；菌株H20和菌株H32在較高的支持下形成姐妹群，雖然來源地點不同，但在該分支中有較高的bootstrap支持。本實驗收集的其他菌株來自日本和中國，與Genbank上找到的來自亞洲的菌株均在同一分支上。

3　結論與討論

在18S系統(tǒng)進化樹中，來自10個屬的物種形成了3個獨立分支，單系群Abundisporus[11]位于單獨分支；隸屬于亞灰樹花菌科、多孔菌科、皺孔菌科和紅褐擬層菌科（2個科曾隸屬于多孔菌科[12]）的7個屬8個物種位于分枝一中；分支二由亞灰樹花菌科的Physisporinus和多孔菌科的多孔菌屬構成。可見，亞灰樹花菌科和多孔菌科在分枝一和分支二上均有分布，且在形態(tài)上具一定相似特征。從18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹看，亞灰樹花科起源于多孔菌科，并未與多孔菌科具有明顯的系統(tǒng)發(fā)育分歧，而多孔菌科是一個具有多元形態(tài)的類群[13]，其內(nèi)部種屬具有復雜的親緣關系，應采用多基因比對，進一步劃分該類群。

對于灰樹花的種內(nèi)分子關系，本研究的ITS序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的結果與Shen[14]的結果一致，來自美國的菌株H5同其他來自美國的菌株構成單獨分枝，與其余來自亞洲的菌株區(qū)分開，因此，灰樹花可能為復合種群。灰樹花的地理距離和遺傳距離存在一定的相關性，來自同一地域的大部分灰樹花聚在相同或相近的分枝。而由于真菌具有孢子傳播的特性，對于此兩大來源的灰樹花菌株間的遺傳距離分析還應參考更多的其他來源菌株。

綜上所述，對于灰樹花的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究還需了解更多地理區(qū)域的基因數(shù)據(jù)，從表型到DNA分子水平多層次的綜合研究。

[1]紀天保.灰樹花生態(tài)環(huán)境考察[J].中國食用菌，1995（1）：37.

[2]林章余，何錦星，林文忠.灰樹花研究綜述[J].福建農(nóng)業(yè)科技，1994（6）：29-30.

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[9]Posada D.jModel test:phylogenetic model averaging[J]. Molecular Biology&Evolution,2008,25(7):1253-1256.

[10]趙繼鼎，張小青，許連旺.中國真菌志·第三卷·多孔菌科[M].北京：科學出版社，1998

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中國食用菌雜志編輯部2016年11月10日

Molecular Phylogenetic Relationships of Grifola frondosa Based on Ribosomal Genes

YANG Yang,GUO Jian,LI Chang-tian
(Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi，Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China)

The molecular phylogenetic relationships of Grifola frondosa were analysed by phylogenetic trees which were obtained by 18S rDNA and ITS rDNA sequences amplificated using PCR．The results suggested that G.frondosa originated from Polyporaceae,and the phylogenetic tree based on ITS rDNA could isolate the strains form Asia and the United States．G.frondosa may be composite groups,and there is a certain correlation between the geographical distance and genetic distance．

18S rDNA;ITS rDNA;phylogeny;genetic diversity

S646.9

A

1003-8310（2016）06-0042-04

10．13629/j．cnki．53－1054．2016．06．010

“十二·五”國家科技支撐計劃課題（2013BAD16B05）；吉林省財政廳科研育種項目（201305）。

楊楊（1991－），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為菌物生態(tài)學。E－mail:keirayang02＠gmail．com

**通信作者：李長田（1970－），男，博士，教授，主要從事食用菌栽培研究。E－mail:changtianli＠126．com

2016－09－20